基因的克隆表达载体构建及功能验证

1、基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法）一、 基因克隆 事前三问a. 克隆这个基因干什么？它有什么功能？b. 这个基因在哪种材料中扩增？c. 材料需要怎么处理？ 实验前准备工作a. 设计引物，准备材料，b. 购置试剂： Taq 酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试剂 盒c. 实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准备 基本流程提取和纯化 RNA cDNA 第一条链合成 PCR凝胶电泳 胶回收 连接转化 涂平板 挑单菌落 摇菌提质粒 测序1. 总 RNA的提取、纯化及 cDNA第一链合成1.1 叶片、根总 RNA的提取Trizol

2、是 一 种 高 效 的 总 RNA 抽 提 试 剂 ，内 含 异 硫 氰 酸 胍 等 物 质 ，能 迅 速 裂 解植物细胞，抑 制细胞释放出的核酸酶，所 提取的 RNA完整性好且纯度高，以 利于 下一步的实验。1）实验前准备预先配制 0.1%的 DEPC水（ ddH2O中含 0.1%DEPC，V/V，37 过夜处理 12 h ），高温 灭菌后，用 DEPC水配制 75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需 200灭菌至少 4 h，所用枪头 和枪盒均去 RNA酶处理 （直接购买 ） 。2）Trizol 法（小麦）叶 片或根的 总 RNA实验步 骤如下 ：（ 1 ） 提前在 1.5 ml 离心管中加入 1

3、 mlTrizol ，然后将 200 mg样品液氮中研磨成白色粉末， 移入管内，用力摇 15 s ，在15- 30温育 5 min，使 核酸蛋白复合物完全分离。（2）4 ，12000g 离心 10min ，取 上清，离 心得到的沉淀中包括细胞外膜、多 糖、 高 分 子 量 DNA， 上 清 中 含 有 RNA。（3）吸取上清液加 0.2 ml 氯仿，盖好盖，用力摇 15 s ， 1530 温育 23 min 。（4）在 12000g，4 离心 10 min，样 品分为 三层：底 层为 黄色有机 相，上 层为无 色水相和 一个中 间层，RNA主 要在水相 中，水相 体积约为所用 TRIzol 试

4、剂 的 60%。（5）将上层水相转移到新的 1.5 ml 离心管中，加 2 倍体积的无水乙醇沉淀 RNA，室温静止 30 min 。（6）在 12000g，4离心 10 min ，离心前看不出 RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶 状沉淀。（7）用 1 ml 的 75%乙醇洗 RNA，涡旋振荡样品，在 7500g，4离心 5 min ，弃上清。(8) 室温放置干燥或真空抽干 RNA沉淀， 大约晾 5-10 分钟，加无 RNase的水 100l 用枪 头吸几次， 55 60 温育 10 min 使 RNA溶解。(9) 配制以下体系：10 DNase bufferDNase I (RNase-fr

5、ee )(40 g/ l )RNasin Inhibitor( 40 g/ l )Total RNA70g加去 RNase水至总体积为 50 (10) 37 水浴 1h，加 DEPC处理的水至总体积为 100 l ，加入等体积氯仿抽提一次。(11) 取上清， 加入 10 l 的 3 mol/L NaAC溶液， 200 l 的无水乙醇， -80 沉淀 30 min。(12) 28 ， 12000g离心 10 min ，弃清液，干燥后取 50l 无 RNase的水溶解 RNA。3) RNA 的质量及纯度检测(1)电泳检测取 2ul RNA 与 1 ul 10 Loading buffer 上样缓冲

6、液混合均匀在 1% 的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察RNA 条带并记录实验结果。( 2)分光光度计 RNA纯度检测取 1ul RNA液，以 DEPC水为空白对照，测定 A260/ A280 比值，估测 RNA质量。4) cDNA 第一条链的合成按照以下体系将提取的总 RNA反转录成第一链 cDNA：1) 在 Eppendorf 管中配制下列混合液：试剂名称使用量模板 RNA1gOligo dT primer (50M)1ldNTP Mixture(10 mM) 1lRNase free dH2Oup to 10l2) 65 保温 15 min 后迅速在冰上急冷 2 min 。3) 离心数秒使

7、模板 RNA/引物等的混合液聚集 Eppendorf 管底部。4) 在上述 Eppendorf 管中配制下列反转录反应液 :试剂名称 使用量上述模板 RNA/引物等的混合液10 l5 Frist -Stand Buffer4lRNase Inhibitor(40U/ l) 0.5lMTV RTase (10 U/ l)0.5lRNase free dH2Oup to 205) 37 保温 60 min 。6）95 ,5 min 后冰上冷却，得到的 cDNA溶液用于 PCR扩增。1.2小麦胚及胚乳总 RNA的提取1）1M Tris-HClPH 9.0 )2.5ml4MNaCl1.5ml10%SD

8、SmlDEPC-H2O41.25ml2）取以上 RNA提取液 650 ul ，加 350 ul 水饱和酚，放入 1.5 ml 离心管中， 65 水浴预配制 RNA抽提 buffer ，50 ml 中含有：热。3）研磨 0.3 g 材料，直至呈粉末状，待液氮刚刚挥发，迅速加入到上述预热的提取液中，立即剧烈震荡，约 10 min 。再加入 400ul 氯仿，抽提 10 min ， 12000rpm 4离心 10 min 。5）取上清，加入等体积的氯仿，混匀摇10 min ， 12000rpm 4 离心 10 min 。6）取上清，加 1/3 体积的 8 M 氯化锂，4 保存过夜。7）离心 10 m

9、in，弃上清液，留沉淀，用75%乙醇洗 1 次，再用无水乙醇洗5-10 s，晾干，溶于 80 ul DEPC 水中。8)加入 9 ul DNA酶(无 RNA酶) ， 10 ul 10 buffer （ DNA酶所带）和 1ulRasin ( Rnas抑制剂）， 37 30 分钟（再加 500 ul水）9）取出用 300 ul 氯仿和 300 ul 苯酚抽提，摇 10 min 钟，静止 10 min ，12000 rpm 4 离心 10 min 。10）取上清，加入等体积的氯仿，摇10 min ，静止 10 min ，4 离心 10 min 。11）取上清，加 1/10 NaAC （ 3M，PH

10、 5.2 ），再加 2 倍体积的预冷无水乙醇， -80 冰箱过夜；（10）12000rpm离心15 min，弃上清液，留沉淀，晾干，溶于40 ul DEPC水中，电泳检测其完整性，保存于 -80 ，备用。2.2.2.1 cDNA 第一条链的合成 （1）基因组 DNA的去除反应试剂 使用量5xgDNA Eraser Buffer2.0 ulgDNA Eraser1.0 ulTotal RNA5 ulRNase Free dH 2Oup to 10.0 ul42 2 min 4 10 min(2) 反转录反应试剂 使用量5xPrimeScript Buffer 2(for Real Time)4.

11、0 ulPrimeScript RT Enzyme MixI1.0 ulRT Prime Mix1.0 ul的反应液10.0 ulRNase Free dH 2Oup to 20.0 ul37 15 min85 5 sec4 10 min -20 保存备用2. 基因 cDNA克隆2.1 基因片段的 PCR扩增以反转录后的 cDNA为模板进行 PCR扩增。PCR反应体系为 20ul ：10PCR Buffer 2.0 ul ，2.5 mMd NTPs 1.6 ul，10 mM上下游引物各 0.8 ul ， Taq 酶 0.3 ul，模板 cDNA1.0 ul ，ddH2O 补足至 20 ul 。

12、按照下列条件进行 PCR扩增：944min9430sec5040sec 30 cycles721min7210 min2.2 PCR 扩增产物的检测和回收纯化PCR扩增产物在 1% 琼脂糖凝胶 （ 含有 0.5 ug/ml 溴化乙锭 ） 上进行电泳，在紫外灯照射 下进行观察， 与标准分子量进行比较估测扩增 DNA片段的大小， 若与预计的大小相符， 则使 用琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒将扩增出的片段回收，主要操作步骤如下：1）在紫外灯下切下将要回收的条带 （ 尽量使用长波长的 UV），称重。2）按每 100 mg 琼脂糖胶加入 300 ul 溶胶液 PN，置于 50 水浴中 10 min ，每隔

13、 2 min 混匀一次，使胶彻底融化，室温放置2 min 。3）将 UNIQ-10 柱放入 2 ml 的收集管中，加入 600 ul 平衡液 BL，13000rpm，离心 30 sec 。3）取下 UNIQ-10 柱，倒掉收集管中的平衡液，将融化的胶溶液转移到UNIQ-10 柱中，静止2-3 min ， 13000rpm，离心 30 sec 。4）取下 UNIQ-10 柱，倒掉收集管中的废液，再放回收集管中，加入700 ul 漂洗液 PW（使用前先检查是否已加入无水乙醇 ） ，13000rpm离心 30 sec 。5）取下 UNIQ-10 柱，倒掉收集管中的废液，放回收集管中，加入500 ul

14、 漂洗液 PW，13000rpm 离心 30 sec ，重复一次。6）取下 UNIQ-10柱，倒掉废液，放回收集管中 ,13000rpm ，离心 2 min 。7）将 UNIQ-10柱放入一新的 1.5 mlEp管中，在柱子的吸附膜中央悬空滴加 50 ul 预热 70 洗脱液 EB，室温放置 5 min 。8）12000 rpm ，离心 l min ，Ep管中液体即为回收的 DNA片段， - 20保存备用。2.3 回收产物与 PMD-T载体的连接与转化采用 TAKARA公司的 PMD-T载体进行连接反应， 感受态细胞 DH5a作为转化细胞进行转化。 具体操作步骤如下：SolutionI 、 P

15、MD18-T或 19-T、 DNA回收产物置于冰中溶解。在 0.2ml 离心管中配制反应体系 10ul ：PMD18-T 载体0.5 ulSolutionI 5 ul回收 DNA产物4.5 ul混匀， 16 反应过夜（ 3h 就可以）。连接反应快结束时，从 -80 冰箱中取出 DH5a感受态细胞，将离心管置于冰上使之融 化。1）取 5 ul 的连接产物加到 50 ul 感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴 30 min 。2）将离心管置于 42 水浴 90 s，间不要摇动离心管。 取出管后立即置于冰浴中放置 2-3 min， 其3）向离心管中加入 600-900 ul LB （不含抗生素）液体培养基，

16、 150r/min ，37震荡培养 60 min 。4）吸取 150 ul 已摇好的菌液涂布在含有 Amp（终浓度 50 ug/ml） 的 LB固体培养基上，待液 体完全被培养基吸收后，倒置平板，37，培养 12-14 小时。2.4 重组克隆的验证及序列测定随机挑选 5 个左右单菌落于 10 ml 含 50 ug/ml 的 LB 液体培养基中，于恒温摇床 37 C， 180r/min 震荡培养过夜， 培养至菌液 OD600为 0.6 0.8 ，用天根的质粒小提试剂盒提取质粒。 也可按照下列步骤提取质粒：1）将培养好的菌液倒入 2.0 ml 离心管中， 12000rpm 离心 1min ，去掉上

17、清液， 再重复二次。2）加入 100 ul 预冷的溶液 P1涡旋使充分悬浮，室温静止 5 min 。3）加入 200 ul 溶液 P2，同一方向缓慢匀速转动离心管使溶液混合均匀，置冰上5 min 。4）加入 150 ul 溶液 P3，同一方向缓慢匀速转动离心管使内含物在溶液中分散均匀，置冰 上 5 min 。5）12000 rpm，离心 10 min，取上清，用等体积的苯酚和氯仿 :异戊醇 （24:l） ，各抽提一次。6）12000 rpm ，离心 3 min ，取上清。7）向上清中加入 2倍体积的无水乙醇， 混匀，-20 ，放置 30 min，12000 rpm，离心 10 min。8）弃上

18、清，加入 l ml75% 乙醇，洗涤沉淀， 12000 rpm 离心 3 min ，弃上清，自然晾干。9）每管中加入 30 ul TE （pH 8.0） buffer和 1 RlNase（10ug/ul ） ，37水浴 30 min 溶解质粒 DNA,-20贮存备用。溶液的配制：SolutionI: 葡萄糖 50 mM; EDTA(PH8.0) 10 mM;Tris-Hcl 25 mMSolutionII:NaOH 0.2 M;SDS 1%（现用现配 ）SolutionIII: 乙酸钾 60 mM; 冰乙酸 11.5 ml;ddH2O 28.5 ml采用上文中的 P1、P2特异性引物以质粒为模

19、板进行PCR扩增， 扩增结果与 RT-PCR相同的质粒为验证的阳性质粒，由华大基因工程有限公司进行序列测定。、 植物转化表达载体的构建 事前三问a. 构建什么载体（过表达，干扰？还是别的）？酶切位点有哪些是可以用的？怎么 用方便？b. 载体的细菌抗性和筛选抗性分别是什么？c. 准备转到哪种材料里？用什么方法转？ 实验前准备工作a. 选择一个合适的表达载体b. 酶切位点选择：用 DNAMAN 中的 Restriction-Restriction Analysis 分析待插入基 因中包含的酶切位点，避免使用基因中已有的酶切位点。剩下的酶切位点的选择 依据的原则为：方便（酶反应温度、 Buffer

20、一样，可以双酶切） 、快捷（可以省时 酶切）、便宜。c. 设计带酶切位点的引物d. 购置试剂：高保真酶或 LA Taq 酶、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、 DNA 连 接试剂盒等e. 实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素 基本流程a. 过表达载体NcoI 和酶切 #：如果两个酶可以同时酶切，就直接双酶切；如果不能，按以下方法进行以BstEII 为例和：1）取一灭菌的 200ul 的离心管按顺序依次加入：10 Buffer 2 ulNcoI 1 ulPlasmid 2-3 ulddH2O补足 20 ul2）混匀， 37水浴 3 h，再向管中加入 2 倍体

21、积的无水乙醇， 4放置 1 h，12000 rpm 离心10 min ， 75%的酒精洗涤一次，晾干，再向离心管中分别加入：10 Buffer2 ulBstEII1 ulddH2O17 ul3）混匀，60 水浴 3h后用1.2 的琼脂糖凝胶电泳检测，将所需要的目的片段在紫外光下 切下来，用琼脂糖 DNA回收凝胶剂盒回收纯化小片段。同时用同样的方法酶切表达载体（如PCAMBIA330）1 ，回收大片段。b. RNA干扰载体的构建三、 功能验证 目前本实验基因的功能验证主要采取转基因的方法，常用的转基因方法有基因枪转化 法和农杆菌介导法。 目前实验室做的是农杆菌介导法转化水稻。 下面把两种方法都介

22、绍一下： 实验前准备工作34，转化水a. 准备好诱导愈伤的材料（我们用农杆菌介导法转化小麦茎尖用豫麦 稻愈伤用 kitake ；用基因枪法一般用豫麦 18）。 b.准备好配制各种组培培养基的试剂和药品。c. 准备好光照恒温培养箱。 基本流程 （农杆菌介导法转化水稻）种子消毒诱导愈伤（ 30d 左右） 农杆菌转化重组载体共培培养3d）恢复培养（ 7d）筛选培养（ 30d 以上） 分化培养（ 90d 左右） 移栽到花盆至成熟农杆菌介导法转化水稻1. 农杆菌感受态细胞的制备转化1）取出 -80 保存的含农杆菌菌株 EHA105的菌液冰上解冻， 划线接菌于 YEB固体培养基（含 Rif 50 mg/L

23、 ）中， 28 恒温培养 2 天。2）挑取农杆菌 EHA105单克隆，接种于 10 ml YEB 液体培养基（含 Rif 50 mg/L ）中，于恒 温摇床中 28 、 200rpm/min 培养 1-2 天。3）在 250 ml 的三角瓶中加入 50 mlYEP液体培养基及上述过夜培养物的菌液2 ml，200 rpm/min，28培养至 OD600 为 0.5-1 。4）冰浴冷却菌液， 4000rpm，4， 5-10 min 离心收集菌体。5）去上清，沉淀悬浮于 1 ml 预冷的 0.15 mol/L CaCl2中，使细胞充分悬浮， 分装成 100 l/ 管，每管中加入 100 ul 预冷的

24、 50%甘油，液氮中速冻后至 -80 保存。6）每管加入约 1 g构建好的质粒 DNA，混匀冰上放置 30 min 。7）液氮中速冻 1 min 。8）迅速置于 37 水浴锅中，水浴 5 min 。9）加600 ul YEP 液体培养基， 28 ， 50rpm慢摇2-4 h ，使抗性基因得到表达。10）于超净工作台上将菌液涂布于 YEP固体培养基（含 Rif 50 mg/L ，Kan 50mg/L ），同时设 置一个仅含抗生素的平板做对照。11）于28 恒温培养箱中 2-3 d 后检测其生长情况。12）挑取单菌落进行培养提取质粒，并且进行酶切鉴定。附： YEB 培养基的制备YEP液体（ 500

25、ml ）YEP固体（ 500ml ）YEAST EXTRACT5.0g5.0gTPYPTONE5.0g5.0gBEEF EXTRACT2.5g2.5gAGAR POWDER0.0g1.5g/100ml灭菌： 121， 20min2水稻基本培养基的配制单位： mg/L表 2-1 水稻基本培养基的配制成份N6-P mediumN6-AS mediumN6-R mediumMS-F mediumN6 salt mixture3,9813,9813,981/MSsalt mixture/1,000CoCl2H2O0.0250.0250.025/CuSO45H2O0.0250.0250.025/NaMo

26、O42 H2O0.250.250.25/Glycine2222Myo-inositol100100100100Thiamine HCI5555Pyridoxine1111Nicotinic1111Proline2,800/Casamino acid3001,0001,000/Sucrose30,00030,00025,00015,0002,4-D22/Sorbitol/25,000/Kinetin/2/NAA/0.05/Gelrite4,0004,0008,0002,500pH5.65.65.65.6Table 2-1 Preparing the minimal medium of rice3

27、. 根癌农杆菌介导水稻转化3.1 种子消毒和愈伤组织的诱导1）选取成熟饱满健康的水稻种子去壳后，75%的乙醇消毒 1 min，无菌水漂洗 3次，用 20的次氯酸钠溶液消毒 20 min ，无菌水漂洗 5次。2）将种子种胚朝下放置到 N6-P固体基本培养基上， 28 ，光照（ 12h）/ 黑暗（12 h），冷 光条件下培养 30 天左右。3.2 农杆菌介导水稻转化以农杆菌菌株 EHA105为介导， 分别将构建好的表达载体导入受体材料Kitaake，并获得相应的转基因植株。 水稻成熟胚遗传转化的基本流程为：1）28 培养以上含重组质粒的农杆菌 16 h ，收集菌体，并稀释到含有 100 mol/L

28、 AS的N6 液体培养基中至浓度为 OD600 0.5 ；2）将适量培养至一个月的水稻成熟胚胚性愈伤组织与上述菌液混合侵染30 min ，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基中， 24 共培养 3 d ；3）将上述愈伤接种在含有 3 mg/L Bialaphos （或潮霉素）的 N6固体筛选培养基上第一次筛 选16 d ；4）挑取健康愈伤转入 5 mg/L bialaphos 的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每 15 d 继代一 次；5）挑取抗性愈伤转入分化培养基上进行分化培养；6）待分化成苗的再生水稻植株长至 20 cm高时（约 90 d）开口炼苗 3 d，并移栽至温室栽培。4 转基因植株的初步

29、鉴定4.1 转基因水稻 DNA的提取按上述方法用 CTAB法提取转基因水稻株系总 DNA，并按顺序记号编号4.2 转基因植株的 PCR检测以提取的 DNA为模板，用引物 P1、P2 进行 PCR检测，同时用提取的重组质粒做阳性对 照，以水和未转化的水稻 kitaake 为阴性对照，在 1.0%琼脂糖凝胶电泳上检测目的条带是 否存在，以确定转基因的个体。5 外援目的基因的表达分析为了检测外源性目的基因是否在转基因植株中转录表达， 及其在组织部位的表达量， 选 取已鉴定为阳性植株的转基因水稻株系， 在花后 10 d 分别取根、 茎、叶及未成熟胚乳总 RNA， 用 Actin 为内参，进行定量 RT

30、-PCR检测。6种子萌发实验将经 PCR鉴定的转基因株系种子 （ T1）收获后与同非转基因水稻品种在相同的条件下萌 发实验，一周之后观察种子发芽情况。为进一步研究该基因水稻种子萌发特性的变化及 ABA 和胁迫条件下的反应， 选取经分子鉴定为稳定遗传的健康转基因种子（T2），50打破休眠，采用不同浓度的 ABA溶液，以及 75 mmol/LNaCl 和 200 mmol/L 甘露醇溶液浸泡种子，观察 记录其萌发。基因枪轰击法转小麦1. 培养基的配制1）愈伤组织诱导及继代培养基MS基本培养基 2 mg/L 2,4-D 30 g/L 蔗糖 7 g 琼脂 /L，pH为 5.6-5.8 。在此培养 基中

31、，培养前两周附加 0.5 mg/L ABA2）高渗培养基MS基本培养基 2 mg/L 2,4-D 0.4 mol/L 甘露醇 30 g/L 蔗糖 7 g 琼脂/L ，pH为 5.6-5.83）分化筛选培养基MS基本培养基 +1.0 mg/L IAA+2.0 mg/L ZT+3-5 mg/L bialaphos+0.7%琼脂 +3%蔗糖，pH5.6-5.84）生根筛选培养基1/2MS 基本培养基 +0.5 mg/L IAA+1-2 mg/L bialaphos+1.5 mg/L多效唑 +3%蔗糖 +0.7%琼脂， pH5.6-5.8以上所有培养基均采用常规方法灭菌，选择剂 Bialaphos 及

32、激素均采用过滤灭菌，培 养基冷却至 60 左右时加入。2. 微弹的制备称取 50 mg金粉（ 直径为 1.0 um） 放入 1.5ml 离心管中，加入 1 ml 96%的酒精充分振荡 30 s ，使金粉充分散开， 12000rpm 离心 1 min ，除去上清液，再加 1 ml 96%乙醇重悬金粉， 重复上述步骤 3 次。至完全除去乙醇后，加入 1 ml 无菌水制成浓度为 50 mg/ml 的金粉悬浮 液，用前吸取 50 ul 金粉悬浮液至 Eppendorf 管中，加入质粒 DNA 5 ul （ 1 ug/ul ），振荡 混匀，再依次加入 50 ul 2.5 mol/L的 CaCl2 和 20 ul 0.1 mol/L的亚精胺 （spermidine 现用现配 ）溶液混匀，然后冰浴 15 min