免疫组织化学步骤详解

1、免疫组织化学技术取材将小鼠麻醉，打开胸腔充分暴露心脏，在心尖处剪一个小口，将注射器针 头经小口送入左心室并插至升主动脉起始部，用线将针头固定，剪破右心耳， 灌注50ml生理盐水。随后缓缓注入150ml4%多聚甲醛(pH7.4),固定1h后将脑取出，浸于4%的多聚甲醛中放入4C冰箱内固定 12h,然后转入30%的蔗糖溶液中浸泡48h。石蜡包埋1取出皮层及海马，流水冲洗24h，用梯度浓度的酒精进行脱水，酒精浓度 梯度为70%酒精80%酒精90%酉精，各30min, 95%酒精I 95%酒精II，各 20min, 100%酒精 I 100%酉精 I ,各 15min。2取出皮层及海马，浸入到二甲苯中

2、透明，1h X2次。3. 取出皮层及海马,浸入到二甲苯与石蜡 1:1 混合液中,浸泡 1 小时。4取出皮层及海马，浸入到石蜡中，浸泡1小时X2次。5在石蜡包埋机上进行组织包埋，冷却后保存在4 C冰箱中备用。切片将组织用石蜡切片及进行切片，切片厚度为2 am。连续切片5次，取1张切片，水浴锅展片后贴附在多聚赖氨酸包被的载玻片上。每个组织取 5张切 片。所有切片在烤箱中60C烤片2h。脱蜡及水化 (48min)1. 切片在二甲苯中脱蜡10min x次。2切片在梯度浓度酒精中水化，酒精梯度浓度为100%酒精I 100%酉精I 95%!精 I 95%!精 I，各 5min，90%酒精80%!精，各 3

3、min，70%酒 精， 2min。3.最后蒸馏水中浸泡 1min。灭活内源性的过氧化物酶 (40min)1. 用0.01M PBS冲洗3次，每次5min2. 滴加 3%H2O2(先用现配)到切片上，孵育 10分钟。3. 切片用0.01M PBS洗 5 分钟 X3次。抗原修复 (70min)1将事先配制好的抗原修复液在水浴锅中加热到95C。2 .将切片浸入到0.01M 的柠檬酸盐缓冲液( pH6.0)修复液中，进行抗原修复 15分钟。3 .修复后，取出切片，室温下冷却复温 40分钟。4. 切片用0.01M PBS洗 5 分钟 X3次。膜打孔 (25min)1. 滴加10 分钟0.3% Trit

4、on X-100曲拉通，现用现配)到组织片上，室温下孵育2. 切片用0.01M PBS洗5分钟X3次。封闭 (20min)1.滴加10% BSA至组织片，室温下孵育 20分钟。2倾去BSA勿洗。免疫反应1. 滴加一抗至组织片上。用于 DAB显色的组织片一抗浓度为1:500,用于免 疫荧光的组织片一抗浓度为 1:2000。2. 组织片4C孵育过夜。3. 第二天取出组织片,室温下复温 1h。4. 组织片用0.01M PBS洗 5min X 次。5. 滴加二抗，用于DAB显色的组织片滴加山羊抗兔辣根过氧化物酶标记的 二抗,浓度为0.4:250;用于免疫荧光的组织片滴加山羊抗兔FITC标记的二抗，浓度

5、为1:150。6. 滴加二抗后,酶标组织片室温下孵育一个小时,用0.01M PBS洗5分钟X3次，进行后续实验步骤。FITC标记组织片室温下孵 育 30 分钟,缓冲甘油封片,镜检。显色滴加DAB显色液，光镜下显色，待颜色满意后，自来水冲洗终止显色，冲 洗时间 5min。xx 素复染组织片浸入苏木素染液染色2min，自来水冲洗1mi n,取出后1%盐酸酒精分化10s,自来水冲洗2min,氨水返蓝15s,双蒸水冲洗1min。封片将切片依次浸入70%、80%和90%的梯度酒精中各2min,随后浸入2次 95%的酒精和2次无水乙醇中各3min。接着浸2次二甲苯，每次5min。最后用 树胶封片。普通：在

6、载玻片组织上滴一滴封片液,然后使盖玻片倾斜,一侧先接触液体,缓 慢盖在组织上,避免其产生气泡。用荧光封片剂封片,不能滴太多,放盖玻片的时候避免气泡,尤其组织周 围。然后用中性树胶滴盖玻片的四角,少滴。 30min 后放锡纸盒中,冰箱四度 保存。免疫组织化学配方0.1M PBS：NaH2PO42H2O15.5g, Na2HPO412H2O 6g NaCl87.75g,双蒸水溶解后调pH至7.2，用双蒸水定容至 1L。0.01M PBS：用双蒸水将0.1M PBS稀释 10 倍。4%多聚甲醛磷酸缓冲液： 40g 多聚甲醛和 500ml0.1M PBS混匀后加热至60C，搅拌并滴加1N NaOH至溶液清晰为止，冷却 后用0.1M PBS 定容至 1000ml。3%H2O2 30%H2O2 100 与0.01M PBS 900混匀。现用现配。Tris-EDTA抗原修复液：将Tris碱1.21g，EDTA0.37g 溶于双蒸水，调 pH 至9.0,加入吐温-20 500从双蒸水定容至1000ml。10%BSA 10g BSA溶 于 100ml0.01M PBSxx。0.3%TritonX-100xx:TritonX-1003 同0.01MPBS997混匀。现用现配。盐酸酒精： 1ml 盐酸同 99ml 75%的酒精混匀。抗原修复液（柠檬酸钠缓冲