单克隆抗体综述及其行业发展动态分析课程论文1

1、专业课程论文专业课程论文 题 目:单克隆抗体综述及其行业发展动态分析 姓 名: 学 院: 食品科技学院 专 业: 生物工程 班 级: 学 号: 指导教师: 单克隆抗体综述及其行业发展动态分析 摘要：单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具，它可用于分析抗原的 细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系;生产出针对复杂生物混合物中的特定 分子的抗体,可用于分离、分析及纯化该特定分子抗原;其试剂可用于临床诊断 和治疗,或用于以单抗为弹头的“生物导弹”药物等。近年来，随着分子生物学 和细胞生物学的发展，出现了嵌合抗体制备技术、噬菌体展示技术、核糖体展 示技术等，这些技术有效地解决了单克隆抗体鼠源性等问题

2、，还有 dna 免疫制 备抗体的研究进展，使单克隆抗体凭借自身高度特异性和均一性的特点在治疗 肿瘤、自身免疫性疾病和器官移植等方面显出了独特的优势和良好的应用前景， 故单克隆抗体制备技术的发展也就显得尤为重要。 1975 年,kohler 和 milstein 创立了杂交瘤技术制备单克隆抗体( monoclonal antibody，mcab)，所谓 mcab 是利用 hat 培养基筛选出既能稳定 生长又能产生抗体的杂交瘤细胞，杂交瘤细胞分泌的抗体是由识别一种抗原决 定簇的细胞克隆所产生的具有高度特异性和均一性的抗体，故称之为 mcab。单 克隆抗体技术自问世以来,在临床治疗方面进展缓慢,，主

3、要原因是目前单克隆 抗体大多是鼠源性的,而鼠源单抗应用于人体治疗时存在诸多问题:一方面，鼠 源单抗与自然杀伤细胞等免疫细胞表面 fc 段受体亲和力弱，产生的抗体依赖 性细胞介导的细胞毒作用较弱，对肿瘤细胞的杀伤能力较弱，人血循环中的半 衰期短，它发挥细胞毒作用作用的时间较短; 另一方面，鼠 mcab 还具有免疫 原性，产生人抗鼠抗体，既降低单抗的治疗效果，又诱发变态反应。因此,在保 持对特异抗原表位的高亲和力的基础上人源化和全人化的改造,减少异源抗体的 免疫原性成为单抗研究的重点。此外,传统杂交瘤技术还存在制备周期较长,成 本较高,杂交瘤细胞不稳定抗性会丢失等缺陷。要解决传统杂交瘤技术所存在的

4、 问题,为单克隆抗体的应用提供更广阔的空间，出现了嵌合抗体制备技术、噬菌 体展示技术、核糖体展示技术、dna 免疫制备抗体技术，制备单克隆抗体。 自然杂志预测，2012 年全球销售额前 10 名的药物中有 6 个为抗体药 物并占据销售额最大的前 3 位。全球范围内单抗药产业的布局是不平衡的，其 中欧美研发实力最强，产品线丰富，而属于新生力量的中国正大力发展单抗药 物，努力提供单抗药物产品线。此外，前景广阔的单抗药物受到药企的青睐， 很多跨国药企通过收购技术平台涉足这一领域，罗氏是这个领域内典型的例子， 其收购的基因泰克公司是单抗药物行业的全球领跑者。 全球生物制药产业正处于快速上升期，其中单克

5、隆抗体药物最为活跃，相 比 2010 年的 480 亿美元，2011 年全球单抗药物的市场总量已经达到 628 亿美 元，增速为 30.8 %。抗体市场是从 2000 年之后开始蓬勃兴起的，2000-2008 年 间单抗药物复合增长率达到 41%。中国行业研究网发布的2012-2016 年中国 单克隆抗体行业投资分析及深度研究咨询报告显示：未来，全球单克隆抗体 药依旧会保持较高的增长率。到 2015 年，全球单克隆抗体药销售额有望达 980 亿美元左右。 一单克隆抗体综述一单克隆抗体综述 1.嵌合抗体制备技术 11 人-鼠嵌合抗体制备技术 该技术产生于 1980 年代中期,是应用 dna 重组

6、技术将人 mcab 的恒定区基 因替换鼠 mcab 的恒定区基因，从而编码产生的 mcab。1980 年代中后期,科学 家对嵌合抗体进一步改进后,抗体基因只有互补性决定区(cdr)是鼠源成分,其余 均为人基因序列, 1.1.1 技术原理 即将鼠源性单抗在保留其抗原结合活性的基础上，尽可能去除鼠源化部分 或代之以人源化片段，从而尽可能减少单抗的异源性，然后根据所用的载体质 粒标记基因产物,选用适当的抗生素或试剂进行筛选,再用与传统杂交瘤技术相 似的方法克隆出分泌人鼠嵌合抗体的细胞株。 1.1.2 技术优缺点 嵌合抗体不但具有与鼠源单抗相同的特异性、亲和力和产量,而且可根据不 同的需要接上不同亚类

7、的人恒定区基因来改变抗体的功能,使用更加灵活。然而， 尽管尽力降低鼠源成分，这实现了抗体的高度人源化,但仍可诱发排异反应,并 未完全解决鼠抗体的免疫原性问题,而且人源化过程繁复且费用昂贵,大量的反 复试验不可避免。因此又发展出了产生全人单克隆抗体的技术。 12 人源化抗体制备技术 人源化改造主要是重构抗体和表面重塑抗体。 1.2.1 技术原理 抗体上，并不是整个 cdr 都参与抗原的特异性识别，在 cdr 区中仅一部 分氨基酸残基与抗原结合，这些氨基酸残基决定抗体的特异性，被称之 sdr。sdr 移植抗体仅将异源抗体 cdr 区内与抗原结合关系密切的 sdr，移植 到人抗体相应位置上，使人源化

8、抗体的免疫原性进一步降低。 1.2.2 缺点及改进方法 sdr 移植抗体往往存在亲和力和特异性降低的缺点。目前重构抗体是对鼠 源性单抗人源化改造最常用、最基本的方法。表面重塑抗体是对鼠抗体框架区 表面氨基酸的残基进行重塑或替换，该技术仅改造或替换与人抗体有明显差异 的表面氨基酸的残基。 在维持抗体活性和减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸残基 替换，使抗体与抗原结合具有更好的亲和力和特异性。 2噬菌体抗体库技术 噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术。 2.1 技术原理 它是一种基因表达产物和亲和选择相结合的技术，建立在噬菌体外壳具有 表达抗体蛋白片段能力的基础上

9、，以改构的噬菌体为载体，用基因工程技术克 隆人抗体可变区的全套基因,然后将克隆的基因插入噬菌体编码衣壳蛋白的基因 中,这样在噬菌体表面表达特定抗体片段,而在噬菌体核心 dna 中则含有该抗体 片段的基因，建立了噬菌体抗体文库，形成获得一个具有上亿个体外方式制得 的不同抗体的基因数据库。 2.2 制备方法 抗体的具体制备方法是将抗原包被在固定介质上,加入待筛选的噬菌体颗粒 与固定的抗原结合,获取结合的抗体,将未结合的抗体洗脱,从噬菌体库中筛选出 针对特定抗原的特异性抗体的可变区。用表达有相应抗体分子的噬菌体颗粒去 感染宿主菌,使该噬菌体颗粒得到扩增。将抗体可变区与恒定区组合得到具有完 整能的全人

10、单克隆抗体。 2.3 技术优点 噬菌体展示技术的最大优点是一旦噬菌体库建立后,就可以根据需要直接从 文库中筛选得到针对目标抗原的特异性抗体,大大缩短了单克隆抗体的制备周期 并且得到的抗体可用于制备完全人源化抗体。当抗体分离出来时,噬菌体系统同 时也提供了设计抗体亲和性及其应用的模式。 2.4 技术缺点 但是该技术也存在一定的缺陷,由于受表达系统的限制,抗体库的库容不足 以支持获得稀有的抗体,难以涵盖一些动物抗体的多样性; 而且对噬菌体或表达 宿主的生长或功能产生抑制作用的抗体也难以获得，非免疫抗体库获得的抗体 亲和力不高; 在淘选过程中会出现高 亲和力低拷贝的特异性噬菌体抗体的丢失 等。 3

11、核糖体展示技术 核糖体展示技术是一种完全在体外合成并筛选蛋白质的无细胞转化技术。 3.1 技术原理 该技术建立不受细胞转染和表达等因素影响的完全体外展示系统，利用聚 合酶链反应扩增含目的基因的 cdna 文库，同时引入启动子、核糖体结合位点 及茎环结构，在转录/翻译耦联系统作用下，形成“蛋白质-核糖体-mrna”三元 复合物，构成核糖体展示的抗体库，再用相应的抗原对翻译混合物进行筛选并 从中分离 mrna，通过反转录-聚合酶链反应富集目的基因，并将目的基因导入 表达载体，从而获得库容量大、特异性强、亲和力高的人源基因工程抗体库。 核糖体展示系统的抗体筛选过程与噬菌体展示系统的过程相类似。 3.

12、2 技术优点 核糖体展示技术的主要优点是一方面能产生更大的抗体库,库容可达到 1015 ,另一方面可以方便地与一些特殊的 pcr 技术,如性别 pcr、错配 pcr 等结 合,获得更多的抗体遗传多样性,而且所表达的抗体具有正确的空间折叠构象。 核糖体展示技术已经成功地用于生产抗黄体酮的抗体片段。 4 dna 免疫制备抗体技术 dna 免疫是近年发展起来的一种新型抗体制备法。dna 免疫克服了传统蛋白 质免疫方法的缺陷，能更为有效地激发机体的体液和细胞免疫应答，为某些疾 病如病毒性疾病和肿瘤等的诊断和免疫治疗开拓了新的途径。 4.1 技术原理 现代免疫学研究表明，机体对抗原的应答取决于两个要素:

13、抗原的免疫原 性;机体对抗原的递呈及相应的反应性。在抗原的免疫原性无法改变的情况下， 可提高机体对相应抗原的反应性。目前 dna 免疫的焦点是抗原的递呈机制及佐 剂对 dna 免疫的影响。虽然 dna 免疫后在体内如何被细胞摄取及其表达的抗原 又如何被递呈尚未完全清楚，但许多文献均证实了肌细胞对 dna 的摄取及抗原 蛋白的表达起到很重要的作用。由皮肤和肌肉途径给予 dna 均可产生体液免疫 应答和细胞免疫应答。 4.2 具体方法 一般选用 5 一 8 周龄的 balb/c 雌性小鼠，免疫 6 周龄以下小鼠可获得更好 的免疫应答，免疫 4 周龄小鼠特异性蛋白质表达水平最高。webster 等认

14、为在 dna 免疫中最有效的方法和途径是用基因枪在肌肉或皮内免疫 dna 包被的金颗 粒。但有人把 dna 直接注射至小鼠的股四头肌也能很好地激发机体的免疫应答。 通过这两种免疫方法制备的单克隆抗体均能被 dna 编码的蛋白识别。还有人发 现肌肉注射 dna 的特异性蛋白质表达效率明显高于静脉注射 dna，经皮内注射 和肌肉注射等量 dna，发现肌肉免疫的方法产生特异性抗体和 ctl 的效率高， 因而肌肉注射方法最佳。 4.3 技术优点 dna 免疫较常规免疫产生的体液免疫应答强而持久，因此用 dna 免疫制备 单克隆抗体和多克隆抗体可以省时省力。dna 肌肉注射后，被肌细胞摄取的 dna 半

15、衰期延长，蛋白质持续表达，并且加强了 b 细胞和 t 细胞的记忆持久性。dna 免疫可用于已知 dna 编码而又不能得到目的蛋白或获得的抗原蛋白为低免疫原 性抗原的免疫，也可用于大动物免疫如兔、猪等。为特异性强、纯度高的单克 隆抗体的制备提供了一个省时省力的好方法。 4.4 技术存在缺点 大部分 dna 被核酸酶降解，解决 dna 在动物体内的稳定性是 dna 免疫的关 键;dna 疫较蛋白质免疫引起的免疫应答较迟，这可能与 dna 免疫后需经过特 异性蛋白质的表达才能激发机体的免疫应答有关;dna 免疫是否还诱导动物产 生特异性免疫耐受还有待于深入的探讨。 4.5 技术应用前景 随着 dna

16、 免疫技术的发展，能免疫除多糖类抗原外所有已知 dna 编码的蛋白质 抗原，如病毒蛋白、免疫球蛋白、肿瘤抗原等闭。dna 免疫不仅在无法获得纯 化蛋白质的情况下开拓了研制特异性抗体的新途径，而且逾越了抗原的低免疫 原性的障碍，有效地激发宿主的特异性免疫应答。同时 dna 免疫激发机体产生 强而持久的体液免疫，这为高产量特异性多克隆抗体和纯度高、特异性强的单 克隆抗体的获得提供了必要条件，在许多疾病如病毒性疾病和肿瘤等诊断和免 疫治疗中具有良好的应用前景。 二中国单克隆抗体药物市场应用状况态势分析二中国单克隆抗体药物市场应用状况态势分析 1.中国单克隆抗体在治疗癌症、肿瘤上的研究和发展 中国癌症

17、、肿瘤发病及死亡率概况 分泌营养和代谢疾病、消化系病、泌尿生殖系病、神经系病、精神障碍， 前十位死因合计占死亡总数的 91.3。与上年相比，城市居民恶性肿瘤、脑血 管病死亡比例略有上升。 目前中国每年新发病例为 220 万，因癌症死亡人数为 160 万，现有病例 310 万。近 20 年来，中国癌症死亡率上升了 29.42%，癌症死亡占城乡居民总死亡 构成的 24%。中国每 45 个死亡者就有 1 个死于癌症。癌症每年给中国造成的 经济损失逾千亿元。但是，在癌症患者逐年上升的情况下，却有一半患者得不 到规范治疗。 2.抗肿瘤药物市场 以医院购药金额计算，植物来源性抗肿瘤药（包括紫杉醇类、替康类

18、、泊 甙类、长春碱类）仍然是份额最大的一类抗肿瘤药，其次是抗代谢类（包括他 滨类及其他核甘酸类似物类抗肿瘤药）位居第二。份额增长较快的类别有小分 子激酶抑制剂（特别是 2006 年，份额扩大了 2.5 倍；单抗类也有将近 100%的 增长；虽然这两类绝对份额还不高，但发展迅速；铂类抗癌药由于有奥沙利铂 的加入，5 年来的份额也是逐渐扩大；而抗代谢类抗癌药近两年由于他滨类药 物的上市和普及，市场份额也有提高；抗生素类抗癌药和细胞毒类药物由于无 新产品上市，份额逐渐被其他新药所抢占。总得来看，国内抗肿瘤药医院用药 格局有向国外看齐的趋势，突出表现在小分子激酶抑制剂、单抗和内分泌类抗 癌药的份额稳步

19、扩大。国外制药巨头也看好国内抗肿瘤药市场潜力，引入新产 品的速度明显加快，一些产品在国外刚上市一年，在国内已有进口产品。但短 期来看对目前的主流品种不会造成太大冲击，因为如前所述，这些产品主要作 为二线治疗药物使用，或和其他主流品种组成联合用药方案，并不是替代现有 主流品种。而且这些药物价格昂贵，目前国内的消费水平还不足以使这些药物 大面积铺开。但正因为价格高，所以可在短时间内使用药额大幅提高。 图表 1 国内抗肿瘤药亚类份额变化 0.00% 20.00% 40.00% 60.00% 80.00% 100.00% 120.00% 中药类抗癌药 植物类抗肿瘤药 小分子激酶抑制剂 细胞毒类抗肿瘤药

20、 其他 内分泌类抗肿瘤药 抗生素类抗肿瘤药 抗代谢类抗肿瘤药 基因工程药物 单抗 铂类抗肿瘤药 中药类抗癌药12.89%10.65%11.26%12.05%9.09% 植物类抗肿瘤药33.53%34.74%34.59%29.93%29.12% 小分子激酶抑制剂0.02%0.95%1.69%1.81%4.50% 细胞毒类抗肿瘤药4.65%4.40%4.09%3.47%2.55% 其他1.15%1.45%1.30%1.77%1.87% 内分泌类抗肿瘤药6.26%5.12%5.67%6.72%7.99% 抗生素类抗肿瘤药16.60%16.96%12.97%13.66%10.43% 抗代谢类抗肿瘤药1

21、4.54%13.28%13.78%14.66%16.09% 基因工程药物0.00%0.00%0.00%0.11%0.46% 单抗1.42%1.87%2.69%2.90%4.76% 铂类抗肿瘤药8.93%10.58%11.96%12.91%13.14% 2002年2003年2004年2005年2006年 图表 2 国内抗肿瘤亚类增长情况 0 100000000 200000000 300000000 400000000 500000000 600000000 700000000 800000000 铂类抗肿瘤药 单抗 基因工程药物 抗代谢类抗肿瘤药 抗生素类抗肿瘤药 内分泌类抗肿瘤药 其他 细胞

22、毒类抗肿瘤药 小分子激酶抑制剂 植物类抗肿瘤药 中药类抗癌药 2002年 2003年 2004年 2005年 2006年 图表 3 2006 年国内抗肿瘤产品贡献率和增长率 药品名称2006 年贡献 率 2006 年增 长率 药品名称2006 年贡献 率 2006 年增 长率 多西他赛 17.6364.19% 喜树碱 0.0289.92% 卡培他滨 12.65131.60% 长春碱 0.01271.55% 奥沙利铂 12.5039.08% 雌莫司汀 0.018.58% 吉非替尼 10.87425.17% 甲氨喋呤 0.010.80% 紫杉醇 7.6618.26% 葫芦素 0.0162.34%

23、利妥昔单抗 5.6576.53% 血卟啉 0.0159.38% 多柔比星 4.68696.31% 高三尖杉酯碱 0.018.14% 伊立替康 4.53115.56% 三尖杉酯碱 0.0013.50% 吉西他滨 4.0319.14% 复方替加氟 0.00na 来曲唑 3.34150.02% 安西他滨 0.00na 复方斑蝥制剂 3.1226.27% 比卡鲁胺 0.00na 达利珠单抗 2.85na 甲异靛 0.00na 培美曲塞 2.78na 洛莫司汀 0.00-6.27% 阿那曲唑 2.29209.64% 羟基脲 0.00-0.70% 奈达铂 2.27154.06% 卡莫司汀 -0.01-6.

24、00% 曲普瑞林 2.0030.23% 氮芥 -0.01-17.67% 戈舍瑞林 1.9560.98% 司莫司汀 -0.01-19.44% 伊马替尼 1.8054.13% 门冬酰胺酶 -0.02-3.06% 群司珠单抗 1.7887.68% 阿柔比星 -0.02-9.45% 榄香烯 1.7580.83% 长春新碱 -0.03-11.67% 表柔比星 1.728.25% 去甲斑蟊素 -0.03-5.84% 依西美坦 1.55372.84% 靛玉红 -0.04-100.88% 氟尿苷 1.45na 优福定 -0.04-53.18% 氟尿嘧啶 1.07125.79% 复方五氟尿嘧啶多相 脂质体 -0

25、.06-55.70% 氟达拉滨 0.9554.01% 美法仑 -0.07-93.78% 重组人血管内皮抑 制素 0.93na 甘氨双唑钠 -0.11-6.00% 替莫唑胺 0.80na 替尼泊甙 -0.12-11.74% 硝卡芥 0.7682.60% 亚砷酸 -0.13-10.21% 乌苯美司 0.7220.14% 他莫昔芬 -0.15-12.49% 白消安 0.59516.10% 托泊替康 -0.16-37.56% 重组改构人肿瘤坏 死因子 0.57155.81% 苯丁酸氮芥 -0.16-34.31% 硼替佐米 0.57na 六甲密胺 -0.19-63.39% 伊达比星 0.5223.72%

26、 甲基斑蝥胺 -0.19-100.00% 西妥昔单抗 0.51na 平阳霉素 -0.24-29.30% 肿节风 0.4832.16% 华蟾素 -0.25-4.75% 托瑞米芬 0.4730.00% 卡莫氟 -0.27-24.38% 阿糖胞苷 0.4214.06% 丝裂霉素 -0.33-30.52% 氟他胺 0.3611.07% 依托泊甙 -0.36-32.82% 替加氟 0.3610.63% 达卡巴嗪 -0.42-21.91% 亮丙瑞林 0.2912.90% 博来霉素 -0.43-38.13% 鸦胆子油 0.256.58% 异环磷酰胺 -0.45-9.81% 长春地辛 0.2225.84% 卡

27、铂 -0.46-10.26% 维甲酸 0.1786.01% 米托蒽醌 -0.47-40.01% 络铂 0.16-7727.24% 顺铂 -0.56-14.01% 复方氟尿嘧啶 0.15417.58% 去氧氟尿苷 -0.59-26.95% 去基斑蝥胺 0.13na 斑蝥酸钠/维生素 b6 -0.97-100.00% 环磷酰胺 0.1015.93% 羟基喜树碱 -1.38-26.90% 重组人 p53 腺病毒 0.10na 氟尿嘧啶脱氧核苷 -2.17-100.00% 尼莫司汀 0.0724.87% 多柔比星脂质体 -2.17-100.00% 柔红霉素 0.0710.97% 薏花仁油 -3.06-

28、20.41% 福莫司汀 0.05103.26% 长春瑞宾 -3.25-25.41% 巯嘌呤 0.02107.77% 吡柔比星 -3.41-25.45% 3.单抗药物治疗肿瘤的研究进展 抗肿瘤单抗药物研究已取得多方面进展，研究结果为应用于肿瘤治疗的可 行性提供了重要依据。 单抗药物对肿瘤细胞的选择性杀伤作用研究结果表明，单抗与药物偶联 物或与毒素偶联物对肿瘤靶细胞显示选择性杀伤作用，对表达有关抗原的肿瘤 细胞作用强，对抗原性无关细胞的作用弱或无作用。研究还表明，单抗药物偶 联物对肿瘤细胞的杀伤活性比无关抗体偶联物的活性强；药物与单抗偶联后对 肿瘤靶细胞的活性比游离药物强。这种选择性杀伤作用是单抗

29、药物用于肿瘤治 疗的重要基础。免疫电镜观察可见单抗或单抗偶联物能结合到细胞表面，经过 受体介导的内化过程进入细胞。结合到肿瘤靶细胞表面的数量多，到非靶细胞 的数量少；进入靶细胞内的数量多，进入非靶细胞内的数量少。这种特异性结 合和内化进一步阐明了单抗或单抗偶联物对靶细胞选择性杀伤作用的机制。 单抗药物具有更高的疗效由抗人体肿瘤的单抗与药物构成的偶联物对移 植于裸鼠的相应人体肿瘤生长有抑制作用。偶联物与相应的游离药物比较，一 般具有更高的疗效或显示较低的毒性。曾与单抗进行偶联并在裸鼠进行疗效观 察的抗癌药物有阿霉素、柔红霉素、平阳霉素、博安霉素、丝裂霉素、新制癌 菌素、氨甲蝶呤、苯丁酸氮芥、苯丙

30、氨酸氮芥、顺铂以及长春碱类衍生物等。 使用的肿瘤模型包括肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、乳癌、卵巢癌、脑胶质瘤、 黑色素瘤、淋巴瘤和白血病等。来源于植物或细菌的毒素，由于有强烈毒性， 很难作为治疗剂使用；但毒素(或单链毒素)与单抗的偶联物可在动物模型显示 疗效。研究表明，单抗药物在动物体内呈特异性分布。静脉内注射抗肿瘤单抗， 在肿瘤部位的浓度较高，显示特异性定位。单抗与药物的偶联物通常仍保留原 来单抗的分布特征，在靶肿瘤的浓度较高。确定单抗或单抗偶联物在体内具有 靶向性，为进一步阐明其疗效提供了依据。 单抗药物对肿瘤相关靶点的特异性作用特定受体或特定的基因表达蛋白 可能作为单抗药物的靶点。ritux

31、an 是以 b 细胞的 cd20 分子为靶点的人鼠嵌合 抗体，对非霍奇金 b 细胞淋巴瘤有疗效，是第一个获美国 fda 批准用于治疗恶 性肿瘤的单抗。herceptin 是抗 her-2/neu 癌基因编码蛋白的单抗，临床研究 对乳腺癌有效，与化疗药物联合有更显著的疗效，亦已获批准用于治疗肿瘤。 表皮细胞生长因子受体(egfr)在人鳞癌、乳腺癌和脑胶质瘤等均有较高的表达。 有报道，抗 egfr 单抗与长春碱衍生物的偶联物在裸鼠体内试验显示良好的抗 癌效果。抗 egfr 的人鼠嵌合抗体已进入临床研究。转铁蛋白受体在某些肿瘤 有较高的表达。抗转铁蛋白受体单抗构成的免疫毒素对脑瘤细胞有高度细胞毒 性

32、；高度恶性的肿瘤对免疫毒素的敏感性更高。在人体乳腺癌和卵巢癌常见 her-2 基因扩增而且相应的 her-2 蛋白含量增高。抗 her-2 蛋白单抗与抗 egfr 单抗联合使用对卵巢癌细胞的作用增强，显示相加的抗增殖作用。cd30 受体在 霍奇金淋巴瘤的肿瘤细胞高度表达，可以作为免疫毒素攻击的靶点。近年来， 以血管内皮细胞为靶点的单抗药物受到广泛关注。实体瘤的生长与血管密切相 关，肿瘤细胞增殖如果缺乏相应的血管新生成将不能发展为肿瘤。以内皮细胞 为靶点的单抗药物，抑制血管新生成，可能达到抑制肿瘤生长的目的；而且静 脉注射的单抗药物也易于到达靶部位(内皮细胞)，不需要穿越细胞外间隙到达 实体瘤深

33、部的肿瘤细胞。血管内皮生长因子(vegf)在血管生成中有重要作用。 据报道，抗 vegf 的中和性单抗具有广谱的抗肿瘤作用，对移植于裸鼠的人体癌 瘤有显著疗效。 单抗药物对抗药性肿瘤细胞的杀伤作用单抗偶联物对于抗药性肿瘤细胞 仍显示较强的杀伤活性。对于长期使用氨甲蝶呤而出现抗药性的成骨肉瘤细胞， 单抗氨甲蝶呤偶联物仍显示较强的杀伤作用。对于具有多药抗性(mdr)的肿瘤细 胞，抗 p-170 糖蛋白单抗构成的免疫毒素可显示选择性杀伤作用。说明单抗药 物有可能用于克服肿瘤细胞抗药性。 4.免疫球蛋白的结构和功能 （一）免疫球蛋白的基本结构 四肽链结构 所有 ig 的基本单位都是四条肽链组成的对称结

34、构。两条重链（h）和两条 轻链（l） 。 每条重链和轻链分为氨基端和羧基端。 1.人类 ig 根据其重链稳定区的分子结构和抗原特异性的不同，分为五类： 类别与重链对应关系如下 分类： igg、iga、igm、igd、ige， 重链： 、 、 、 、 2.轻链可分为两型：、 型 根据氨基酸排列顺序的不同分为可变区（v）和恒定区（c） 。 （1）可变区 ：重链（h）近氨基端 1/4 或 1/5 区域内的氨基酸，轻链 （l）近氨基端 1/2 区域内的氨基酸多变称可变区。 高变区：vh 和 vl 各有 3 个区域的氨基酸组成和排列顺序特别易变化，这些 区域称为高变区。 三个高变区共同组成 ig 的抗原

35、结合部位，该部位也称为互补性决定区 （2）恒定区 重链和轻链的 c 区分别称为 ch 和 cl，不同类 ig 的重链 ch 长度不一，同一 种属动物中，同一类别 ig 分子（如 igg）c 区氨基酸的组成和排列顺序比较恒 定。 铰链区 位于 ch1 与 ch2 之间，含有丰富的脯氨酸，因此易伸展弯曲，而且易被木 瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解。 图表 4 免疫球蛋白的基本结构 （二）免疫球蛋白的功能区 免疫球蛋白多肽分子通过反复折叠形成的球形结构称免疫球蛋白的功能区 每个功能区约由 110 个氨基酸组成，其氨基酸的序列具有相似形或同源性。 其二级结构是反向平行的 片层 轻链分 vl 和 cl 重链分

36、 vh 和 ch 。 不同类 ig 的重链 ch 长度不一， igg、iga、igd 有 ch1.ch2.ch3。 igm、ige 分 ch1.ch2.ch3.ch4 功能区的作用： vh 和 vl 是结合抗原的部位； ch 和 cl 上具有部分同种异型的遗传志； igg 的 ch2 和 igm 的 ch3 具有补体 c1q 结合位点，可启动补体活化经典途 径； igg 可通过胎盘； igg 的 ch3 可结合细胞表面的 fcr； ige 的 ch2 和 ch3 可与肥大细胞和嗜碱性粒细胞的 ige fc 受体结合。 （三）免疫球蛋白的水解片段 木瓜蛋白酶水解 igg 得到两个相同的 fab

37、段和一个 fc 段。 图表 5 免疫球蛋白的木瓜蛋白酶水解示意图 胃蛋白酶裂解 igg 得到一个具有双价活性的 f（ab ）2 段和若干个小分子 多肽碎片（pfc ） 图表 6 免疫球蛋白的胃蛋白酶裂解 图表 7 免疫球蛋白的胃蛋白酶裂解 （四）j 链和分泌片 j 链：j 链是一条多肽链，富含半胱氨酸，由浆细胞合成。连接 ig 单体使 其成为多聚体分泌片：由黏膜上皮细胞合成和分泌，以非共价形式结合到二聚 体上，并一起被分泌到黏膜表面。对分泌型 iga 具有保护作用 图表 8 igm 和分泌型 iga 的结构示意图 图表 9 人分泌型 iga 和 igm 的局部产生示意图 免疫球蛋白的功能 （一

38、）v 区的功能： 主要功能是识别和特异性的结合抗原. ig 单体可结合两个抗原表位，为双价 ab +ag发挥免疫效应 b 细胞膜表面的 igm 和 igd 是 b 细胞识别抗原的受体 （二）c 区的功能： 1.激活补体 igm，igg13 + ag 经典途径激活补体 igg4.iga、ige 的凝聚物可经旁路途径激活补体 2.结合细胞表面的 fc 受体 （细胞亲嗜性） 3.调理作用：颗粒性抗原-igg 促吞噬细胞的吞噬 5. adcc 作用：肿瘤细胞等与 igg 结合,与 nk.吞噬 细胞 fc 受体结合,增强 其对靶细胞的杀伤作用 6.介导 i 型超敏反应：ige 穿过胎盘和黏膜 图表 10

39、 免疫球蛋白的功能示意图 图表 11 抗体的调理吞噬作用示意图 图表 12 i 型超敏反应的发生机制示意图 图表 13 抗体依赖性细胞介导的细胞作用 在近 20 年深入研究和临床试验之后,单抗用于治疗癌症逐渐受到重视,并 从临床试用阶段转变为美国 fda 批准的商品。本文介绍 2 种 1998 年底批准的 非放射标记性单抗,同时,第 3 种单抗在德国已经获批准,正在进行大规模临床 试验。 三单克隆抗体产品介绍三单克隆抗体产品介绍 （一）. 美罗华 美罗华( rituximab ; rituxan) 是第一个获准用于治疗人类肿瘤的单抗产 品,于 1997 年 11 月获 fda 批准,现有资料提

40、示,该药对大多数 b 细胞淋巴瘤都 有活性。 美罗华是利用重组 dna 技术将鼠源免疫球蛋白( ig) 的可变区与人免疫球 蛋白 g1 恒定区结合的鼠 p 人嵌合抗体,可在中华仓鼠卵巢细胞中大量产生。研 究发现,美罗华与正常和恶性 b 淋巴细胞的 cd20 受体发生反应,而不与任何非 造血组织和 b 细胞前体、浆细胞、t 淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞或干细 胞发生反应。抗体与 cd20 阳性细胞结合,在补体和效应细胞存在情况下发生溶 细胞反应。另有证据表明,cd20 是一个很重要的阻止凋亡发生的钙离子通道受 体;抗体与 cd20 受体结合可促进凋亡。有理由认为,在已观察到的抗肿瘤机制 中,与

41、 cd20 受体结合的反应比免疫途径更重要。 美罗华的临床试验始于 1993 年。每周给药 1 次共 4 周的方法在低度恶性 b 细胞淋巴瘤(按工作分类为 ad) 有效率为 47 % 。在一项 166 例化疗后进 展的低度恶性淋巴瘤患者进行的试验中,美罗华治疗滤泡型淋巴瘤有效率约 60 %。 对工作分类 a 亚组小淋巴细胞型、慢性淋巴细胞白血病样(cll2like) 和 waldenstroms 样淋巴瘤有效率为 10 %15 % ,中位缓解时间 13. 2 个月, 至少 87 %的患者有可测量的肿瘤退缩。药代动力学研究显示:血中美罗华水平 通常在治疗后持续升高 36 个月。一些患者肿瘤退缩缓

42、慢,延迟至数月后才出 现肿瘤缩小。血中药物浓度持续时间与肿瘤缓解可能性有关。 美罗华的疗效,与患者年龄、ldh 水平、2 微球蛋白水平或以前使用蒽环 类药物无关。与骨髓受侵、结外受侵、巨块型患者相比,肿瘤负荷小的疗效更好。 在有效率最高的亚组患者中包括以前行干细胞移植后复发的患者,有效率为 73 %(18p23) 。对如此高有效率可能的解释是:这些患者治疗开始时肿瘤负荷小,因 为对这些移植后患者观察密切,一旦复发即得到治疗,且事实上所有患者均为滤 泡型淋巴瘤。滤泡型和非滤泡型低度恶性淋巴瘤有效率的不同与抗原表达水平 有关,滤泡型表达水平高。美罗华的主要不良反应包括发热、寒战、皮疹、恶心、 喉部

43、痉挛、呼吸困难和低血压。这些症状仅为轻至中度,多数发生在第 1 次治 疗时。这些毒性的发生机制似乎是由于美罗华与循环中 cd20 阳性 b 淋巴细胞 (包括正常和恶性淋巴细胞) 发生反应所致。除非患者循环中 b 淋巴细胞在治 疗前已用美罗华耗尽,否则,不同程度的类似反应都会发生。这是一种血循环中 b 淋巴细胞上特异性抗原抗体结合反应的结果,并不是抗体本身的问题。一些与 循环中 b 细胞无交叉反应的抗实体瘤鼠源抗体即使用量以 g 计算快速静脉给药 也无任何毒副作用。另一方面,快速输入与循环中 b 细胞发生反应的大剂量单 抗可导致严重反应,包括严重低氧血症、重度低血压及死亡。对肾功能衰竭、肝 硬化

44、、一般情况差的患者,尤其容易出现与该反应有关的威胁生命的并发症。淋 巴细胞计数超过 5 000 个l - 1 的患者(即这组患者可能会出现强烈的反应) 及上述有严重内科情况的患者可用美罗华治疗,但建议第 1 次治疗开始时输注 速度应减慢甚至少于 50mgh - 1 。这种反应通常在治疗后 30min2h 以后才 会出现,但也可在抗体输注的几分钟内发生。 2、对美罗华有效的患者再次治疗时的安全有效性 一组 60 例患者的研究表明,初次接受美罗华治疗后达到完全缓解或部分缓 解者,复治有效率达 41 % ,中位有效期大于 10 个月。毒性与初治时相似,包括 已知的在首次给药时与循环中 b 细胞发生反

45、应引起的相关毒性。有时效果比初 治时更好更持久,这可能与患者在复治时肿瘤负荷更小有关。再次治疗无效不仅 与 cd20 表达丢失无关,而且与宿主产生针对抗体的免疫反应也无关。对美罗华 耐药很可能与缺乏依赖 cd20 受体抗凋亡效应有关,此效应由 cd20 受体提供给 细胞。这不但可解释为什么淋巴瘤患者对初次化疗无效,而且还提示对美罗华的 有效率也相对较低。此外,有较长病史的滤泡型淋巴瘤患者即使对化疗无效,也 可能对美罗华有效。 3、美罗华对荷有大肿块进展缓慢的淋巴瘤的作用 早期的研究将肿瘤直径大于 7cm 的患者排除在外,尽管在肿瘤直径 57cm 的患者中也有大约 40 %的有效率,但倾向于肿瘤

46、越小有效率越高。在一项 31 例 肿瘤直径大于 10cm 的患者研究中,总有效率 48 % ,其中 55 %为滤泡型淋巴瘤, 占治疗组的大部分。研究资料提示,任何单个病灶的大小并不象肿瘤负荷和 cd20 的表达水平那样重要。 4、抗体剂量与有效率的关系 在一项低度恶性淋巴瘤试验中, 患者接受 8 周治疗, 有效率大约 60 % ,但 尚不清楚是否效果更持久。 5、美罗华对低度恶性淋巴瘤化疗效果 在一项 38 例低度恶性淋巴瘤研究中,80 %为初治,用美罗华联合环磷酰胺+ 阿霉素+ 长春新碱+ 泼尼松方案(chop) 治疗,有效率为 100 %,中位无进展生存 大于 2. 5 年。与单用 cho

47、p 和单用美罗华相比,毒性没有增加。美罗华给药的 准确时间并不重要,化疗同时维持血循环和组织中抗体浓度可能更重要。 6、美罗华对中度恶性淋巴瘤的疗效 法国一项 54 例患者临床试验 8 ,12 例套区(mantle zone) 淋巴瘤和 30 例大细胞淋巴瘤,总有效率为 31 % ,中位缓解期大于 8 个月。套区淋巴瘤有 效率为 30 % ,大细胞淋巴瘤为 37 %。这是一项随机的期试验,2 组患者均接 受 8 周的抗体的治疗。一组接受 375mgm- 2 ,每周 1 次共 8 周,另一组在第 1 周给予标准剂量后,第 28 周给予 500mgm- 2 ,每周 1 次,2 组有效率无 差异。

48、7、美罗华对中度恶性淋巴瘤化疗的效果 一项 31 例中度恶性淋巴瘤患者的试验,其中 19 %为大细胞滤泡型淋巴瘤 (工作分类 d) ,68 %为大细胞弥漫性淋巴瘤(工作分类 g) ,所有患者均为初治。 在这些患者中联合应用 chop 和美罗华,结果与低度恶性淋巴瘤患者一样,毒性 无增加。客观有效率高达 96 % ,其中 63 %完全缓解和 33 %部分缓解。这项研 究方法为,在每周期 chop 治疗前 48h 输注美罗华,3 周为 1 周期。 8、美罗华对慢性淋巴细胞性白血病( cll) 的疗效 关于这方面从理论上涉及 2 个问题。一是由于循环中淋巴细胞计数过高而 导致可能的毒性,另外大多数

49、cll 细胞 cd20 表达水平过低而可能基本无毒性反 应,也无显著的抗肿瘤效果。最近的报道证实了第一种情况,即在血淋巴细胞计 数高的患者中发生了 34 度毒性。一项研究还观察到,出现严重反应的患者, 其血中白介素 6 和肿瘤坏死因子水平明显提高。剂量爬坡试验证明,淋巴结中 淋巴细胞增多的情况有一定程度减少,但该效果持续时间有限。治疗淋巴细胞计 数高的 cll 患者的美罗华用量可能因经济原因而难于实现。更好的策略是寻求 将该抗体用于其他方式治疗有效后的维持或巩固治疗。 9、美罗华对类巨球蛋白血症淋巴浆细胞样淋巴瘤( waldenstroms l ike lymphoplasmacytoid l

50、ym2phoma) 的疗效 与 cll 和小 b 细胞淋巴瘤有所不同的是,这组疾病相关的 b 淋巴细胞 cd20 表达水平高。而且,尽管这组患者通常血中恶性 b 淋巴细胞克隆增加,但淋巴细 胞的数量远不象 cll 中那么多。一项 7 例患者的报道中,有 4 例客观肿瘤缓解,未 发现更多的毒性反应。 chop 和 chop 加美罗华的临床随机对比试验正在进行。在大剂量化疗加自 体造血干细胞移植的试验中,正在评价干细胞收集前行 cd20 阳性细胞体内净化,以 及骨髓功能恢复后应用美罗华行巩固治疗的价值。因为 cd20 在 cll 的淋巴细 胞和浆细胞上表达微弱,对化疗有效的 cll 和骨髓瘤患者用

51、美罗华行探索性巩 固治疗的试验正在进行。由于美罗华对复发患者有效,用该药进展缓慢型淋巴瘤 首次治疗效果的评价正在进行中。最近,该抗体正在用于与艾滋病相关的淋巴瘤 或中枢神经系统淋巴瘤的治疗,而这两组患者在最初的试验中是被排除在外的。 （二）herceptin herceptin( trastuzumab) 是一种重组 dna 衍生的人源化单抗,是 fda 1998 年 10 月第一个批准用于治疗实体瘤的单抗。基础资料是用该药治疗转移 性乳腺癌中高度表达 her22pneu 受体的患者。该药可能对高度表达 her22pneu 受体的其他肿瘤也有活性。her22pneu 是一个 185kd 的跨膜

52、受体,结构与表皮 生长因子(egf) 受体高度同源。过度表达 erbb2 原癌基因导致 her22pneu 受体 在细胞表面过度表达和加速细胞增殖。herceptin 是一种与 p185her22pneu 受 体发生反应的鼠 p 人免疫球蛋白 igg1 嵌合抗体。通过重组 dna 技术在中华仓 鼠卵巢细胞中产生。hercep2tin 与受体结合导致受体内在化,并抑制 egf 和 neu 分化因子与受体结合。这种抑制作用影响磷酸化及细胞增殖信号的传导通 道。此外,还可以在体外介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(adcc)。 herceptin 的药代动力学研究表明,每一次短时间静脉注射 10 ,

53、50 ,100 ,250 ,500mg 均显示出剂量依赖性。随着剂量的提高,平均半衰期延长并且清除 减少,10 和 500mg 剂量水平的半衰期分别为 1. 7d 和 12d。在推荐负荷剂量每 周 250mg ,然后静脉注射 100mg ,中位稳态血药浓度为 59. 7gml - 1 ,中 位清除半衰期为 6. 2d。 在 46 例过度表达 her22pneu 的转移性乳腺癌患者中,采用每周 1 次注射给 药。第 1 周静脉给予负荷量 250mg ,然后,每周 1 次静脉注射 100mg ,共 10 周。 肿瘤客观缓解率为 12 %(5p43) ,包括 1 例 cr 和 4 例 pr。herc

54、eptin 和顺铂 联合治疗了 37 例转移性乳腺癌,抗体首次剂量为 250mg ,然后 100mg 每周 1 次 静脉注射共 9 周; 顺铂为 75mgm- 2 ,d1 ,d29 和 d57 。肿瘤客观缓解率为 24 %(9p37 ,均为部分缓解) ,中位缓解时间 5. 3 个月。毒性与二药单用大致 相同。 fda 批准的基础资料包括 222 例以前化疗后进展的转移性乳腺癌和 469 例 未治疗过的转移性乳腺癌,所有患者 her22 表达为 2 + 或 3 + 。均接受 herceptin 负荷量 4mgkg - 1 ,然后每周给予 2mgkg - 1 。如果没有发生 输液相关毒性反应,第

55、1 次输注时间为 90min ,以后治疗输注 30min。 222 例化疗失败患者参加的是开放性非随机试验,其中 66 %以前接受过辅助 化疗,68 %因转移至少接受过 2 种化疗方案,25 %大剂量化疗加自体造血干细胞 解救后复发。采用 i 期临床研究推荐的给药方法,8 例获 cr ,26 例获 pr ,有 效率 15 %,中位缓解时间为 9. 1 个月,中位生存期 13 个月。在 her22 (3 + ) 的患者疗效为 18 % ,her22 (2 + ) 患者有效率为 6 %( p = 0. 06) 。 vogel 等报道,herceptin 单药一线治疗 112 例 her22pneu

56、 高表达的晚期乳 腺癌患者,给药方法有 2 种,一种采用 i 期推荐的给药方法,另一种负荷量每周 8mgkg - 1 ,静滴 90min ,直至肿瘤进展。二剂量组在疗效上无差别。共 6 例 cr ,20 例 pr ,有效率 30 %。中位缓解期 8 个月,中位生存期 13 个月,其中 her22pneu (3 + ) 者有效率达 31 %。469 例以前未接受过化疗的患者随机分 入化疗组或不加 herceptin 组,动物研究提示,在抗体存在的情况下,可增加化 疗药的细胞毒作用。将以前未接受过蒽环类化疗的患者随机分为单用抗体或抗 体加多柔比星(60mgm- 2 ) 和环磷酰胺( 600mgm-

57、 2 ) 静脉注射每 3 周 1 次,共 6 周期。以前辅助治疗时曾用过蒽环类药物者被随机分为单用单抗或抗 体加紫杉醇 175mgm- 2 ,静脉点滴 3h ,每 3 周 1 次。 图表 14 her22 表达与转移性乳腺癌的疗效和无进展生存时间的关系 估计仅 25 %30 %转移性乳腺癌患者过度表达 her22。因此,适于临床试验 的所有转移性乳腺癌患者中 17 %25 %= 4 %可能有望在化疗后疾病进展时对 herceptin 有效。与单用化疗相比,化疗加 her2ceptin 治疗的患者有效率更高,且 缓解期更长,提示在治疗乳腺癌时最好是与化疗联合应用而不是单用。在这些试 验中与 he

58、rceptin 相关的急性毒性见下表。 图表 15 herceptin 单用或与化疗联合的毒性及不良反应 单独使用 herceptin 观察到的毒性类型和发生频率与许多单抗一样,尤其类 似于与循环细胞的抗原反应。egf 受体家族表达于许多循环细胞,如激活的淋巴 细胞。假设这些细胞在网状内皮系统被快速清除,而这种清除又与细胞因子的释 放有关,就可以解释这些症状。因为这些受体在与单抗连接之后是被调节的(内 在化或细胞内摄作用) ,组织中的细胞被抗体饱和,导致抗原下调。当这些细胞 进入循环中,因为细胞表面抗原极少,它们在网状内皮系统中不被清除。因此,除 非在输注开始后很快测量,否则是测量不到的。毒性

59、在第 1 次输注单抗后最明 显,在以后的治疗中只要保持同样血清单抗水平就不会发生毒性。 与 herceptin 相关的主要的远期毒性是心功能紊乱,可能是因为受损心肌修 复期间 her22 表达增加所致。资料表明,心脏毒性在使用紫杉醇时并不增加,但 adm ,ctx 加 herceptin 可增加心脏毒性。这可能与化疗药尤其是 adm 与单抗 之间协同效应有关,而且可能与 adm 输送到心肌的量增加有关,因为 adm 与单抗 之间有疏松连接。这样看来,herceptin 与紫杉类联用时比与蒽环类联用更安全。 在近来研究的基础上,建议对 her22pneu 表达和淋巴结均为阳性的乳腺癌辅助 治疗先

60、用 adm +ctx ,然后用 herceptin + 紫杉醇。在过度表达 her22pneu 的 患者中行大剂量化疗加干细胞移植后使用 herceptin 也可能是合理的。 her22pneu 在许多肿瘤中均有过度表达,包括前列腺癌和卵巢 2123 。过 度表达 her22pneu 的患者在理论上都可作为应用 herceptin 的临床试验的入选 者。 （三）1721a 1721a 单抗( edrecolomab panorex ; centocor ,malvern ,pa) 是一 个鼠源 igg2 单抗,可与在各种腺癌和正常上皮组织中发现的一个 37 103 40 103 球蛋白发生反应