人教版高中生物选修1生物技术实践53血红蛋白的提取和分离课件5

1、专题,5,DNA,和蛋白质技术,课题,3,血红蛋白的提取和分离,栏,目,链,接,栏,目,链,接,蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组计,划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了,后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究与应用，首先需,要获得纯度较高的蛋白质。因此，从复杂的细胞混合物中提,取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常要做的工作,栏,目,链,接,请思考,1,怎样从血细胞中提取血红蛋白呢,2,用猪血和鸡血提取血红蛋白，效果一样吗,栏,目,链,接,栏,目,链,接,一、凝胶色谱法,血红蛋白的分离方法,1,概念,_,凝胶色谱法,是根据,_,相对分子质量的大小,分离蛋白质的

2、,有效方法，也称作分配色谱法,2,原理,形态：微小的,多孔球体,1,凝胶,组成：大多数由,多糖类化合物,构成,结构：内部有许多,贯穿的通道,栏,目,链,接,2,分离原理,相对分子质量较小的蛋白质：容易进入,_,的通,凝胶内部,较长,_,相对分子质量较大的蛋白质：无法进入凝胶内部的通,较长,移,动,速,度,较,慢,通,过,凝,胶,柱,的,时,间,道,路,程,_,栏,目,链,接,较短,移动速度较快，通,道，只能在凝胶外部移动，路程,_,较短,过凝胶柱的时间,_,二、缓冲溶液,1,作用,外界的酸和碱,在一定范围内，缓冲溶液能够抵制,_,对溶,液,pH,的影响，维持,pH,基本不变,2,配制,通常由,

3、1,2,种缓冲剂溶解于水中配制而成，调节缓冲剂,的,_,使用比例,就可以制得在,不同,pH,范围内使用,_,的缓冲液,栏,目,链,接,三、电泳,血红蛋白的分离或鉴定方法,1,概念,电场,迁移,的过程,带电粒子在,_,的作用下发生,_,2,原理,栏,目,链,1,许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有,接,可解离的基团,在,一,定,的,pH,下,这,些,基,团,会,正电,_,带,上,负电,或,_,_,2,在,电,场,的,作,用,下,这,些,带,电,分,子,会,向,着,与其所带电荷相反的电极,移动,_,目,大小,_,形状,以及分子本身的,_,的不同，使带电分子产生,链,接,带电性质的差异,栏,3

4、,电泳利用了待分离样品中各种分子,_,迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离,不同的,_,四、蛋白质的提取和分离过程,蛋白质的提取和分离一般分为四步,样品处理,_,粗分,离,_,纯化,和纯度鉴定,栏,目,链,接,栏,目,链,接,一、血红蛋白的提取和分离的原理,1,蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析,相对分子质量大,相对分子质量小,直径大小,大于凝胶颗粒空隙直,小于凝胶颗粒空隙直,径,径,运动方式,垂直向下运动,无规则的扩散运动,运动速度,较快,较慢,运动路程,较短,较长,洗脱顺序,先从凝胶柱中洗脱出,后从凝胶柱中洗脱出,来,来,栏,目,链,接,2,电泳原理及方法,电泳是指带电粒子在电场的作用下发

5、生迁移的过程。许,多重要的分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等,都具有可解离基团，它们在某个特定的,pH,中会带上正电或负,电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相,反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待,分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性,质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样,品进行分离、鉴定或提纯的目的,栏,目,链,接,琼脂糖凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,在凝胶中加入,SDS,使蛋白,由于琼脂糖本身不带电荷,质解聚成单链，与各种蛋白,各种分子在电场中迁移速度,质形成蛋白质,SDS,复合物,决定于所带电荷性质的差异,使其迁移

6、速度完全取决于分,及分子的大小、形状的不同,子的大小,栏,目,链,接,例,1,关于电泳的说法不正确的是,A,电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过,程,B,带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动,C,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所,带净电荷的多少,D,用,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁,移率完全取决于分子的大小,栏,目,链,接,解析,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所,带净电荷的多少以及分子的大小等因素,SDS,能与各种蛋白,质形成蛋白质,SDS,复合物,SDS,所带负电荷的量大大超过了,蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电,荷差异，使电泳

7、迁移率完全取决于分子的大小,答案,C,栏,目,链,接,1,凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法。但,并非所有的蛋白质都可用此方法进行分离。能分离的蛋白质,分子之间必须,A,具有相同的相对分子质量,B,相对分子质量不同，但都是相对分子量较大的分子,C,相对分子质量不同，但都是相对分子质量较小的分,子,D,具有相对分子质量不同的蛋白质,栏,目,链,接,变式,训练,解析,若在每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变,凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同,属于凝胶分离范围内的各种分子，在凝胶床中的分布情况是,不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙,内，而分子较小的可进入较

8、多的凝胶颗粒内，这样分子较大,欠肿咏洗蟮南韧,这样,就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。分子量大小不同,的多种成分在通过凝胶床时，按照分子量大小,排队,凝,胶表现出分子筛效应,答案,D,栏,目,链,接,变式,训练,二、血红蛋白的提取和分离的实验操作,1,样品处理,1,红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白。采,积的生理盐水，重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明,红细胞已洗涤干净。洗涤次数过少，无法去除血浆蛋白；离心,速度过高和时间过长会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，达不到,用低速短时间离心，吸出上层透明的黄色血浆，再加入五倍体,栏,目,链,接,分离的效果,2,血红蛋白的释放：红细胞在蒸

9、馏水和甲苯的作用下破,裂，释放出血红蛋白,3,分离血红蛋白溶液：将混合液进行离心后，会明显看,栏,到试管中的溶液的分层情况：第,3,层的红色透明液体是血红蛋,目,链,白的水溶液,接,4,透析：目的是除去样品中的相对分子质量较小的杂质,2,凝胶色谱操作,1,凝胶色谱柱的装填,装填前，凝胶用蒸馏水或者洗脱液充分溶胀,凝胶装填要均匀，色谱柱内不能有气泡，一旦发现存,在气泡，必须重装,栏,目,链,接,装填完后，立即用,300,mL,20,mmol/L,磷酸缓冲液充分,洗涤平衡凝胶，使凝胶装填紧密,2,样品的加入和洗脱,加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上,的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭

10、出口,按正确方法加样，不能破坏凝胶面,进行洗脱时，等红色蛋白质接近色谱柱底端时，采用,试管收集,栏,目,链,接,例,2,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳法中加入,SDS,的作用是,A,增大蛋白质的相对分子质量,B,改变蛋白质分子的形状,C,掩盖不同蛋白质分子间的电荷差别,D,减少蛋白质分子的相对分子质量,栏,目,链,接,解析,SDS,是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它,能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分,子的二、三级结构。在样品和凝胶中加入还原剂,SDS,后，分子,被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和,SDS,结合成蛋白,栏,目,SDS,复合物,SDS,所带负电荷的量大大超

11、过了蛋白质分子原有,链,接,的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异，使电泳迁移,率完全取决于分子的大小,答案,C,变,式,训,练,2,下列对凝胶电泳的相关认识，错误的是,A,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率只取决于,分子的大小,B,蛋白质在,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率完全,取决于分子的大小,C,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅用于蛋白质相对分,子质量的测定，还可用于蛋白质混合组分的分离,D,凝胶中加入,SDS,可以消除净电荷对迁移率的影响,栏,目,链,接,变,式,训,练,解析,电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品,中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异,使带电分子产生不同的迁移速度，而,S