离子交换分离纯化蛋白原理总结

1、离子交换分离纯化蛋白原理及应用离子交换剂基质主要有树脂、纤维素、葡聚糖凝胶 、聚丙烯酰胺凝胶和硅胶（hplc）等离子交换树脂 一般只适合分离小分子物质如氨基酸等，不适合分离蛋白质等大分子物 质，一方面是因为大分子不易进入树脂紧密交联结构的内部，另一方面因为交联聚苯乙 烯骨架疏水性很强，用于蛋白质分离时，会出现疏水性的不可逆吸附。此外，离子交换 树脂的机械强度较差，而且树脂的体积常随着溶剂离子强度的变化发生溶胀和收缩。 根据交换基团的电荷性质进行分类：阳离子交换树脂：强酸型含磺酸基团(r-so3h)中等酸型含磷酸基团(-o-po2h4)弱酸型含酚基、羧基阴离子交换树脂：强碱含季胺基团-n+(ch

2、3)3弱碱含叔胺、伯胺基团-n(ch3)2阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离子交换树脂稳定。弱酸型只能在碱性 ph 范围内使用弱碱型只能在酸性 ph 范围内使用离子交换纤维素 的种类很多，可分为阴离子交换纤维素和阳离子交换纤维素两大类。 由于这些材料是纤维状的，大部分活性基团分布在表面，所以，适合于分离蛋白质等生 物大分子。阴离子交换纤维素 deae- 纤维素,具二乙胺乙基，阳离子交换纤维素cm- 纤维素,具有羧甲基，分别是应用得最广泛的阴离子交换纤维素和阳离子交换纤维素。 另外，根据纤维素颗粒的物理结构不同，可分为“纤维型”和“微晶型”两大类。“微 晶型”因颗粒细、比重大，能制成紧密的柱

3、，交换容量大，分辨率高。离子交换凝胶： 离子交换葡聚糖凝胶 和聚丙烯酰胺凝胶 具有许多优点，分离大分子物 质，不会引起被分离物质的变性戒失活，非特异性吸附很低；交换容量大(为离子交换 纤维素的 3-4 倍)；容易制成微球型，因此装柱和层析时的流速都较易控制。它的缺点 是随着洗脱液的离子强度和 ph 的变化，床体积变化大，明显影响流速;另外,由于它的 凝胶性质,有时会把大分子物质排阻在网络结构之外。如：葡聚糖（ sephadex）、聚丙烯酰胺（ pag）、琼脂糖（ sepharose ）平衡缓冲液： 它的离子强度和 ph 的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定。 其次是要使各个待分离物质与

4、离子交换剂有适当的结合。增强洗脱液与离子交换剂的结合力，降低分离物与离子交换剂的结合力洗脱缓冲液 ：在离子交换层析中一般常用梯度洗脱 ，通常有改变离子强度和改变 ph 两 种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换剂结 合的各个组分被洗脱下来；而改变 ph 的洗脱，对于阳离子交换剂一般是 ph 从低到高 洗脱，阴离子交换剂一般是 ph 从高到低 。由于 ph 可能对蛋白的稳定性有较大的影响， 故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。强酸性阳离子换剂 h+的结合力比对 na+的小；h 型 spsepharoseffnacl、naoh、nh4oh 、nh4cl 洗脱磷酸

5、缓冲液平衡弱酸性阳离子交换剂对 h+的结合力远比对 na+的大；na 型 cm-纤维素naoh 或 hclh+或 na+洗脱强碱性阴离子交换剂对 oh-的结合力比对 c1- 的小得多；oh 型弱碱性阴离子交换剂对 oh-的结合力比对 cl-的大。cl 型 deae-纤维素nacl、naoh、乙酸铵（nh4ac ）、磷酸根（po3-）洗脱 tris-hcl、磷酸盐缓冲液平衡。阴离子交换剂碱性碱性缓冲液酸性蛋白 蛋白 piph 时带负电阳离子交换剂碱性酸性缓冲液碱性蛋白 piph 时带正电deae-纤维阴离子交换剂纯化 分离酸性蛋白碱性缓冲液cm 纤维素阳离子 交换剂纯化 分离碱性蛋白 酸性缓冲液

6、 碱性越强，就越容易被阳离子交换剂吸附 蛋白在 ph58 稳定时，则应选择阴离子交换剂；蛋白在 ph5 以下稳定时，则可选择阳 离子交换剂。阴离子交换剂， ph8.6 以下分离中性或酸性物质 。阳离子交换剂，一般 ph4 条件下使 用，deae- 纤维素吸附酶和蛋白质时常用 ph 为 7 9，然后提高盐浓度或降低 ph 使之洗脱。cm纤维素常选在 ph4.5 6.0 左右吸附蛋白质，然后提高 ph 或盐浓度进行洗脱。例：用离子交换，那首先就要考虑是要阳离子还是阴离子，还有就是你的目的物的 ph 值 蛋白质是 pi=6.27 阴离子交换，用 ph8.0-9.0 的缓冲液首先利用缓冲液 ph 值把目的蛋白给结合到柱子上，然后用合适的盐离子洗脱下来。 阴离子交换柱：上样缓冲液 20mmtris-hcl，用 00.5mnacl 梯度洗脱，流速约 2ml/min。 注意：首先是蛋白的等电点是多少选择 ph 值，挂柱时 ph 尽量不要超过 pi 值的 2 个点。 nacl 的浓度可以设梯度，平衡时用 0.1mol 之后可以选择 0.30.6