HPLC测定小花清风藤中齐墩果酸的含量

1、HPLC测定小花清风藤中齐墩果酸的含量【摘要】目的：建立小花清风藤中齐墩果酸的含量测 定方法，为该药材控制种植、加工、应用提供的质量控制。方法：采用HPLC法，以甲醇-O.1mol/L乙酸铵(85 : 15)为流动相，在波长 210nm 处检测小花清风藤中齐墩果酸的含量。结果：齐墩果酸在 0.19891.2430mg/ml范围内呈良好的线 性关系(r=0.9991 , n=6);加样回收率为 95.6%, RSD为0.6 %。 结论：该方法简便、准确、灵敏、重复性较好，可用于小花 清风藤的质量控制。【关键词】 小花清风藤；高效液相色谱；齐墩果酸【中图分类号】 R284.1 【文献标志码】 A

2、【文章编号】 1007-8517(2015) 19-0008-03Abstract ： Objective To establish a method to determine components in Sabia parviflora Wall. ex Roxb. ， to improve its quality standard. And as the medicinal materials further to control the quality of the planting ang ， processing， using the basis.Methods Using HPLC

3、 with the gradient elution of Methyl alcohol-0.1mol/L ammonium acetate solution (85 : 15) detected the content of oleanolic acid at 210nm. Results Oleanolic acid showed a good linear range in 0.19891.2430mg/ml （ r=0.9991，n=6） ， recovery was 95.6%；RSD was 0.6%.Conclusion The established method is sim

4、ple ， accurate， sensitive and ， repeatability is good which ， can be used for quality control of Sabia parviflora Wall. ex Roxb.Keywords： Sabia Parviflora； HPLC； Oleanolic Acid 小花清风藤为清风藤科植物小花清风藤 Sabia parvifloraWall. ex Roxb的茎和叶，俗称小黄药、黄肿药、黄眼药、雅 希强，是布依族、 苗族的常用药物。 主要分布于云南、 广西、 贵州黔西南安龙、望谟、册亨、惠水等地 1 ；小花

5、清风藤味 苦，性微寒，具有清热利湿，清肝利胆，祛风湿，消炎止痛 的功效，临床用于治疗湿热黄疸，风湿骨痛，跌打损伤，肝 炎。贵州少数民族用于治疗肝炎具有很好的疗效。 贵州植 物志记载，小花清风藤制成的冲剂对甲肝患者治疗的有效 率达 95%以上；对乙肝的治疗效果也较显著，其降黄疸和转 氨酶的效果极佳，用药后约 30%患者的表面抗原转阴。现代 研究证明，小花清风藤具有保肝、治疗肝炎的作用 2。小花 清风藤收载于 2003 版贵州省中药材、 民族药材质量标准 ， 但标准仅有显微和理化鉴别。小花清风藤中含具有有护肝降 酶的齐墩果酸 3-4 ，研究在天然药物化学的基础上，结合小 花清风藤的功能主治，建立

6、HPLC法测定小花清风藤齐墩果 酸含量的方法，旨在为苗药小花清风藤的资源开发及质量控 制提供实验依据。1 仪器与材料1.1 仪器 Waters e2695 型高效液相色谱仪 （含 Empower 色谱数据工作站） ；AUY220 万分子一电子天平 （日本岛津） ； 赛多利斯CPA225叶万分子一电子天平；电热恒温干燥箱（上 海博讯实验有限公司） 。1.2 材料 齐墩果酸对照品（批号 110709-201206 ，中国 药品生物制品检定所， 含量 94.9%）；小花清风藤采于贵州黔 西南兴义市滴水村。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂 均为分析纯。2 方法与结果2.1 色谱条件 色谱柱： Wat

7、ers SunFire C18 （5um 4.6 x 250mm）； 流动相： 甲醇-0 . 1 mol/L 乙酸铵（85： 15）；柱温： 30C；进样量：10卩I；检测波长：210nm。2.2对照品溶液的制备 精密称取齐墩果酸 52.39mg （含 量 94.9%），加甲醇定容至 100mI 量瓶中， 制成每 1mI 含齐墩 果酸 0.4972mg 的溶液，所得对照品图谱见图 1。2.3供试品溶液的制备 取小花清风藤药材粉末 4g,精 密称定， 加入 70%乙醇 50mI ，水浴回流 2小时，取出，放冷； 再用 70%乙醇补足减失的重量，过滤，精密取 25mI 滤液置 于蒸发皿中，蒸干，残

8、渣加 3moI/L HCI 50mI 使其溶解，加热 回流 3 小时，然后用三氯甲烷振摇提取 4 次（每次 15mI ）， 合并三氯甲烷液，挥干，残渣加甲醇溶解，定容至 10mL，摇匀，取续滤液，即得。所得供试品图谱见图2.4 线性关系的考察 分别取齐墩果酸对照品 4、8、10、15、20、25卩l，按“ 2.1 ”项进行HPLC分析，以峰面积 丫为 纵坐标，进样浓度 X 为横坐标，进行线性回归，得回归方程 为 丫=4.67X 106X-1.54X 104, r=0.9991 （n=6）。结果表明齐墩 果酸进样量在 0.19891.2430mg/ml范围内与峰面积呈良 好的线性关系。具体见表

9、1 、图 3。2.5 精密度试验 取齐墩果酸对照品（浓度为0.4792mg/ml ） 10卩l，连续进样6次，在上述色谱条件下， 测定齐墩果酸的峰面积。结果齐墩果酸峰面积的平均积分值为2373089 , RSD=0.7%表明仪器的精密度良好。2.6重复性试验 精密称取小花清风藤粉末（ 3 号样大茎） 6 份， 按“2.3”项操作，制备 6份供试品溶液，按“ 2.1”项色谱 条件测定，记录峰面积，测定齐墩果酸含量。结果齐墩果酸 峰面积RSD为2.8%，说明本方法重复性良好。2.7 稳定性考察 取一份小花清风藤粉末 （ 4号样大茎），按“ 2.3”项操作，制备供试品溶液，室温放置0、 2、 4、

10、6、& 10h，按“ 2.1 ”项色谱条件测定，记录峰面积。结果齐墩 果酸峰面积的RSD为2.5%，表明供试品溶液在 10h内稳定。2.8 加样回收率试验 称取已知含量的（ 3 号样大茎）小 花清风藤药材6份，每份约2g,分别加入10ml 0.4972mg/ml 齐墩果酸对照品溶液， 按 2.3项方法进行样品处理后， 按 2.1 项色谱条件测定，记录峰面积，测定齐墩果酸含量，计算加 样回收率。由表 2 可知，齐墩果酸的平均加样回收率为 95.6%， RSD为0.6%,表明本方法的准确度良好。2.9 样品含量测定 分别称取 6个批次的小花清风藤粉 末，按“ 2.3”项操作，平行制备供试品溶液，按

11、“ 2.1”项 方法进行分析，记录峰面积，测定药材中齐墩果酸含量。结 果见表 3 。3 讨论从表 3 可知，小花清风藤样品间齐墩果酸的含量存在一 定差异，大茎叶中的齐墩果酸含量高于嫩茎嫩叶、小茎叶及 中茎叶。药材的茎叶生长年限越长，齐墩果酸的含量越高。 说明在药材选择时偏向生长年限长，茎叶粗大的较好。结合参考文献 5和齐墩果酸的化学特性， 药材采用 70% 乙醇 50ml 水浴回流 2 小时，加 3mol/L 盐酸加热回流 3 小时， 用三氯甲烷萃取，合并三氯甲烷液，蒸干，甲醇定容。在吸 收波长的选择上，参考文献5-6及通过DAD三微图谱扫描软 件，齐墩果酸 210nm 波长处有较好吸收且杂峰

12、较少基线较平， 故选择 210nm 为吸收波长。流动相选择时使用了甲醇-0.1mol/L乙酸铵（85 : 15）、 甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（87 : 13 : 0.04 : 0.02）,两种流动相 得到的齐墩果酸峰型都较好，供试品主峰都能与杂峰得到分 离，因此参考 2010版中国药典（一部）翼首草含量测定的流动相选择，故选择甲醇 -0.1mol/L 乙酸铵作为流动相。综上所述，研究建立的HPLC测定小花清风藤中齐墩果酸的方法对齐墩果酸的分离较好，方法简单，灵敏，精确度 高，可作为小花清风藤的质量控制指标。参考文献1 贵州省药品监督管理局 . 贵州省中药材、 民族药材质 量标准S.贵阳：2003 : 57.2 刘易蓉，邱晓春，陈惠 .小花清风藤保肝作用实验研究J.中国药房，2008，19（ 30）： 2341.3 林材，梁光义.清风藤等中药化学成分的研究 D.贵阳: 贵州大学，