实验三、从琼脂糖凝胶中回收并纯化DNA

1、实验三：从琼脂糖凝胶中回收并纯化DNA片段生技 1101 112301103 顾晨一 实验目的学习经琼脂糖凝胶电泳分离后回收并纯化 DNA片段的方法二实验原理将DNA羊品在琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切割下含目的 DNA 片段的凝胶块； 在高盐和促溶剂的作用下， 琼脂糖聚合物中糖之间的 氢键断裂而迅速溶解，DNA就从胶基质中释放出来并选择性地吸附到 球状的硅胶颗料或特定的柱子上；然后用高盐缓冲液洗涤除去残余的琼脂糖， 再用含乙醇的缓冲液洗去盐和染料。最后用TE缓冲液或水将球状硅胶颗粒或柱子上的 DNA 洗脱下来。回收纯化后的DNA可直接用于DNA勺连接反应、标记反应、 测序反应或DNA的微量注

2、射等研究。三实验材料1. 水浴锅、离心机、移液器2. PCR扩增的Rv1791基因3. Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0( Taraka )四实验步骤(1) 实验三中的PCF产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。(2) 在紫外灯下切出含有目的 DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶 表面的液体。尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高 DNA回收率。切胶时不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止 DNA损伤。(3) 切碎胶块。胶块切碎后可以减少步骤6的胶块融化时间，提高 DNA勺回收率。(4) 称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1

3、mg=1卩 l进行计算。(5) 向胶块中加入3倍凝胶体积的胶块融化液DR-I Buffer。(6) 均匀混合后75C加热融化胶块，此时应间断振荡混合，使胶 充分融化(约610min)。(7) 向上述胶块融化液中加入 DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-IIBuffer，均匀混合。当分离小于400 bp的DNA片段时，应在此溶液 中再加入终浓度为20%勺异丙醇。(8) 离心柱放入收集管中，将步骤7的溶液转移至离心柱中，12,000 rpm, 1mi n,弃滤液。如将滤液再加入离心柱中离心一次，可以提高DNA勺回收率。(9) 将500卩l的Rinse A加入离心柱中，12,000 rpm

4、, 30s，弃滤 液。(10) 将700卩l的Rinse B加入离心柱中，12,000 rpm , 30s，弃 滤液。(11) 重复操作步骤10，将离心柱放入收集管中，12,000 rpm, 1min。(12) 将离心柱放入新的指形管中，在离心柱膜的中央处加入25卩l的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1min。注)把灭菌蒸馏水或 Elution Buffer 加热至60C使用时有利于提高洗脱效率。(13) 12,000 rpm , 1min,洗脱 DNA五实验结果根据电泳结果，描述对DNA片段回收的结果与效率。回收效率较低。实验时操作不够到位六、思考题凝胶抽提法回收纯化DNA片段的原理是什么？将DNA羊品在琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切割下含目的DNA片段的凝胶块； 在高盐和促溶剂的作用下, 琼脂糖聚合物中糖之间的 氢键断裂而迅速溶解，DNA就从胶基质中释放出来并选择性地吸附到 球状的硅胶颗料或特定的柱子上；然后用高盐缓冲液洗涤除去残余的琼脂糖, 再用含乙醇的缓冲液 洗去盐和染料。最后用TE缓