长链非编码RNA的作用机制及其研究方法_夏天汇总

1、或自 hereditas (beijing) 2013 年 3 月，35(3): 269280issn 0253-9772 doi: 10.3724/sp.j.1005.2013.00269长链非编码rna的作用机制及其研究方法夏天，肖丙秀，郭俊明宁波大学医学院生物化学与分子生物学研究所，浙江省病理生理学技术研究重点实验室，宁波315211摘要：长链非编码 rna（long non-coding rna, lncrna）通过多种机制发挥其生物学功能，这些机制包括基因印记、染色质重塑、细胞周期调控、剪接调控、 mrna降解和翻译调控等。lncrna通过这些作用机制

2、在不同 水平进行基因表达调控。在研究lncrna功能的过程中，研究方法的建立和应用起着非常重要的作用。目前用于lncrna研究的主要方法有：微阵列、转录组测序、northern印迹、实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应、荧光原位杂交、rna干扰和rna结合蛋白免疫沉淀等。文章着重介绍了3种前沿方法，即：在线快速预测 rna与蛋白质相互作用的catrapid、rna 纯化的染色质分离 （chromatin isolation by rna purification, chirp） 以及非编码 rna 沉默与定位分析技术 （combined knockdown and localization ana

3、lysis of non-coding rnas, c-klan） ,关键词：长链非编码 rna;作用机制；基因表达调控；研究方法acting mechanisms and research methods of long noncoding rnasxia tian, xiao bing-xiu, guo jun-mingdepartment of biochemistry and molecular biology , ningbo university school of medicine , zhejiang provincial key laboratory of pathophys

4、iology ,ningbo 315211, chinaabstract:long non-coding rnas (lncrnas) play biological roles through a variety of mechanisms, including geneticimprinting, chromatin remodeling, cell cycle control, splicing regulation, mrna decay, and translational regulation.lncrnas are involved in the regulation of ge

5、ne expression through the above mechanisms in different levels. establishment and application of research technologies are important in understanding of lncrnas functions. microarray, rna sequencing, northern blot, real time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, fluorescence

6、in situ hybridization, rna interference, and rna-binding protein immunoprecipitation are major tools of exploring biological functions of lncrnas. here, we highlighted three advanced methods, i.e., fast predictions of rna and protein interactions and domains (catrapid), chromatin isolation by rna pu

7、rification (chirp), and combined knockdown and localization analysis of non-coding rnas (c-klan).keywords:long non-coding rnas (lncrnas); acting mechanisms; gene expression regulation; research methods收稿日期：2012 08 08;修回日期：2012 09 20基金项目：国家自然科学基金项目（编号：81171660）,宁波市自然科学基金项目（编号：2012a610207）,宁波市科技创新团队项目

8、（编号:2011b82014）,宁波市重点学科项目（编号：xkl11d2127）和宁波大学优秀学位论文培育基金项目（编号：py2012004）资助作者简介：夏天，硕士研究生，专业方向：肿瘤分子生物学。 tel: e-mail: summer_通讯作者：郭俊明，教授，博士，研究方向：肿瘤分子生物学。e-mail: 网络出版时间：2012-12-21 13:33:08url: /kcms/detail/11.1913.r.20121221.1333.001.html19q4

9、-2013 china academic janmal electronic publishing huuse. al rights 第3期夏天等：长链非编码 rna的作用机制及其研究方法271电电笺电与344%与选泡勾勾飞盘%盘是七% 发表年份80o o o o6 4 2长链非编码 rna(long non-coding rna, lncrna) 是长度大于200个核甘酸的非编码 rna1。研究表 明，lncrna 在剂量补偿效应 (dosage compensation effect)、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调 控等众多生命活动中发挥重要作用26。ln

10、crna相关论文发表量近年来成倍增加(图1);我国国家自然科学基金资助的 lncrna相关课题从 2010年的3项，至ij 2011年的25项，再至ij 2012年的 70多项(科学基金网络信息系统2/portal/proj_search.asp),这些数据表明国内外研 究者对该领域的关注度日益增高。正因如此 ，我们 对lncrna的了解也越来越深入一一它们具有丰富 多样的生物学功能：参与 x染色体的失活7,调控 mrna的降解网，构成细胞核亚结构的结构骨架9,作为染色 质重塑(chromatin remodeling)的调控因 子10, 11等。本文将概

11、述lncrna发挥生物学功能的 作用机制，并介绍开展lncrna研究的前沿方法。1 lncrna 的分类和相关数据库lncrna具有类型多、作用模式多和数量多的 “三多”特点12。根据lncrna与蛋白质编码基因 的位置关系，可将它们分为重叠型、顺式反义型、 双向型和内含子型等13;而根据lncrna的功能， 则可将其分为信号分子(signal molecule)、诱饵分子120 f100 h(decoy molecule) 引导分子(guide molecule)和骨架 分子(scaffold molecule)等 4 类分子 14。为了便于研究和学术交流，相关研究人员已经建 立了多个lnc

12、rna数据库(表1)。这些数据库1520所收 录的lncrna数据来自genbank和已发表的论文。 最近，研究者开始从全基因组角度关注lncrna 21。khalil等22的研究表明，哺乳动物基因组编码上千 种长链基因间非编码 rna(large intergenic non-coding rna, lincrna)。这些 lincrna 属于 lncrna 成员中 的一大类，参与细胞周期调控、免疫监视、胚胎干细 胞多能性分化等多种生物学过程22。chu等23通过 rna 纯化的染色质分离(chromatin isolation by rna purification, chirp)技术获得

13、了许多lncrna在全基 因组范围内的高分辨率定位图谱，并发现lncrna大量聚集于特定的dna结合基序上。cabili等24综合了已经注释其功能的lincrna数据和他们实验室收集的转录组测序(即rna测序(rna sequencing, rna-seq)数据，发现4 662种lincrna中的大多数 具有高度的组织特异性，说明它们在疾病诊断上具 有较好的应用前景。2 lncrna 的作用机制图1 lncrna相关文章的发表量数据基于美国国家生物技术信息中心的搜寻引擎pubmed的检索结果，检索词为long noncoding rna 及long non-coding rna时间限定为每年的

14、1月1日到12月31日。研究表明,lncrna发挥生物学功能的主要机制 有基因印记(genetic imprinting) 染色质重塑、细胞周期调控、剪接调控、mrna降解和翻译调控等8, 11, 2534 (表 2)。表 1 lncrna相关数据库数据库名称网址参考 文献noncodingrna databasehttp:/biobases.ibch.poznan.pl/ncrna/ 15frnadb /frnadb/ 16nred.au/nred/cgi-bin/ncrnadb.pl17lncr

15、nadb /18ncfans /ncfans/19noncode /noncoderv3/20表2 部分lncrna的生物学功能lncrna名称生物学功能文献h19基因印记25xistx染色体失活26tsix阻断xist积累，维才e x染色体的活性27hotair组蛋白修饰复合体的骨架分子11anril抑制转录28gas5糖皮质激素受体的诱饵29lincrna-p21通过结合转录因子抑制基因表达30panda转录因子的诱饵31hsr w-n调控mrna前体的剪接32s

16、at iii调控mrna前体的剪接32malat1调控丝氨酸/精氨酸剪接因子磷酸化331/2-sbsrna介导mrna降解8bace1-as增加mrna的稳定性342.1 incrna 在基因印记中的作用哺乳动物为二倍体生物，每个基因都是双拷贝， 一些基因的表达取决于来自父本还是母本，这种现象称为基因印记35,该现象涉及基因表达调控的遗 传。h1936、x染色体特异性失活转录物(x inactivationspecific transcription, xist)37等多种 lncrna 参与了 基因印记。h19基因和邻近的胰岛素样生长因子2(insulin-like growth facto

17、r 2, igf2)基因均位于 11p15.5,两个 基因间相距仅90 kb36, 38。h19在脊椎动物胚胎发育 期是高表达的，但出生后大多数组织中的h19表达迅速下调38。igf2是一种重要的生长因子，在脊椎 动物中是高度保守的39。在胚胎发育期，同一发育 阶段的相同组织中，这两种基因的表达模式是相似 的，它们的表达受到共调控阿。在大多数胚胎组织 中，h19和igf2呈现单等位基因表达(monoallelic expression/38, 40。h19和igf2基因之间存在印记控 制区(imprinting control region, icr) 在母源染色体上，icr是未被甲基化的，它

18、作为绝缘子(insulator) 与转录因子ctcf(ccctc-binding factor)结合，从而阻断下游增强子对igf2基因的结合，而使增强子 作用于h19启动子，从而促进h19的表达；然而, 在父源染色体上，由于icr是甲基化的，不能与转录 因子ctcf结合，因此无法发挥绝缘子的作用25, 41, 42。 下游增强子只与igf2基因启动子结合而不与h19图2 h19和igf2基因的印记机制在母源染色体上 icr不被甲基化，所以可以结合化，结果造成这两种基因的表达情况刚好相反。ctcf,结果造成 h19基因表达，而igf2基因不表达；在父源染色体上icr被甲基基因启动子结合，结果促进

19、igf2的表达，抑制h19 基因的表达25, 41,42 (图2)。 1994-2013 china academic journal electronic publijihing house. ah rights reserved.第3期夏天等：长链非编码 rna的作用机制及其研究方法275xist是另一种被人们所熟知的lncrna,它在x 染色体失活中具有重要作用14。在雌性哺乳动物中， x 失活中心(x inactivation center, xic)控制 2 条 x 染色 体中的一条染色体沉默，从而维持剂量补偿效应 囤。 xist基因的5端编码一种称为重复 a(repeat a, r

20、epa) 的lncrna,它可与多梳抑制复合体2(polycomb repressive complex 2, prc2)结合形成复合体，并移 动至xic,然后?敢活xist的表达7, 43。随着xist的转 录并覆盖x染色体，大量组蛋白被甲基化，最终导 致x染色体失活 囤。另一方面，xist的活性受其反义 转录物tsix(反向书写xist而得名)调控，tsix能够有 效阻断xist的积累27,44。因此，tsix的转录对维持 x 染色体的活性是必需的。2.2 lncrna 在染色质重塑中的作用染色质状态是转录活性的关键决定因素之一，涉及核小体结构和组蛋白修饰等45。最近的研究显示，一些lnc

21、rna通过影响染色质状态来调控基因 表达。同源异型框基因反义基因间rna(hox antisense intergenic rna, hotair)转录自同源异型框基 因c(homeobox c, hoxc)位点，通过募集 prc2复 合体，反式抑制hoxd位点的转录46。tsai等11的 研究显示，hotair作为骨架分子发挥作用，其两端 结合不同的组蛋白修饰复合体一 一5端结合prc2复 合体，而3端结合lsd1/corest/rest复合体，即 由赖氨酸特异性脱甲基酶1(lysine-specific deme-thylase 1, lsd1)、阻遏元件-1沉默转录因子辅阻遏 物(cor

22、epressor for repressor element-1 silencing transcription factor, corest)和阻遏元件-1 沉默转录 因子(repressor element-1 silencing transcription factor, rest)等3种蛋白质结合而成的复合体。前一复合体具有促甲基化作用，后一复合体具有脱甲基化 作用，由它们分别决定不同靶基因的特异性组蛋白 修饰模式 皿(图3)。hotair的过表达，将引起prc2 复合体在全基因组范围内的重新定位，使若干抑癌基因沉默，终将促进乳月i癌的转移10。另一种lncrnaink4位点反义非编码

23、 rna (antisense non-coding rna in the ink4 locus, anril) 是周期蛋白依赖性激酶抑制因子2b(cyclin-depen-dent kinase inhibitor 2b, cdkn2b ,即 p15 ink4b)基因 的反义转录物，参与抑癌基因周期蛋白依赖性激酶 抑制因子 2a(cyclin-dependent kinase inhibitor 2a, cdkn2a,即p16 ink4a )基因的沉默2。anril结合并 募集prc1和prc2复合体，导致染色质状态的改变，ink4a28, 47从而抑制p16基因的表达。2.3 lncrna

24、 在细胞凋亡和细胞周期调控中的作用研究表明，lncrna也具有调控细胞生长的作用， 这主要是通过调控细胞凋亡和细胞周期来实现的。生长阻滞特异转录物5(growth arrest-specific transcript 5, gas5)是哺乳动物细胞凋亡和生长的关键调 控因子48。gas5通过模拟糖皮质激素应答元件来结 合糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor)的dna 结合结构域，阻止糖皮质激素受体与糖皮质激素应 答元件的相互作用，从而抑制下游基因的表达，促进细胞凋亡的发生29。这是lncrna作为诱饵分子 的一个典型例子(图4)。dna图3 hotair作为组蛋白修饰

25、复合体的骨架分子调控组蛋白甲基化和脱甲基化hotair的二端分别结合不同的组蛋白修饰复合体而使组蛋白呈现不同的甲基化状态。huarte等30发现,p53直接诱导长链基因间非编 码 rna p21(long intergenic ncrna p21, lincrna- p21)的表达。lincrna-p21与核不均一核糖核蛋白-k (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein-k, hnrnp-k) 相互作用后可抑制p53信号通路下游基因的表达，糖皮质激素应答元件图4 gas5作为诱饵分子的机制gas5与糖皮质激素应答元件竞争性结合糖皮质激素受体，从而阻止下游

26、基因的表达。从而调控p53介导的细胞凋亡30。另一个参与细胞周期调控的 incrna是dna损 伤活化 p21 相关非编码 rna(p21 associated ncrna dna damage activated, panda)。当 dna 损伤发生 时，p53结合周期蛋白依赖性激酶抑制因子 1a(cyclin- dependent kinase inhibitor 1a, cdkn1a,即 p21)基因 位点，然后激活panda的表达，而panda可通过结 合核转录因子 y a 亚基(nuclear transcription factor y subunit乐nf-ya)而阻止凋亡相关基

27、因的表达 ，从 而延长细胞的生存时间 冏。2.4 incrna 在剪接调控中的作用incrna不但在转录调控中发挥作用，而且是 mrna前体剪接的调控因子。果蝇中的热休克rnaon(heat shock rna on, hsr on)和人类中的卫星出 (satellite m , sat m)重复序列的转录物通过隔离剪 接因子调控mrna前体的剪接32。另一种被称为肺 腺癌转移相关转录物 1(metastasis-associated in lung adenocarcinoma transcript 1, malat1)的 incrna 已被 发现在多种癌症中异常表达，它由其初级转录物的3

28、49 麻加工而来，王要位于男接斑点(splicing speckle)。 它与丝氨酸/精氨酸(serine/arginine, sr)剪接因子相 互作用，并调控剪接因子在剪接斑点中的分布和磷 酸化水平，从而改变mrna前体的选择性剪接模式 33(图5)。bernard等5发现，malat1在神经元中是 高表达的，它通过调控 sr剪接因子影响突触形成 相关基因的表达。此外，malat1还与剪接因子反式 激活应答 dna 结合蛋白-43(transactive response dna binding protein-43, tdp-43)相互作用，影响 mrna 前体的选择性剪接51。2.5 l

29、ncrna 在mrna降解中的作用mrna的丰度与蛋白质的产量有直接的关系，而影响其丰度的主要因素有转录量和降解速率。 mrna的转录量主要通过转录水平调控和转录后加 工决定，而mrna通过多种途径被降解并且影响其 丰度。无义介导的 mrna降解(nonsense-mediated mrna decay, nmd) 是mrna 降解的重要途径之 一52。rna结合蛋白staul(staufenl)则通过直接结 合一种称为移码增加蛋白1(up-frameshift protein 1,upf1)的nmd因子，并将其募集到 mrna的3 -非翻 译区(untranslated region, ut

30、r),引起 mrna 降解53。 这种机制被命名为 staul介导的mrna降解(staul- mediated mrna decay, smd)53。staul 通过 smd 途 径调控大量转录物的水平 网。gong等网发现，一种 称为半 staul 结合位点 rna(half-stau1- binding site 1994-2013 china academic journal electronic ?ubijihing huuse. ah righh reserved. http:/ywwwa-nki.iidt8 h（x）图5 malat1通过调控sr剪接因子的磷酸化影响选择性剪接ma

31、lat1结合sr后可使后者磷酸化 ，然后影响 mrna前体的剪接。第3期夏天等：长链非编码 rna的作用机制及其研究方法# 1994-2013 china academic journal electronic publijihing house. ah rights reserved.图6 1/2-sbsrna 促进stau1介导的mrna 降解1/2-sbsrna与mrna 3 -utr的alu元件不完全配对促进了rna结合蛋白 stau1降解 mrna切割口淀粉林肽前体b淀新样联前体r淀粉样肽图7 bace1-as在翻译调控中的作用bace1-as与bace1 mrna互补结合增强了ba

32、ce1 mrna的稳定性，从而促进了翻译过程rna, 1/2-sbsrna)的 lncrna 通过与 mrna 的 3-utr的alu元件的不完全配对，形成stau1结合 位点，促进stau1与mrna结合，导致mrna降解 (图6)。这一发现表明lncrna在调控转录物丰度方 面也发挥作用。2.6 lncrna 在翻译调控中的作用lncrna也在翻译水平发挥表达调控作用。伊分泌酶 1 反义转录物(bace1-antisense transcript, bace1-as)是 3分泌酶 1( 3-site app cleaving enzyme 1, 3-secretase 1, bace1 )

33、基因的天然反义转录物 (natural antisense transcript) 34。如果 bace1-as 与 正义bace1 mrna相结合将增强 bace1 mrna的 稳定性，从而增加bace1蛋白的表达量，bace1蛋白通过切割3淀粉样肽前体，产生更多的3淀粉样 肽34(图7)。由于脑内存在很多3淀粉样肽斑块是老年痴呆症的一个显著特点55,因此，faghihi等34认 为bace1-as直接参与老年痴呆症的病理过程。此外，lincrna-p21也参加翻译调控，当细胞中 缺少一种称为人类抗原 r(human antigen r, hur)的 rna结合蛋白时，lincrna-p21

34、在细胞中稳定存在并 且不断积累，它与靶mrna结合从而抑制后者的翻 译56。3 lncrna的研究方法为揭示lncrna的分子作用机制，人们需要借 助多种分子生物学研究方法。目前在 lncrna研究中使用较多的成熟技术有微阵列(microarray)、rna-seq、northern印迹(northern blot)、实时荧光定量逆 转录-聚合酶链反应 (real time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, qrt-pcr)、荧 光原 位杂交(fluorescence in situ hybridizat

35、ion, fish)、rna 干扰(rna interference, rnai) 和 rna 结合蛋白免疫沉淀(rna-binding protein immunoprecipitation, rip)等57。微阵列58和rna-seq 59是高通量检测lncrna 表达情况的有效工具。？rom等60用微阵列对多种人 类细胞系进行了 lncrna表达谱分析，检测到3 019 种lncrna,其平均长度为800个核甘酸。lin等61 对来源于诱导多能干细胞(induced pluripotent stemcell, ipsc)的人类神经元进行了rna-seq,发现很多lncrna参与神经发生和

36、神经系统疾病的发生。northern印迹62和qrt-pcr 63不仅广泛应用于 分析lncrna的表达水平，而且常用于验证微阵列 实验结果的真实性。furuno等64用这2种方法验证 了 8种新发现lncrna的存在。与 northern印迹的 原理相似，fish也是利用了分子杂交的原理65。有研 究者采用该技术检测并定位细胞中特定的lncrna 33。 这正体现了 fish的最大优点，即可用于细胞定位研 究。tripathi等33利用该方法发现，malat1这一 lncrna主要定位于细胞分裂间期的剪接斑点。上述技术主要用于lncrna的定性和定量分析， 而在lncrna功能研究中，使用较

37、多的技术有 rnai 和rip。rnai 66用来沉默特定的lncrna已经得到 广泛的应用。tsai等11为了研究hotair与prc2 和lsd1之间的相互作用，用小干扰 rna(small interfering rna, sirna) 沉默 hotair ,结果表明hotair是这2种组蛋白修饰复合体的骨架分子。rip是一项研究rna和蛋白质之间相互作用的技术， 可用于筛选与lncrna结合并发挥作用的相关蛋白 质。pandey等67利用该技术证明了电压门控钾离子 通道kqt样亚家族成员1反义链/反义转录物1(potassium voltage-gated channel, kqt-l

38、ike subfamily, member 1 opposite strand/antisense transcript 1, kcnq1ot1)与组蛋白h3的第9位赖氨酸(histone h3 lysine 9, h3k9)甲基转移酶和 prc2复合体相互作 用。目前，rip技术有了新的进展，rip与微阵列相结 合，发展成为了 rip-chip68;而 rip 与 rna-seq 相 结合，则发展成为了 rip-seq69。这些方法的联合应 用将更有利于揭示lncrna的生物学功能。对于这些较成熟的实验技术在相关文献中均有 描述，在此不再赘述。本文将重点介绍3种近12年报道的最新研究方法，包

39、括快速预测rna与蛋白 质相互作用及结构域(fast predictions of rna andprotein interactions and domains, catrapid)70、chirp23以及非编码rna沉默与定位分析(combined knockdown and localization analysis of noncoding rnas, c-klan) 71 等技术(图 8)。3.1 catrapidcatrapid 是一种在线算法(algorithm),主要用 于预测rna与蛋白质的相互作用，是生物信息学技 术在lncrna功能研究中的很好体现。使用这种方 法可以避免

40、功能研究实验的盲目性，节约大量实验图8 lncrna 相关研究方法的建立时间成本。其网址为 http:/big.crg.cat/gene_function_and_ evolution/services/catrapid 70。该算法根据 rna 和蛋 白质的二级结构、氢键和分子间作用力来评估它们 之间相互作用的倾向70。bellucci等70用大量与蛋第3期夏天等：长链非编码 rna的作用机制及其研究方法283白质相互作用的lncrna(来自npinter数据库72)验 证了该算法，结果正确预测了89%的经实验证实的lncrna与蛋白质相互作用，如：他们预测的hotair 和xist与组蛋白

41、修饰复合体 prc2的相互作用倾向 与以往的实验结果11, 73完全一致。catrapid的预测 功能将为寻找lncrna靶标起到积极的指导作用。3.2 chirpchirp技术用于发现与 rna相互作用的dna 和蛋白质囤。其原理如下：首先用戊二醛固定细胞，以维持lncrna与染色质的相互作用，然后进行细 胞裂解和超声破碎，接着用生物素标记的寡核甘酸 探针与靶lncrna杂交，基于生物素和链霉亲和素 相互作用的原理，用链霉亲和素磁珠来分离、纯化 染色质复合体，最后从纯化的染色质复合体中分离 蛋白质、rna或dna,以进行下游的分析74。具体 的实验步骤可参看chu等74发表于在线视频期刊jo

42、urnal of visualized experiments (http:/www.jove. com/)上的视频和操作指南。为了验证chirp的效果, chu等23用该技术来分离宫颈癌hela s3细胞的端粒酶 rna 组分(telomerase rna component, terc), 结果表明回收率约为 90%。与rip这一研究rna和蛋白质之间相互作用的 技术一样，chirp技术也可与测序技术结合起来用 于研究lncrna 的功能。chirp-测序(chirp- sequencing, chirp-seq)则是将 chirp和高通量测序 相结合用于在全基因组范围内定位lncrna的

43、结合位点23。以往的研究结果表明，一种称为x染色体 上的 rna 2(rna on the x chromosome 2, rox2)的 lncrna仅定位于雄性果蝇的 x染色体，而不存在于 常染色体75。为此，chu等23对雄性果蝇细胞的rox2 进行了 chirp-seq,结果鉴定出了 308个rox2结合 位点全部位于x染色体。这一结果进一步证实了 rox2 的x染色体特异性定位特点。此外，通过chirp-seq, 他们还获得了全基因组范围的terc结合位点图谱和hotair结合位点图谱四。3.3 c-klanchakraborty等71于2012年2月报道了他们建 立的c-klan 技

44、术。该技术主要用于对lncrna进行功能缺失(loss-of-function)研究和细胞定位71。该技术基于2种现有的研究方法核糖核酸内切酶制备的小干扰 rna(endoribonuclease-prepared sirna, esirna)和 fish。esirna的原理是：先通过核糖核酸内切酶出酶 切双链 rna(double-stranded rna, dsrna) 生成 sirna,然后让sirna混合物与靶 mrna结合76。 由于有多个位点结合，所以这一方法可高效抑制靶 基因的表达冏。与其他rnai方法相比，esirna的 脱靶效应要低得多77。这使esirna的实验结果更 加可

45、靠。chakraborty等71认为esirna同样适用于 沉默lncrna。chakraborty等71使用在线算法sirna 设计与质量控制(design and quality control of sirnas, deqor)技术78预测了有效且特异的 esirna。结果 表明，与未经优化的 esirna相比，90%经deqor 优化的esirna沉默效果得到提高冏。另一方面,fish作为一种成熟的技术，其原理 是使用荧光标记的反义探针与靶标结合，根据荧光信号检测其表达水平和细胞位置彻。基于上述2项技术发展而来的 c-klan的具体 步骤如下：首先，针对所要研究的lncrna设计引物，

46、 将其逆转录成 cdna, pcr扩增cdna,对pcr扩增 产物进行测序和质量检测，接着分成两条路线：(1) 制备esirna：对扩增产物进行体外转录，生成 dsrna,用核糖核酸内切酶出酶切dsrna来制备esirna,用于对lncrna进行功能缺失研究;(2)制 备fish探针：用荧光标记的utp对扩增产物进行体外车专录,以制备正义或反义的 fish探针，用于对 lncrna 进行定位分析71。利用c-klan 技术， chakraborty等71确定了多能性相关非编码转录物 1(pluripotency-associated noncoding transcript 1, panct1

47、)主要位于胚胎干细胞的细胞核中，并发现它是维持胚胎干细胞的多能性所必需的。4 lncrna 研究中存在的问题当前，lncrna 研究正处于起步阶段，因此面临 着许多亟待解决的问题：(1)lncrna的定义仍存在 争议。一般认为,lncrna是长度大于200个核甘酸 的非编码rna。但是，spizzo等1认为,以200个核 甘酸作为界定lncrna过于武断，因为小于200个核 甘酸的非编码rna中还存在很多非编码 rna,它们既不属于小 rna(small rna)也不属于结构 rna (structural rna) 。 (2)lncrna生物学功能的阐明并 非易事。一方面，如何区分功能性和非

48、功能性非编 码转录物依然存在困难80,另一方面，由于incrna 种类和功能的多样性，致使不同的incrna研究结 果之间的借鉴意义并不高。(3)尚无统一的命名原则。 目前lncrna还没有一个规范的命名方法，只是研 究者根据其功能、结构特点、作用方式等进行命名，有时很难从名称中了解其真正含义和功能。 (4)lncrna数据库不够全。相于其他非编码rna数据库，lncrna 相关数据库的内容还不够全，对lncrna的注释远远不够丰富。(5)lncrna功能预测 的工具不多。针对lncrna的生物信息学工具仍然 极少，例如，目前难以对lncrna二级结构和靶标等 进行有效地预测。(6)研究领域有

49、待拓展。目前，有 关lncrna的研究主要集中于肿瘤、神经、发育、 植物等领域，在其他领域和对其他疾病的研究依然.一一 71 一欠缺。(7)用于lncrna研究的新技术并不多。因此，需要建立更多、更有效的研究方法用于系统地研究lncrna的结构和功能。5展望随着越来越多的研究者关注并且投身到lncrna研究领域中，我们对lncrna的认识也正越来越深 入。lncrna不仅在生物体中以多种机制发挥其生物 学功能，而且其功能失调与多种疾病的发生和发展 有关2。本课题组研究也发现，lncrna与肿瘤发生、 发展的关系非常密切12。然而，由于lncrna作用机制的多样性和复杂 性，目前对lncrna功

50、能的认识仍然只是冰山一角。 来 自 dna 元件百 科全书(encyclopedia of dna elements, encode)的数据表明，迄今为止，该项目 所收录的9 640多个人类lncrna基因位点中，只有 约100个得到了功能研究81。为了阐明lncrna精 细的分子机制，需要更先进的高分辨率体内成像技 术和高灵敏度检测技术。例如，paige等82开发出一 种称为“ spinach”的rna-荧光基团复合物便可用 于动态追踪活细胞内的 rna; mercer等83也于最近 开发了一种称为“rna captureseq”的靶向rna测 序技术，具有极高的灵敏度，可以检测到常规测序方

51、法无法检测到的微量rna和瞬时表达的rna。他们利用该技术检测到了163种新的lncrna 83。我们相信，随着技术的进步，将有更多的新技术运用 于lncrna的功能研究中，这必将有助于我们进一 步解析lncrna的功能及其分子调控机制，以及它 们在疾病发生、发展中的病理机制。参考文献(references):1 spizzo r, almeida mi, colombatti a, calin ga. long non-coding rnas and cancer: a new frontier of translational research? oncogene , 2012, 31(4

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53、 zhang xj, li y, tang zl, yang sl, mu yl, cui wt, ao h, li k. identification, bioinformatic analysis and expression profiling of candidate mrna-like non-coding rnas in sus scrofa. j genet genomics , 2009, 36(12): 695702.7 wutz a, rasmussen tp, jaenisch r. chromosomal silencing and localization are m

54、ediated by different domains of xist rna. nat genet , 2002, 30(2): 167174.网 gong c, maquat le. lncrnas transactivate stau1- mediated mrna decay by duplexing with 3 utrs via alu elements. nature , 2011,470(7333): 284288.9 clemson cm, hutchinson jn, sara sa, ensminger aw, fox ah, chess a, lawrence jb.

55、 an architectural role for a nuclear noncoding rna: neat1 rna is essential for the structure of paraspeckles. mol cell , 2009, 33(6): 717- 726.10 gupta ra, shah n, wang kc, kim j, horlings hm, wong dj, tsai mc, hung t, argani p, rinn jl, wang yl, brzoska p, kong b, li r, west rb, van de vijver mj, s

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