DNA-ladder-protocol细胞凋亡操作步骤

1、前言:由于实验室经费问题(我想很多实验室都有这个问题,毕竟很多时候我们没有老外足够的经费),我决定利用DNA LADDER来证明(当然还辅助其它的方法)经过药物处理的细胞发生了凋亡还是坏死,所以一直研究DNA LADDER方法,自己曾经看了文献中的很多方法,自己也尝试了一下,发现还是最经典的是最好的!在整个实验过程得到了wscoco78等战友的大力帮助和建议(下面方案中有一些是wscoco78的原话,表示感谢!),并最终成功了,回顾这一段经历,感觉对自己的科研态度和科研方法都很有启发,整理了一下资料,希望与大家共享!也希望大家能够把自己好的成功方法也贴上来,大家一起努力,相信没有做不好的实验!

2、如果大家有什么这方面的问题,可以发信至:,我会解答大家的问题的!也希望大家批评指正!注:黑色字体部分为P108109的内容(完全一样),其中红色部分为我的改动以及一些建议,希望您能成功!三、DNA裂解分析 凋亡的标准特征之一，是基因组DNA断裂为180-200bp的多条寡核小体片段。此现象可用常规琼脂糖凝胶电泳检测，是凋亡的特征。由于该技术只能提供细胞死亡的定性分析，一般要结合定量的方法以确定样品的凋亡程度。另有需注意的重要之处，一些细胞类型或细胞系(如K562，10T1/2，Raji)在凋亡时不是以此种方式断裂DNA，另外在坏死细胞中也不发生这样的DNA裂解。

3、这不是凋亡细胞的限定性试验，但不论在何系统中，这都是确定细胞死亡有用的特性。 DNA裂解测量有几种方法，包括FACS分析和完整的标记DNA的检测。另一种方法TUNEL，需DNA末端标记，用于单个细胞DNA裂解的测定。凋亡常常伴随有DNA的裂解，这些技术在凋亡测量中都有意义。(一)琼脂糖凝胶电泳 1)将5105细胞移人无菌的1.5-ml Eppendorf管中，4 2000 rmin离心5分钟，弃上清。注意不要使用过多的细胞，否则随后的酶解可能不完全，形成很黏稠的DNA溶液。储军注:细胞接种数:我一般是将细胞按照5105细胞/35mm平皿接种,然后培养两天(因为接种后的细胞 有部分会死亡,所以培

4、养一天的细胞可能会少,个人觉得培养两天比较合适,细胞不要太多了!),然 后再加药物处理,处理时间看您药物的类型和剂量,不过建议您做几个梯度,同时进行,这样可以看出 剂量和时间对细胞凋亡的影响程度,我当时做的是每隔8h,测量一次,太累,建议您每隔12h或者24h 测量一次 离心速度:我是4 2000 rmin离心5分钟,按照我实验室离心机换算RCF(相对离心力)为367g 细胞收集: 贴壁细胞需要把漂浮细胞和贴壁细胞（胰酶消化）一起收集，离心，然后用预冷的 PBS再洗涤一次,注意丢弃上清液要小心,注意不要把细胞吸走了,我一般使用1ml和0.1ml两个移 液枪来操作的,1ml取走大部分上清夜,0.

5、1ml把剩余的小心取走!2)加入20l溶解缓冲液20 mmol/L EDTA，100 mmoll/L Tris，pH8.0，0.8(w/v) SDS 。用移液管尖混匀细胞沉淀。 小心：SDS(见附录5) 不要形成强的旋涡，因为高分子量DNA可能被剪切。储军注: 加入溶解缓冲液前:虽然上清液被丢弃,但是一般在管底还是有少量上清液,此时可以用食指轻 弹管底,使得细胞沉淀尽可能融解,为加入溶解缓冲液后混匀创造条件。 溶解缓冲液的配制: 把EDTA,Tris-base,SDS放在一起搅拌混匀，使用pH计测得其pH值大概 在8.0左右，根本不需要加HCL调pH值!只要你的试剂好（fluka、amresc

6、o、sigma），照 这些经典方法基本上都不需要调pH值，真的很准，上下0.5而已。 混匀细胞沉淀:有了,这步应该可以很好做了, 把枪尖浸入液面下，部分按下按钮(很重要,否 则溶液里有很多气泡,导致溶解缓冲液没有充分混匀啊!)，只是形成暗流，在液面下涌动，气体 不放出来自然无气泡!3)加10l RNA酶A/T1混合液(分别为500U/ml，20000Uml，Ambion Inc)，轻弹管尖混匀，不要形成旋涡。37孵育30-120分钟。储军注: 混匀:方法同2) 我采用37孵育120min,也采用过90min,效果一样 RNA酶A/T1混合液:我只是配了500U/ml的RNA酶A,不需要T1,效

7、果也是很好!,而且我的 RNA酶也没有进行煮沸处理,不过最好是处理一下了! 将封口膜将EP管封好,以免EP管中的液体蒸发4)加10l蛋白酶K(20mg/ml，Ambion)，轻弹管尖混匀，50孵育至少90min，也可过夜。储军注: 在加蛋白酶K之前,轻轻将EP甩几下,使得贴在管壁和管盖上的水滴流至管底 我采用55水浴,时间曾用过3h,4h,6h,过夜,效果差不多,根据您自己的个人时间决定,比如你 现在需要陪MM看碟了,就让它过夜吧,没关系的了! 加入蛋白酶K后，溶液立即出现絮状白色物，蛋白酶K是冷的缘故，加到37的裂解液自然 会出现絮状物，再涌动涌动（同2）,然后再放入55一段时间就消失了，不

8、是什么怪现象 将封口膜将EP管封好,以免EP管中的液体蒸发 做完后, 轻轻将EP甩几下,使得贴在管壁和管盖上的水滴流至管底,这时可以进行电泳或在-20 保存以后跑电泳5)加5l 6DNA加样缓冲液(30甘油，025溴酚蓝)，在含0.5g/ml溴化乙锭TAE的1-1.5琼脂糖凝胶干孔中加DNA样品。小心：甘油；溴酚蓝；溴化乙锭(见附录5) 为了避免由于某些制备液黏稠而致DNA样品损失，推荐加样应在干孔中(电泳池中加入缓冲液之前)。参考加样量为100bp大小。储军注: 胶浓度:1%/1.5%的我都用过,但是发现效果不好,建议使用2%,我就是用的2% 电泳相关参数: 最好选择24V/cm电压，用大的

9、电泳槽（10cm以上）,我使用23cm电泳槽,电 压为45V,跑6h30min 加样缓冲液:我一般每孔加20l样品+4l 10loading buffer(加液缓冲液用量加倍了,主要是 为了使样品中的DNA样品能否充分沉积在孔中)6)低电压电泳，可以促进DNA片段的分离(如35 V，4小时，或至染料泳动到2/3处)。储军注:当胶放入电泳槽后,小心加TAE,以免孔中的样品流到外面 跑电泳过程,注意不要跑歪了,不时调整一下电泳槽的水平7)DNA序列梯最后有紫外光显示，摄影。凋亡细胞形成明显的DNA梯度，而坏死细胞为不清晰的成片条带(或无DNA裂解)。活细胞DNA在胶顶部，是一个高分子量条带。凋亡并

10、不都能形成梯度，这取决于所研究的细胞类型。另外，坏死细胞在某些情况下能产生梯度。凋亡中如发生DNA裂解，通常会失去膜整合性。如因生存力丧失梯度形成明显迟缓，则不像是凋亡发生。储军注:我一般泡20min EB吧,然后将它在水龙头下轻轻漂洗45遍,然后开始照相了,最好使用凝胶成像系统进行拍照,这样效果好,数码相机效果不是特别好注意事项建议使用宽口移液管移取基因组DNA，以避免DNA的剪切。宽口吸头可从商业途径获得，或将200l吸头尖切掉而制得。吸头应高压灭菌，避免DNA酶污染。可以不在琼脂糖凝胶中直接加入溴化乙啶，而是电泳后用含1lg/ml溴化乙啶的TAE缓冲液染1小时，用水脱色后进行DNA显色。

11、储军注:我第一次做DNA LADDER实验时,是自己做的宽口吸头,但后来发现其实没必要,直接使用已灭过菌的tip头效果一样,只要在操作过程小心就行了!实验结果如下(一)细胞凋亡结果说明: 细胞为SP2/0（鼠骨髓瘤细胞），10ug/ml顺铂（终浓度）处理，每隔8h，进行分析.凝胶两端为lamda marker，从左至右分别为空白（未用顺铂处理），处理8h、16h、24h、32h、40h、48h、56h、64h、72h，我可是连续奋斗了三个晚上啊，好累，不过值得，结果非常不错！：）随着时间的累积,细胞凋亡程度在加大,一切都很明显!(二)细胞坏死结果说明: 细胞为SPC-A1（人源肺癌细胞），10

12、ug/ml顺铂（终浓度）处理，每隔8h，进行分析.凝胶两端为lamda marker，从左至右分别为空白（未用顺铂处理），处理8h、16h、24h、32h、40h、48h、56h、64h、72h，我可是连续奋斗了三个晚上啊，好累，不过值得，结果非常不错！：）.随着时间的累积,细胞坏死程度在加大,一切都很明显!说明:本来不想将结果列出的,有点怕有人将我的结果当作自己的成果,我不希望有这种情况出现,毕竟造假是不道德的!祝大家新年快乐!实验顺利!储军2004-1-9于华中科技大学【求助】DNA琼脂糖凝胶电泳方法我准备做DNA琼脂糖凝胶电泳,请教下列几个问题:1.RNA酶A/T1混合液中A/T1是什么

13、,它有什么作用?2.离心后DNA是存在上清液中还是在沉淀中?3.将上清液在等体积的苯酚1氯仿（1:1）、苯酚1氯仿1异丙醇（25:24:1）和氯仿中各提取1次.这一步的作用是什么?4.在上清液中加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积的冷无水乙醇，20静置过夜.这一步作用又是什么?另:如有全面的操作过程请公布一下!非常感谢! 细菌中质粒DNA的制备碱裂解法小量制备质粒DNA1) 挑取培养基上的白色单菌落，接种于5ml含适当抗生素的LB液体培养基中，37振荡培养过夜；2) 取1.5ml菌液于小离心管中，13000rpm离心1-2min，富集菌体，重复一次；3) 菌体沉淀重悬于

14、300ul溶液I中，振荡混匀；4) 加入新鲜配置的300ul溶液II,上下颠倒混匀，冰上放置10min；5) 加入300ul溶液III，轻轻旋转混匀，冰上放置5分钟；6）室温13000rpm离心15min；7) 取上清，加入等体积的Tris-中性酚,混匀后13000rpm离心10min；8) 取上清，再用等体积氯仿抽提一次；9) 取上清,加入2倍体积无水乙醇，上下颠倒混匀至少5min,-20放置30min；10）13000rpm离心15min；11）弃上清, 抽干后溶于适量双蒸水中。质粒提取所需的溶液：溶液I：50mmol/L Tris-Hcl (pH7.5)；10mmol/L EDTA(pH 7.5)；125ug/ml RNase A;溶液II：0.2mol/L NaOH; 1% SDS；溶液III：1.32mol/L KAC苯酚1氯仿（1:1）、苯酚1氯仿1异丙醇（25:24:1）和氯仿中各提取1次使蛋白质变性和抽提蛋白的作用在上清液中加入1/10体积3mol/L醋酸钠使碱裂解变性质粒复性，而基因组由于过大而不能及时复性而和蛋白一起缠绕沉淀倍体积的冷无水乙醇，20静置过夜是充分洗除残留的苯酚氯仿和使质粒沉淀的作用至于RNA酶A/T1混合液中A/T1是什么,它有什么作用?中