天门冬酰胺酶

1、精选ppt,1,L-天门冬酰胺酶,精选ppt,2,L-天冬酰胺酶的基本介绍 L- 天冬酰胺酶是酰胺基水解酶，它在血液中特异性的催化天冬酰胺水解形成L-天冬氨酸和氨使某些肿瘤细胞因摄取不到足够的L-天冬酰胺而导致细胞增殖受到抑制，从而达到抗肿瘤目的，临床上用于治疗南急性淋巴细胞白血病等，是一种重要的抗肿瘤药物。 L- 天冬酰胺酶的分子结构,精选ppt,3,L-天门冬酰胺酶的基本介绍,1922年Clement发现豚鼠血清中存在天冬酰胺酶；1953年Kidd发现豚鼠血清中有抑癌作用的物质，其活性成分是蛋白质；1961年Broome确定了其有效成分是天冬酰胺酶，后来，Mash burn等报告指出从大肠

2、杆菌中分离出天冬酰胺酶，具有同样抗癌活性。,精选ppt,4,天冬酰胺酶的基本性质,天冬酰胺酶呈白色粉末状，微有湿性，溶于水，不溶于丙酮、氯仿、乙醚和甲醇，水溶液20储存7d，5储存14d均不减少酶的活力。干品50 15min酶活力降低30，60 1h内失活，最适PH8.5，最适温度37。,精选ppt,5,L-天冬酰胺酶结构,精选ppt,6,L-天冬酰胺酶结构,精选ppt,7,L-天冬酰胺酶结构,精选ppt,8,L-天冬酰胺的制备工艺,目前最常用制备L-天冬酰胺酶的方法是用大肠杆菌备。 右图是大肠杆菌形态图,精选ppt,9,工艺路线 大肠杆菌发酵生产工艺 （1）工艺路线菌种培养 菌种培养 种子培

3、养 营养肉汤培养基 玉米浆 大肠杆菌 肉汤菌种 种子液 37.48h 37.68h 发酵罐培养 压滤、风干 提取 玉米浆 丙酮 硼酸缓冲液 发酵液 干菌体 提 沉淀 热处理 HAC 甘氨酸 取液 粗酶 酶溶液 PH4.24.4 60.，30min 精制聚乙二醇 无热原酶液 冻干 L-天冬酰胺酶,精选ppt,10,1菌种培养采用大肠杆菌Escherichia coli A.S.1.357,培养基加牛肉汁100mL,蛋白胨1g,氯化钠0.5g,琼脂2-2.5g 37,在试管中培养24h，茄形瓶培养8h，锥形瓶培养16h。 2 种子培养培养基用玉米浆30kg，加水至300kg，接种量1%-1。5%，

4、37，通气搅拌培养4-8h.,3 发酵罐培养 取玉米浆100Kg，接种量8%，37，通气搅拌培养6-8h，离心分离发酵液，得菌体加2倍量丙酮搅拌，压滤，滤饼过筛，自然风干成菌体干粉。,精选ppt,11,4、 提取、沉淀、热处理 每千克菌体干粉家兔0.01mol/L pH8的硼酸缓冲液10L，37保温搅拌1.5h，降温到30 ，用5mol/L醋酸调pH4.44.4，压滤，滤液中加入2倍体积的丙酮，放置34h，过滤，收集沉淀，自然风干，即得干粗酶。 取粗制酶1g,jiaru 0.3/%甘氨酸溶液20ml，调节PH8.8，搅拌1.5h，离心收集上清，加热到60维持30min进行热处理。离心弃去沉淀，

5、上清液加2倍体积的丙酮，析出沉淀后离心，收集酶沉淀，用0.01mol/L、pH8磷酸缓冲液溶解，再离心弃去不溶物，得上清酶溶液。,精选ppt,12,5精制、冻干 上述酶溶液调PH8.8，离心弃去沉淀，清夜再调PH7.7，加入5%聚乙二醇，使浓度达到16%。在25 放置45d，离心得沉淀。蒸馏水溶解，加4倍量的丙酮，沉淀，同法反复1次，沉淀用PH6.4、0.05mol/L磷酸缓冲液溶解，得到精制酶溶液。调节pH至55.2，再加50%聚乙二醇，如此反复处理1次，即得无热原的L-天冬酰胺酶。溶于0.5mol/L磷酸缓冲液，在无菌条件下用6号垂熔漏斗过滤，分装，冷冻干燥，即得注射L-天冬酰胺酶成品，每

6、支1万或2万单位。,精选ppt,13,（3）蔗糖溶液提取纯化工艺 将菌体细胞加入5倍体积的蔗糖提取液（蔗糖40%，溶菌酶200mg/LEDTA10mg/L,PH7.5）。在30震荡2h,8000r/min离心30min,收取上清液，再加入硫酸铵至55%饱和度，调节pH7.0，室温搅拌1h，离心除去沉淀。取上清液家硫酸铵至90%饱和度，离心收集沉淀。将沉淀用50mmol/L、PH7.0的磷酸缓冲溶液溶解并透析，透析后的酶液，通过预先用50mmol/L、PH7.6磷酸缓冲液平衡的DEAE-纤维素色谱柱（1cm30cm）,用30mmol/l磷酸缓冲液洗脱，流速为40ml/h,收集天冬酰胺酶活性组分，

7、在调整PH4.8，通过预先用50mmol/L、PH4.9磷酸缓冲液平衡的CM-纤维素色谱柱（1cm8cm），用50mmol/L、PH5.2磷酸缓冲液洗脱，收集酶活性组分，冷冻干燥，即得L-天冬酰胺酶冻干粉。总收率31%，比活力220U/mg.,精选ppt,14,（4）技术要点 1：菌种选择及抗癌活性 自从大肠杆菌中成功地提取了L-天冬酰胺酶之后，生产上均采用微生物发酵法制备L-天冬酰胺酶。通常采用大肠杆菌、黏质赛氏杆菌做菌种，国内用大肠杆菌。 2：提取和纯化工艺 L-天冬酰胺酶是胞内酶，通常采用先破壁后提取。可将收集偶记得菌体加入24倍的冷丙酮，溶解细胞膜上的脂类化合物，破坏细胞壁结构，提高壁

8、的通透性，制成丙酮干粉，再悬浮于0.01mol/L、PH8的硼酸-硼酸钠缓冲液中，37搅拌提取，加入氯化锰沉淀核酸比活力2.26U/mg.改进用葡萄糖溶液提取细胞周质中的酶，多数细胞未发生破裂，提取液的粘稠度不大，用8000r/min离心除去沉淀，得到上清粗酶液，比活力4.8U/mg.改进前的工艺有6步，总收率18.8%。酶制剂的比活力为200.6U/mg，与日本的leunase和德国的crasnitin的比活力相似。蔗糖溶液提取工艺有3步，总收率31%，比活力为220U/mg。,精选ppt,15,纯化技术，有用硫酸铵分级沉淀，饱和度达到43%，沉淀除去杂蛋白，再提高饱和度至85%沉淀酶，收集

9、沉淀溶于蒸馏水，利用超滤或葡聚糖凝胶G-25脱盐；用有机溶剂沉淀，先用酶溶液pH调至pI附近，降低酶的溶解度，再用2倍体积的丙酮使酶沉淀。进一步纯化，可用乙醇分级沉淀，在中性条件中加入1.1倍体积的乙醇，沉淀除去杂蛋白，上清液用乙酸调节PH至等电点附近，再继续加入乙醇沉淀酶。在生产上，常采用聚乙二醇沉淀，是一种既简单又有效的方法，能较好的保持酶的活性。聚乙二醇是非离子型聚合物，易于酶形成复合型沉淀。所用聚乙二醇相对分子质量4000-6000，水溶液浓度为50%，加入后的终浓度为16%左右，PH7.7条件下，低温放置，产生复合物沉淀，沉淀物在PH6.4缓冲液中溶解，制的酶的精品，比活力达到150

10、U/mg蛋白。小规模制备时，可用DEAE-纤维素色谱柱，色谱柱先用0.01mol/L、PH8磷酸缓冲液平衡，酸液上柱后，用磷酸缓冲液梯度洗脱，浓度变化范围为0.01-0.1mol/L，PH变化为6.4，收集酶活高峰部分，冷冻干燥即得高纯度L-天冬酰胺酶，比活力为200U/mg.,精选ppt,16,3：报道实例 酶具有催化活性，这是选择提取方法和操作条件的指标，从原料开始，在整个酶的提取和纯化工程中，贯穿着总活力和比活力的的比较，了解某一步的收率和纯度、分析和决定下步工艺的取舍等步骤。 4：反复冻融法和超声破壁法 据文献报道，提取方法除冷丙酮干燥破壁和蔗糖溶液提取法外，还有反复冻融法和超声破壁法

11、。 反复冻融法是将菌体在-30和室温两种温度反复冻融9次，用30mmol/L磷酸缓冲液（PH7.5）浸提30min,8000r/min离心20min.离心吸取上清酶液。 超声破壁法是将1g菌体悬浮在40ml 10mmol/L、PH7.5磷酸缓冲液中，超声波处理（输出功率300w、间隔30s）10min.处理过程中用冰浴降温。用氯化锰沉淀核酶4000r/min离心20min，吸取上清液。,精选ppt,17,5：酶分子修饰 20世纪70年代治癌成功以来，随着酶学的发展，对酶分子进行化学修饰，提高生物活性。降低抗原性，有了较大的进展。据国外报道，L-天冬酰胺酶游离氨基经脱氨、酰化、碳化三亚胺反应，可

12、增强酶在血浆中的半衰期。若多聚体与酶偶联。如用丙氨酸-羧基酸酐处理。与L-天冬酰胺酶形成聚丙氨酸-天冬酰胺酶的复合物，可延长酶的半衰期。对天然酶的抗体反应减少了1/500-1/300.,精选ppt,18,溶氧对L-天冬酰胺酶发酵的影响及其控制,溶氧对大肠肝菌L-天冬酰胺酶的合成有严重影响 通过装液量试验、接种量试验、葡萄糖试验和氧载体试验考察摇瓶发酵过程中溶氧对L-天冬酰胺酶合成的影响,通过通纯氧自控pH的发酵工艺进行溶氧控制和pH控制.结果:采用通纯氧自控pH的发酵工艺,可延长发酵周期,有效地防止菌体的过早自溶,大大促进L-天冬酰胺酶的合成,较分批发酵提高产酶83,达到110u/mL.,精选

13、ppt,19,L-天冬酰胺酶的纯化与修饰,L-天冬酰胺酶的纯化 将L-ASP与高效先导序列pelB融合使得L-ASP在细胞外表达，并L-ASP在的N末端添加了6个组氨酸序列标签，然后采用亲和层析法分离纯化得到L-ASP ，成本高，并不适合大规模的工业化生产。 经蔗糖破壁，硫酸铵分级沉淀、透析、DEAEDE52、QSepharose Fast Flow等步骤纯化得到的比活力高，SDS-PAGE检测时显示为一条带，RT-HPLC分析纯度达99%，最终回收率为50.5%，适合大规模的工业化生产。,精选ppt,20,L-天冬酰胺酶的纯化与修饰,L-天冬酰胺酶的修饰 L-ASP聚乙二醇化不但降级了胰蛋白

14、酶对它的降解作用，而且修饰酶的抗原性与天然酶相比也大为下降。 此外，聚乙二醇化L-ASP与传统的脂质体化L-ASP相比有明显的优势。,精选ppt,21,L-天冬酰胺酶的纯化与修饰,微囊化修饰 将L-天冬酰胺酶用半透膜性质的聚合物制成微囊性固定化酶，其大小一般为1500mm. 低分子底物可以自由出入胶囊膜，与酶接触而起反应，反应产物则因浓度不断增加而不断渗透出胶囊外面。 微囊性固定化可以克服天然酶针剂出现的抗体抗原反应。 该酶注射到人体后，对膜具有良好通透性的低分子底物，能长时间发挥作用，比天然酶的疗效好，而且急性毒副反应低。,精选ppt,22,L-天冬酰胺酶的纯化与修饰,用固定化酶反应器进行体

15、外净化血液中L-天 冬酰胺 方法： 经固定化L-天冬酰胺酶装填于柱中或将其固定在酶板、酶管或血液透析膜上，使得血液从固定酶上通过，除去癌细胞生长所需的L-天冬酰胺，从而达到治疗的目的。 改进的功能： 由于酶不与体内器官直接接触，也就不会发生毒性和过敏反应。并且具有天然酶的高度专一性和温和条件下高效催化的特点，还具有一定的机械强度；酶经固定化后，稳定性有较大的提高，还可以反复使用也可储存较长时间。,精选ppt,23,L-天冬酰胺酶的注意事项,1.对病人身体有一定损害。约1/31/2病人有骨髓抑制，表现为白细胞和血小板下降，有的病人可有贫血、凝血障碍、局部出血、感染等。有人报告有的病人有心血管系统

16、症状、脱发、蛋白尿等，极少数病人且可发生胰腺炎。2.可引起过敏反应，故用药前必须先用过敏试验，如有红肿、斑块，则为过敏反应。有过敏史的病人应十分小心或不用。3.不同药厂、不同批号的产品，其纯度和过敏反应均有差异，使用时必须慎重。4.有致畸胎作用，故妊娠早期应禁用。5.肝、肾功能严重损害者忌用。6.溶解后不宜长时间放置，以免丧失活力。,精选ppt,24,L-天冬酰胺酶在医药上的应用,对治疗白血病有显著疗效的L-天冬酰胺酶是第一种治疗癌症的酶。 当L-天冬酰胺酶注射进入人体后，人体正常细胞内由于有天冬酰胺合成酶，可以合成L-天冬酰胺而使蛋白质合成不受影响。而对于缺乏天冬酰胺合成酶的癌细胞来说，本身

17、不能合成L-天冬酰胺，外来天冬酰胺又被L-天冬酰胺酶分解，因此蛋白质合成受阻，从而导致癌细胞死亡。 使用L-天冬酰胺酶时，可能出现过敏反应，偶尔还可以发生过敏性休克，但停药后，这些副作用会消失。因此，在应用这种酶之前，应做皮试。在一般情况下，注射该酶出现的过敏性反应包括发热、恶心、呕吐、体重下降等。对比起可怕的白血病来，这些副作用是轻微的痛苦，在没有找到更好的治疗方法之前是可以接受的。 另外芦笋内富含较多的L-天冬酰胺酶,精选ppt,25,白血病介绍,1概述 白血病（Leukemia）是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病。克隆中的白血病细胞增殖失控，分化障碍，凋亡受阻 2特征 白细胞呈恶性、无限制

18、地增生，浸润全身各组织和脏器，周围血液血细胞有量和质的变化。抑制红细胞和血小板止血的产生，非常容易受伤、出血、感染。,精选ppt,26,白血病介绍,3分类 临床上分为急性淋巴细胞白血病（ALL）、急性非淋巴细胞白血病（ANLL）、慢性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病。 4死亡率 慢淋白血病发病在50岁以后，才明显增多 急性白血病若不经特殊治疗，其平均生存期可能只有三个月左右 急性非淋巴细胞白血病M7血象,精选ppt,27,2. L-天冬酰胺酶的临床应用,精选ppt,28,作用机制,精选ppt,29,国内L-天冬酰胺酶的研究进展,目前,国内临床上应用的L2ASP 主要来源于大肠杆菌,我国天津生化厂于1974 年开始生产E1coli天冬酰胺酶,但由于菌种产酶能力低,提取精制工艺落后,难以与国外产品竞争,再加之其他原因最后停产。为了填补国内空白,1995 年,中国药科大学吴梧桐教授等率先进行了E1coli 天冬酰胺酶ansB基因的克隆和表达研究,并首次在国内成功构建了高效表达L2ASP 的 基因工程菌pKA/ CPU210009 ,工程菌发酵单位比野生株高出100 倍。随后又优化了基因工程菌的培养条件和发酵工艺,确定了重组L2ASP 的纯化路线,并对重组产品进行了鉴定。结果表明,基因工程菌生产的产品质量与天然品从基因序列、蛋白质一级结构