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文档简介
1、PFGE 标 准 方 法第一天一、 胶块的制备1、在 Falcon 2054管上标记样品名称和空白对照,分别加入约 2ml 细胞悬 浊液( CSB);2、在 eppendorf 管上标记好对应样品的名称;3、在模具上标记好对应样品的名称;4、用 CSB湿润接种环,从培养皿上刮取适量细菌,均匀悬浊于CSB中,用 bioMerieux Vitek colorimeter 测其 OD值,并调整至 。如果 OD值大于,加 入 CSB稀释;如果 OD值小于,增加菌量提高其浓度。 OD是 optical density (光密 度)的缩写,表示被检测物吸收掉的光密度,是检测方法里的专有名词,检测单位用OD
2、值表示, 1OD 1og(1 trans ),其中 trans 为检测物的透光值。光通过被检测物,前后的能 量差异即是被检测物吸收掉的能量, 特定波长下, 同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成 定量关系。5、取 400l 细菌悬浊液于相应的 eppendorf 管中,置于 37水浴中孵 育 5 分钟。将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备好放在水浴摇床 中。6、从水浴箱中取出 eppendorf 管,每管加入 20l 蛋白酶 K(Merk 公司 )(储 存液浓度为 20mg/ml)混匀,使其终浓度为 ml。制备好 1%Seakem Gold(Bio-RAD, 伯乐公司 ) :1%SD(S十二烷
3、基硫酸钠) ,放于 56水浴箱 中。SeaKemG old 琼脂糖是一种高凝胶强度,低 EEO,标准胶凝温度的琼脂糖。这种遗传学 术级别( Genetic Technology Grade, GTG)琼脂糖最适于脉冲场凝胶电泳法( pulsed field gel electrophoresis ,PFGE)快速分辨 Mb(megabase) 50kb-10Mb) DNA和常规电泳方法 分辨 1-50kb 的 DNA与 PCR产物。因其低 EEO(电内渗)特性, SeaKem Gold 琼脂糖中的 DNA 电泳迁移速度要显著的高于常规琼脂糖凝胶。 PFGE的跑胶时间依使用的缓冲液和琼脂糖浓度
4、的不同可减少至原电泳时间的 50%。因其高凝胶强度, 即使是使用低浓度 ( %)的 SeaKemG old琼脂糖凝胶, 操作处理依然很方便, 从而允许在常规电泳中分离更大的 DNA片断并减少 PFGE中的 DNA分离的耗时1、在 eppendorf 管中加入 400l 的 1%S eakemG old: 1%SD,S 用枪头轻 轻混匀。 (SK=1g琼脂+90mlTE+10ml 10SDS)2、将混合物加入模具,避免气泡产生,在室温下凝固 10-15 分钟。 注意事项:(1)用后的接种环要放在指定的废弃物容器中。(2)细胞悬浊液、蛋白酶 K 要置于冰上。(3)在混合细胞悬浊液和 1% Seak
5、em Gold:1%SDS时要避免气泡 的产生。(4)混合物加入模具时不能产生气泡。(5)在加 1%S eakemG old:1%SDS的过程中 1%S eakemG old:1%SDS 要一直放在 56水浴箱中。细胞的裂解1、在 50ml 的 screw-cap tube 上做好标记。2、配制细胞裂解液( CLB):每 5ml 细胞裂解液加入 25 l 蛋白酶 K( 20mg/ml),使其终浓度为 ml,然后颠倒混匀。注意:蛋白酶 K 要置于冰上,配制好的细胞 CLB也要置于冰上。3、每个管子加入 5ml 蛋白酶 K/CLB混合液。4、如果想使胶块平齐,可以用刀片削去模具表面多余的部分。(
6、1) 可重复利用的模具: 打开模具, 用小铲的宽头部分将胶块移 入相应的 screw-cap 管中。(2) 一次性模具: 撕掉模具下面的胶带, 用小铲将胶块捅进相应的 screw-cap 管中,将模具、胶带、小铲放入废弃物容器中。5、保证胶块在液面下而不在管壁上。6、将管子放在 54水浴摇床中孵育 2 小时,转速约 170 转/ 分钟。7、 将纯水和 TE(缓冲液 tris-HCL 和 EDTA) 放在 50水浴摇床中预热。三、洗胶块 (为何要反复洗胶块)1、从水浴摇床中拿出 screw-cap 管,盖上绿色的 screened-cap ( 伯乐公 司) 。轻轻倒掉 CLB。在实验台上轻磕管底
7、使胶块落在管底。注意:把管倒置在吸水纸上,使管内液体被尽量排除干净 。随后的操作中也如 此。2、每管中加入 15ml 预热的纯水。3、确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上,放回 50水浴摇床中,摇 10 分钟。4、倒掉水,用纯水再洗一次。 、5、倒掉水,加入 15ml预热的 TE,在 50的水浴摇床中摇 15分钟。6、倒掉 TE,用 TE重复洗三次,每次 1015 分钟。7、倒掉 TE,加入 10ml TE,放在 4冰箱保存备用。 注意:要确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上。四、胶块内 DNA的酶切1、在 eppendorf 管上标记好相应的样品及 H9812的名称。2、 按照下面的比例配制缓冲
8、液 H的稀释液,混匀。试剂l/ 胶块l /10 胶块纯水180l1800lBuffer D20l200l总体积200l2000l注意:缓冲液要置于冰上。3、在每个 eppendorf 管中加入 200l 缓冲液 H 的稀释液。4、小心从 TE中取出胶块放在干净的培养皿上。5、用刀片切下 2mm宽的胶块放入 eppendorf 管中。确保胶块在液面下面。将剩余的胶块放回原来的 TE中6、用同样的方法处理标准株 H9812的胶块。7、将管子放在 37水浴中孵育 10-15 分钟。8、在用稀释缓冲液孵育的过程中, 按照以下的比例配制酶切缓冲液, 混匀试剂l/ 胶块l /10 胶块纯水175l1750
9、lBuffer D20l200l酶(10U/l )5l50l总体积200l2000l(1) 将酶置于冰上,用后立即放在 20保存。(2) 用枪头吸出缓冲液 H,避免损伤胶块。9、每管加入 200l 混合液,轻轻在实验台上磕管子的底部,确保胶块在 液面的下面。10、在 37水浴中孵育 至少 2 小时。五、加样(一) 将胶块直接粘在梳子齿上1、调整梳子的高度,使 梳子齿与胶槽的底面相接触。 用水平仪调整胶槽使 其水平。2、从 37水浴中取出胶块,平衡到室温。3、用枪头吸出酶切混合液,避免损伤或吸出胶块。4、 每管加入 200l TBE(Tris 硼酸缓冲液) 。5、 把梳子平放在胶槽上,把胶块加在
10、梳子齿上。如果用的是 10 个齿的梳 子,把标准菌株 H9812加在第 1、5、10 个齿上。6、 用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体,在室温下风干约3 分钟。7、把梳子放入胶槽,确保所有的胶块在一条线上 ,并且 胶块与胶槽的底面 相接触 。从胶槽的下部中央缓慢到入 100ml 熔化的在 5560平衡的1SKG。避免气泡的生成; 如果有,用枪头消除 。在室温下凝固 30 分 钟左右。8、记录加样顺序。(二)将胶块直接加在加样孔内1、调整梳子的高度,使 梳子齿与胶槽的底面有一定间距 。用水平仪调整胶 槽使其水平。2、把梳子放入胶槽, 从胶槽的 中央缓慢倒入 100ml熔化的在 55 60平 衡
11、的 1SKG。避免气泡的生成;如果有,用枪头消除。在室温下凝固 30 分钟左右。3、小心拔出梳子。4、从 37水浴中取出胶块,平衡到室温。5、用枪头吸出酶切混合液,避免损伤或吸出胶块。6、每块胶加入 200l TBE平衡。7、用小铲将胶块加入加样孔。8、用溶化的胶封闭加样孔。a) 可以在加样孔中加入 TBE,利用毛细作用将胶块沉在加样孔底,尽 量避免气泡形成。b) 记录加样顺序。六、电泳1、确保电泳槽是水平的。如果不水平,调整槽底部的旋钮。注意:不要触碰电极。 (CHEF-DR111)2、加入 2.2L TBE,关上盖子。3、打开主机和泵的开关, 确保泵设在 70(这时缓冲液的流速约 1L/
12、分钟) 和缓冲液在管道中正常循环。4、打开冷凝机,确保预设温度在 14(缓冲液达到该温度通常需要 20 分 钟左右)。5、打开胶槽的旋钮,取出凝固好的胶,用吸水纸清除胶四周和底面多余的 胶,小心的把胶放入电泳槽,关上盖子。6、设置电泳参数。7、记录电泳 初始电流(通常 120145ma)。8、结束电泳:关机顺序为:冷凝机泵主机。第二天七、图像的获取1、取出胶,放在盛放 400ml EB溶液的托盘内( EB储存液浓度为 10mg/ml,1:10,000 稀释,即在 400ml 水中加入 40l 储存液)。EB是致畸剂 。储存在棕色瓶中的 EB稀释液可以用 3-5 次。废弃的 EB 溶液应妥善处理
13、。2、将托盘放在摇床上摇 25-30 分钟。3、放掉电泳槽中的 TBE,用 1-2L 纯水清洗电泳槽,并倒掉液体。4、戴上手套 将用后的 EB溶液小心倒入做有标记的棕色瓶中,在托盘中加 入 400-500ml 纯水,放在摇床上脱色 60-90 分钟,如果可能每 20-30 分 钟换一次纯水。5、用 Gel Doc 2000 拍摄图像。 注意:如果背景干扰分析,可进一步脱色 30-60 分钟。6、转换成 *.1sc 文件用于处理分析。八、数据的分析图像的读取 电泳图像通常用 BIO-RAD的 GEL DOC 2000或其它成像系统来获取。其它可以替 代的成像设备,只要具有 CCD相机,可以提供
14、IBM 兼容的未压缩的 TIFF 图像, 且分辨力 768 x 640 像素,能够用 BioNumerics software (Applied Maths, Inc.) 软件与 PulseNet 数据库中其它图像进行对比分析,也可以运用。运用 GEL DOC 2000的简单说明:QUANTITY ON软E 件1、点击 QUANTITY ON按E 钮打开该软件。2、点击菜单 FILE GEL DO。C 注意:需要 1020 秒打开窗口。3、打开抽屉,把胶放在台板上。胶已经经过 EB或 GEL-STAR染色并经过充分 脱色。用黑色胶框把胶放在合适的位置。关上抽屉门。图像的获取1、按下 EPI-L
15、IGHT 按钮打开白光。2、把胶放在调准网格线内, 使胶的加样孔和调准网格线的最上面一条蓝线对 齐。3、保证调准网格线和过饱和按钮 被选中。4、改变镜头的 MIDDLE RING以调整图像的大(顺时针)小(逆时针) ,使图 像占据整个窗口。如果需要,挪动胶在台板上的位置。胶的加样孔、下边 界和左右边界在屏幕上都应该可以看到。5、如果需要,按 BOTTOM RIN以G调整相机的焦距。 注意:焦距的调整只可以偶尔用之, 不可用于每一块胶。 可以用尺子帮助调整焦 距。6、按下 EPI-LIGHT 关掉白光,按下 UV按钮打开透射紫外光。7、点击 AUTO EXPOS以E 确定大概的曝光时间。当图像出
16、现在窗口时, AUTO EXPOSE自动关闭而 MANUAL EXPOS被E激活。8、点击 MANUAEL XPOSE的按钮,调整曝光时间。而调整饱和度时,点击 箭头或 TURNT HET OPR ING以降低光量(如果图像过饱和, 图像显现红色)。 注意:如果出现对话框“曝光可以在 360 秒之间波动”,则需通过改变相机的 像素以调整饱和度。调整饱和度使样品条带没有红色很重要,因为这会影响 BIONUMERIC软S件对胶图像的分析。而胶加样孔的过饱和属于正常现象。9、当图像调整的比较满意时, 按下 FREEZE按钮停止曝光过程。 按下 UV按钮 关掉紫外光(如果开门时 UV灯打开,它会自动关
17、闭) 。图像的输出1、保存图像( *.1sc ):FILE SAVE。确保选择正确的路径。文件默认的名字 包括日期、时间和用户。可以改变文件名。2、打印文件: FILE PRINTVIDEOP RINT,也可以直接点击屏幕上的 PRINT 按钮。3、转为*.TIFF 格式: FILEEXPOR TO TIFF IMAGEEXPOR,T选择正确的 路径。4、关闭 QUANTITY ON程E 序: FILEEXIT。5、取出胶放在染色盒内。用软麻布擦掉台板表面多余的液体,用水或70的异丙醇洗干净。试剂储存液的配制1、1 M Tris HCl, pH *121.1 g Tris base 溶于 65
18、0-700 ml 纯水中,加入 80 ml 6 N HCl*, 在室温下调 pH至,加水终体积至 1000 ml ,高压灭菌。或者 157.6 g Tris-HCl 溶于 800 ml 纯水中,在室温下调 pH至, 加水终体积至 1000 ml ,高压灭菌。2、10 N NaOH*400 g NaOH小心溶于 800 ml 纯水中,冷却到室温,加灭菌的纯水 使终体积至 1000 ml 。3、0.5 M EDTA, pH *186.1 g Na 2EDTA 2H2O溶于 800 ml 纯水中,加入 50ml 10N NaOH调 pH至,加水终体积至 1000 ml ,分成数份,高压灭菌。4、20
19、%S odium Dodecyl Sulfate (SDS)* 十二烷基硫酸钠用于 E. coli O157:H7, Salmonella and Shigella sonnei , PFGE将 20 克 SDS小心加入装有 80 ml 灭菌纯水的容器中,在 35 - 45C 轻轻混匀溶解,定容至 100ml。5、20 mg/ml 蛋白酶 K储存液 *100 mg Proteinase K 粉末溶于 5 ml 灭菌纯水中,混匀,分装在 ml 离心管中,每管 500- 600 l , - 20C保存备用。6、10X Tris-Borate EDTA Buffer (TBE), pH*0.9 M
20、Tris base (108 g)0.9 M Boric Acid (55 g)0.02 M EDTA, pH (40 ml 0.5 M) 溶于 1000 ml 灭菌的纯水中,高压灭菌 注意:如果缓冲液有沉淀生成必须丢弃。7、Ethidium Bromide (EB) *10 mg/ml EB 的储存液用纯水 1:10,000 稀释(即 100 ml 水中加入 10 l 储存液 ) ,(500ml水中加 50ul )。稀释液在丢弃前可以染 5-6 块胶。实验试剂注意 :用灭菌的玻璃制品、塑料制品和纯水来制备以下试剂。1、Tris:EDTA Buffer (TE), pH *(10 mM Tri
21、s-HCL:1 mM EDTA, pH )10 ml 1 M Tris-HCL, pH2 ml 0.5 M EDTA, pH 用灭菌的纯水稀释到 1000 ml在 E. coli O157:H7, Salmonella and Shigella sonnei , and Campylobacter jejuni PFGE 用 TE Buffer 于: . 溶解 1% SeaKem Gold:1% SDS agarose . 细菌裂解后洗胶块在 L. monocytogenes PFGE 用 TE Buffer 于 :. 悬浮菌细胞 . 细菌裂解后洗胶块2、Cell Suspension Buf
22、fer (CSB)100 mM Tris-HCl:100 mM EDTA, pH用于 E. coli O157:H7, Salmonella , and Shigella sonnei PFGE10 ml 1 M Tris-HCl, pH20 ml 0.5 M EDTA, pH用灭菌的纯水稀释到 100 ml3 、 CellLysis Buffer ( CLB) 50 mM Tris-HCl:50 mM EDTA, pH + 1%N-Lauroyl-Sarcosine, Sodium salt (Sarcosyl), ml Proteinase K ( 用前再加入)用于裂解E. coli O1
23、57:H7, Salmonella , Shigella sonnei , 和 Campylobacterjejuni25 ml 1 M Tris-HCl, pH50 ml 0.5 M EDTA, pH350 ml 10% Sarcosyl 3用灭菌的纯水稀释到 500 ml,每 5 ml CLB加入 25l蛋白 酶 K 储存液 (20 mg/ml) ,使其终浓度为 mg/ml.5、 TBE Buffer200 ml 5X TBE 用纯水稀释到 2000 ml 或100 ml 10X TBE 用纯水稀释到 2000 ml注意:用来稀释 5X TBE、10X TBE的纯水可以不灭菌 6、SeaK
24、em Gold Agarose做胶块; 电泳胶 报价 seakem gold 琼脂糖 25g 货号 50111 , 1567 元人民币。可打 9 折。125g 货号 50150 , BMA, 6422 元。 北京基因公司 ;上海 ;广州 ; 天津 022 ;西安;成都 ;沈阳 济南 ;武汉 ;昆明 ;杭州 4 长沙 ;重庆 ;南京无菌的超纯水8、蛋白酶 K粉末或蛋白酶 K溶液( 20mg/ml) 6、限制性内切酶E. coli O157:H7, Salmonella , Shigella sonnei XbaI, ,AvrII ( 同切限制
25、内切酶 BlnI) ,SpeI(NotI 可用于 S. sonnei ;但不用于 E. coli O157:H7) L. monocytogenes , AscI, ApaI Campylobacter jejuni , C. coli , SmaI, KpnI 器材1、Dade Microscan Turbidity MeterSpectrophotometerbioMrieux Vitek Colorimeter 调整细胞悬浊液的浓度2、微波炉溶胶3、水浴摇床裂解胶块中的细胞 (54 C)用水和 TE(50 C)洗胶块4、56C水浴箱平衡和保温熔化的胶5、25C, 30 C, 37 C水浴
26、箱酶切6、50C水浴箱加热用于洗胶块的水和 TE,酶切7、离心机。8、最少需要两个水浴箱一个平衡到 56C,另一个到 37C。如果需要,温度 可以上下调动。 Listeria PFGE中胶块的 ApaI 酶切需 30C水浴。耗材1、无菌的 Falcon 2054 (12-mm x 75-mm)或 Falcon 2057 ( 17-mm x 100-mm) 用于细胞悬浊液的制备基因公司代理 ,2、无菌的聚酯纤维或棉签用于从琼脂平板上刮取细菌3、无菌的枪头或巴斯得吸管4、无菌的 ml 离心管用于混合细胞悬浊液和胶、酶切5、无菌的 50 ml screw-cap tubes 或 50 ml Oak
27、Ridge tubes 用于装胶块,6、Green Screened Caps ( Bio-Rad 1703711 )洗胶块时用 伯乐公司 货号 170-3711 。7、模具 10孔(可重复利用的, 2cm x 1cm x 1.5mm ) 50孔(一次性的, 1.5mm x 10mm x 5mm)8、单刃剃须刀、手术刀、平皿或类似物用于切胶块9、无菌的一次性皮氏平皿或大的玻璃载物片用于切胶块10、一端宽、一端窄的平铲 药铲,生工等公司的实验室耗材部分有。11、标准胶槽( 14 x 13cm 的框和平板)12、10孔的梳子( 14 cm 长,1.5 mm宽)13、15孔的梳子( 21 cm 长,1.5 mm宽) Bio-Rad 170-362714、胶水平台15、盛放 EB染液的塑料容器16、70异丙醇、 5%10%的漂白剂或其它合适的消毒剂17、各种体积的无菌烧瓶或瓶子( 50 ml - 2000 ml )
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