人肝癌细胞凋亡影响半胱氨酸蛋白酶论文_优秀论文

1、 人肝癌细胞凋亡影响半胱氨酸蛋白酶论文【摘要】研究日本新近研制的第三代3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA, HMG-CoA）还原酶抑制剂匹伐他汀（pitavastatin, NK-104）对人肝癌细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）活性的影响。方法:采用细胞培养技术, 以肝癌细胞系HepG2为靶细胞, 以不同浓度的药物处理细胞48h后, 利用WST-8法测定NK-104对细胞增殖的影响;利用荧光染料Hoechst33258染色, 荧光显微镜观察细胞核碎片;以流式细胞仪分析细胞周期的变化;采用半胱氨酸蛋白酶3比色法检测cas

2、pase-3活性。结果:NK-104（10mol/L）对HepG2细胞有明显抑制作用, 可诱导HepG2细胞凋亡, 并能增强caspase-3基因的活性。结论:NK-104能够诱导HepG2细胞凋亡, 其机制与caspase-3依赖性凋亡调节信号通路有关。【关键词】肝癌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA, HMG-CoA）还原酶抑制剂, 统称为抑制素, 是重要的脂类合成抑制剂, 主要在人体肝脏中代谢, 临床上广泛应用于治疗高脂血症1。最近研究发现, HMG-CoA还原酶抑制剂具有生物学多效性, 与降血脂无关。有报道其在体外具有抗癌作用

3、2、体内与5氟尿嘧啶（fluorouracil, 5-Fu）共同作用能够延长晚期肝癌患者的生存期3。匹伐他汀（pitavastatin, NK-104）是日本新近研制的第三代高效HMG-CoA还原酶抑制剂4。在血管内皮细胞系NK-104通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide3-kinase/proteinkinaseB, PI3K-Akt）基因激活途径对内皮细胞的保护作用已有报道5, 但其在肝癌细胞系的抗癌作用尚未见报道。本文在肝癌细胞系HepG2通过2-（2-甲氧基-4-硝基苯）-3-（4-硝基苯）-5-（2, 4-二硫代苯）-2H-四氮唑单钠盐2-（2-meth

4、oxy-4-nitrophe-nyl）-3-（4-nitrophenyl）-5-（2, 4-disulfophenyl）-2H-tetrazolium, monosodiumsalt, WST-8、荧光染料Hoechst33258染色、流式细胞仪和半胱氨酸蛋白酶3比色法等检测方法, 研究NK-104对人肝癌细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）活性的影响, 为NK-104在抗肿瘤中的作用机制提供实验依据。1材料和方法1.1主要材料与仪器NK-104, 日本兴和有限公司（日本名古屋）和日产化学工业公司（日本东京）产品;荧光染料Hoechst33258、甲羟戊酸（mevalonicaci

5、d, MEV）和碘化丙啶（propidiumiodide, PI）染色液（PI100g/L, 1%Triton100, 9g/LNaCl）, Sigma公司产品。流式细胞仪, 2000FCA, 美国BD公司产品。1.2实验方法1.2.1细胞培养人肝癌细胞株HepG2（美国ATCC公司产品）在含10%胎牛血清的DMEM培养基、5%CO2、37条件下培养。实验中, 细胞种植于适当培养皿中, 90%的细胞融合时, 用磷酸盐缓冲液洗净后, 加入适量含有NK-104和MEV（1mmol/L）等药物的培养液, 37培养箱中培养。1.2.2WST-8方法利用WST-8试剂盒对细胞增殖进行测定。HepG2细胞

6、（1104个细胞/孔）接种于含100l培养液的96孔培养板中, NK-104（0.1100mol/L）治疗48h后, 分别加入WST-8试剂10l（日本同仁化学研究所）培养2h后, 选择450nm波长, 测定各孔的吸光度OD值。1.2.3Hoechst33258染色细胞经药物刺激48h后, 甲醇-冰乙酸（31）细胞固定液4固定5min, 磷酸盐缓冲液稍洗后, 点加Hoechst33258染色液, 10min。用滤纸沾去多余液体, 封片剂封片后荧光显微镜观察细胞核碎片。1.2.4流式细胞仪检测凋亡峰在室温下将刺激48h后的细胞用冷磷酸盐缓冲液洗涤2次, 并在适当的染色缓冲液中吸取100l的细胞（

7、1105）至试管中。加入200lRNaseA, 37水浴30min, 再加800lPI染色液混匀, 4避光30min后, 立即上机分析。1.2.5半胱氨酸蛋白酶3比色法经药物治疗48h后收集细胞, 采用半胱氨酸蛋白酶3比色法试剂盒按照厂家说明进行测定（Medical&BiologicalLaboratoriesCo., LTD, Japan）。1.3统计学方法数据均以xs表示, 采用SPSS11.0统计软件进行统计分析, 采用t检验。2结果2.1NK-104对HepG2细胞增殖的抑制作用为了确定NK-104在人肝癌细胞HepG2中的治疗浓度, 采用WST-8方法对细胞的增殖作用进行测定

8、。与对照组相比, NK-104在10和100mol/L时, 对HepG2细胞生长均有明显的抑制作用。100mol/L时, 近50%的细胞死亡（P图1不同浓度NK-104对HepG2生长的抑制作用（略）Figure1GrowthinhibitionofHepG2cellsbyNK-104*P2.2NK-104诱导细胞凋亡的形态变化对照组细胞界限清晰, 胞浆丰富, 细胞核呈弥散、均匀荧光分布, 经10100mol/LNK-104处理后, HepG2发生细胞凋亡, 细胞核或细胞质内可见浓染致密的蓝色荧光颗粒及明显核形态变化。见图2。2.3NK-104对HepG2细胞周期的影响与对照组相比, NK-1

9、04治疗组可明显诱导HepG2的细胞凋亡, 出现相当比例的DNA含量小于二倍体的亚G1凋亡峰（24%）, 不同周期细胞的比例也发生变化, 与MEV共同作用后可消除NK-104的这种诱导作用。见图3。2.4NK-104对caspase-3活性的影响与对照组相比, NK-104可明显诱导caspase-3活性（P图2NK-104处理48h后HepG2细胞核的形态变化（Hoechst33258染色, 400）（略）Figure2NuclearmorphologyoftheHepG2cellstreatedbyNK-104for48hours（Hoeschst33258staining, 400）A:

10、Control, normalnuclearstructure;B:NK-10410mol/L;C:NK-104100mol/L;:Cytoplasmicchange;:Nuclearfragmentation.图3NK-104治疗HepG2细胞后细胞周期分布变化（略）Figure3CellcycleanalysisofHepG2cellstreatedbyNK-104（PercentageofSubG1cells）*P图4NK-104对caspase-3活性的影响（略）Figure4NK-104inducedactivityofcaspase-3*P3讨论目前认为恶性肿瘤是一种多基因异常的疾

11、病, 其发生的分子基础是原癌基因的激活或抑癌基因的突变失活或缺失, 导致某些细胞分化不良、凋亡受阻和增殖失控而形成肿瘤。原发性肝癌约55%发生在中国6。肝癌细胞的凋亡在肝癌的发生发展、转归及治疗等方面均有重要的意义。HMG-CoA还原酶抑制剂, 是重要的脂类合成抑制剂, 临床上广泛应用于治疗高脂血症。最近研究表明, HMG-CoA还原酶抑制剂具有抗感染、降低炎性细胞因子水平及抗癌等生物学多效性作用。Otsuki等7报道130mol/L的西米伐他汀（simvastatin）具有预防癌症的作用。Sutter等8研究认为110mol/L的弗鲁伐他汀（fluvastatin）通过诱导Huh7细胞凋亡而

12、抑制肝癌细胞的增殖。Denoyelle等9认为25g/L的赛里伐他汀（cerivas-tatin）对MDA-MB-231人乳腺癌细胞通过抑制细胞核因子B活性起到重要的抗转移作用。HepG2细胞具有典型肝癌细胞的一系列恶性特征, 是研究和评价防治肝癌药物的较理想的细胞模型。NK-104是日本新近研制的第三代HMG-CoA还原酶抑制剂, 具有副作用小、高效和强力的药代动力学特点4。我们的研究结果表明, NK-104对HepG2细胞增殖有明显抑制作用, 其最大抑制率可达50%左右, 使HepG2细胞呈现典型的凋亡形态学特征, 核质浓集, 有凋亡小体。提示NK-104能在一定程度上抑制肝癌细胞的增殖。

13、流式细胞术具有检测的细胞数量大、反映群体细胞的凋亡状态比较准确等优点10。NK-104作用于HepG2细胞后, 通过流式细胞仪分析, 与对照组相比, 可见凋亡细胞出现在直方图亚二倍体峰位置, 并与细胞主峰G0/G1分界清楚, 可定量凋亡占整个细胞群百分比。本研究结果表明, NK-104可明显诱导HepG2细胞凋亡。细胞凋亡的核心成分是半胱氨酸蛋白酶家族（caspase）, 其中研究最多, 功能相对较明确的为caspase-3。caspase-3是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶之一, 为凋亡的效应分子, 被称为凋亡的“执行者”1113。激活的caspase-3可裂解相应的胞核内底物DNA修复酶（p

14、olyADP-ribosepolymerase, PARP）, 使PARP失去对DNA的修复功能, 导致细胞转向凋亡14。本研究表明, 10mol/LNK-104能够增强caspase-3的活性, 加入MEV能够消除NK-104的这种诱导作用。这一研究结果表明, NK-104诱导HepG2细胞凋亡与激活caspase-3依赖性凋亡调节信号通路有关。【参考文献】1GoldsteinJL, BrownMS.Regulationofthemevalonatepathway.Nature.1990;343:425-430.2BellostS, PaolettiR.CorsiniA.Safeofstat

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