样本DNA纯化、保存方法

1、样本DNA提取、纯化、保存方法 一. DNA种类： 真核生物DNA、细菌DNA、病 毒DNA、质粒DNA 细胞悬液DNA、组织DNA 双链环状、双链线性、单链环状 细胞核DNA、细胞器DNA 二. 提取DNA总的原则： 1. 保证核酸一级结构的完 整性； 2. 核酸样品中不应存在对 酶有抑制作用的有机溶剂和 过高浓度的金属离子； 其他生物大分子如蛋白质、 多糖和脂类分子的污染应降 低到最低程度； 4. 其他核酸分子，如RNA， 也应尽量去除。 三. DNA样品准备 1. 生物组织： 最好新鲜组织，若不能马上 提取，应贮存70或液氮 液氮冷冻敲碎研磨 组织匀浆法 液氮匀浆法 2. 培养细胞 悬浮

2、生长细胞：1500g离心， 410分钟收集细胞 单层培养细胞：可用刮棒或胰 酶消化后离心收集 3、血液样品 血液抗凝易用柠檬酸抗 凝液（ACD）： 柠檬酸 0.48g 柠檬酸钠 1.32g 右旋葡萄糖 1.47g 加H2O 至 100ml 每6ml新鲜血液加1ml ACD 液，0保存数天，-70长期 贮存。 四. DNA提取 1. 酚抽提法： 先用蛋白酶K、SDS破碎细胞， 消化蛋白，然后用酚和酚-氯 仿抽提，最后乙醇沉淀。获 DNA大小为100150kb 2. 甲酰胺解聚法： 破碎细胞同上，然后用高浓 度甲酰胺解聚蛋白质与DNA 的结合，再透析获得DNA。 可得DNA 200kb左右。 3.

3、 玻璃棒缠绕法： 用盐酸胍裂解细胞，将裂解 物铺于乙醇上，然后用带钩 或U型玻璃棒在界面轻搅， DAN沉淀液绕于玻棒。生成 DNA约80kb。 4. 异丙醇沉淀法： 基本同1法，仅用二倍容积异 丙醇替代乙醇，可去除小分 子RNA（在异丙醇中可溶状 态）。 5. 表面活性剂快速制备法： 用Triton X-100或NP40表 面活性剂破碎细胞，然后用 蛋白酶K或酚去除蛋白，乙 醇沉淀或透析。 6. 加热法快速制备： 加热法快速制备：加热96 100，5分钟，然后离 心后取上清，可用于PCR反 应。 7. 碱变性快速制备： 先用NaOH作用20分钟，再 加HCl中和，离心后取上清， 含少量DNA。

4、 五、DNA的浓缩 1.固体聚乙二醇（PEG）浓缩： 用透析袋外敷PEG至合适量。 2. 丁醇抽提浓缩： DNA溶液中水可分配到正丁 醇或仲丁醇，但DNA不会。 因此重复几次可显著减少 DNA体积。 3. 乙醇或异丙醇沉淀： （1）需要阳离子盐的存在 NaAc最常用， NaCl对含SDS样品好， NH4Ac去除dNTP好， LiCl沉淀RNA好，但不 能用于反转录前。 （2）沉淀温度与时间 0，1015分钟。 （3）离心 04，12000g，10分 钟，小于100bp DNA需超 速离心 4、精胺沉淀法 与DNA结合后使DNA结构凝 缩沉淀，需在无盐或低盐溶 液。 六. DNA的鉴定 1. 分

5、光光度法 在260nm和280nm处测定DNA 溶液的光吸收，A260与A280之比 应在1.751.80。低于此值表 明制备物中留有蛋白质成份或酚。 高于此值表明有RNA的残留量。 2. 凝胶电泳分析 (1). 影响琼脂糖凝胶DNA 迁移率的因素 A、DNA的分子大小 分子越大迁移速度越 慢 B、琼脂糖浓度 迁移率与 浓度成反比 琼脂糖含量（W/V） 线性DNA分离范围（Kb） 0.3 5 - 60 0.6 1 - 20 0.7 0.8 - 10 0.9 0.5 - 7 1.2 0.4 - 6 1.5 0.2 - 3 2.0 0.1 2 C、DNA构象 相同分子量的超螺旋环状（ 型），切口环

6、状（型）和线状 （型）DNA，以不同速率通 过凝胶， 一般情况下，迁移率型型 型 D、电压 迁移率与所加电压成正比， 但过大有效分离范围变小。 2Kb DNA, 2Kb DNA, 电压5V/cm5V/cm。 E E、电场方向 单一方向速率均等，改变 方向，极大分子DNADNA迁移更 慢。通过脉冲电场凝胶电泳 分离极大DNADNA。 （2 2）. DNA. DNA的检测 A A、用溴乙锭染色 在254nm254nm紫外光下检测，如 需回收最好在300nm300nm紫外光 下割胶，否则易脱嘌呤而断 链，在1cm1cm宽带上可检到 10ng DNA10ng DNA。 B B、用银染法 AgAg+ +

7、与DNADNA形成复合物，在甲 醛还原下可染成黑褐色，灵 敏度高200200倍，但不能回收。 （3 3）. . 分 析 通常与已知分子量的标准DNADNA 片段一起电泳，经比较可获 知DNADNA标本大小。如条带拖尾， 系加入DNADNA量太多或凝胶未制 好。如分子量小或一片糊状， 表示DNADNA有降解。 为了判断目的DNA片段的大小，常在 同一凝胶的目的DNA旁加一分子量参照物， 同时电泳并染色后，就能在紫外灯下很快 知道目的片段的大小。最常用的分子量参 照物是 Hind 消化物，各片段的大小以 bp表示，分别为：23130，9416，6557， 4361，2322，2027，564，12

8、5。 （4 4）. DNA. DNA回收 A A、电泳到DEAE-DEAE-纤维素膜 在所需条带前插入DEAT-DEAT-纤 维素膜，继续电泳至条带DNADNA 都到膜上，取出洗下。 B B、透析袋电洗脱 切下条带的琼脂糖凝胶， 放 透析袋内，加缓冲液后 继续电泳，DNADNA出胶后回收。 C C、低熔点琼脂糖凝胶 切下胶，加热到6565熔化胶， 然后用酚抽提回收DNADNA。 七. DNA. DNA的定量 1. 1. 分光光度法： 测定DNADNA在A A 260nm260nm的光吸 收，计算浓度 A A 2 6 02 6 0 稀 释 倍 数 5 05 0 g/ml (g/ml (双链DNA)DNA) A A260 260稀释倍数40 40 g/ml g/ml ( (单链DNA)DNA) A A260 260稀释倍数20 20 g/ml g/ml ( (单链寡核苷酸DNA)DNA) 2.琼脂糖平板法： 在含溴乙锭琼脂糖平板上 滴1 15l5l样品DNADNA和已知