Skp2和PTEN在人脑星形细胞瘤中的表达及临床意义

1、Skp2和PTEN在人脑星形细胞瘤中的表达及临床意义生垦塞旦经瘟盘查8年1月第11卷第1期ChineseJournalofPracticalNervousDiseasesJan.2008,Vo1.1INo.1Skp2和PTEN在人脑星形细胞瘤中的表达及临床意义郑杰宋来君孙红卫杜伟党博郑州大学第一附属医院神经外科郑州450052?9?【摘要】目的探讨Skp2和PTEN在人脑星形细胞瘤中的表达及与病理分级的关系.方法免疫组化S-P法检测7O例I级脑星形细胞瘤和8例正常脑组织标本中Skp2和PTEN的表达.结果(1)Skp2,PTEN在人脑星形细胞瘤组中阳性表达率分别为47.1%和50.0%,而在正

2、常脑组织组中阳性表达率分别为0%和100%.从星形细胞瘤I,II级组,III级组到IV级组,Skp2的阳性表达率呈增高趋势,分别为9.1,45.5%,80.8%,而PTEN的阳性表达率呈降低趋势,分别为90.9%,50.0%,15.4.(2)Spearman等级相关检验证实病理分级和Skp2标记指数呈正相关,和PTEN标记指数呈负相关.人脑星形细胞瘤中Skp2和PTEN的表达呈负相关.结论Skp2和PTEN蛋白的表达情况可作为人脑星形细胞瘤的诊断和恶性程度评估的参考资料,可能成为人脑星形细胞瘤治疗的新靶点.【关键词】星形细胞瘤;Skp2;PTEN;免疫组织化学【中图分类号】R730.264【文

3、献标识码】A【文章编号】16735110(2008)01000903ExpressionandclinicalsignificanceofSkp2andPTENinastrocytomaZhengJie,SongLaijun,SunHongwei,eta1.DepartmentofNeurosurgery.theFirstAliatedHospitaltoZhengzhouUniversity.Zhengzhou450052AbstractObjectiveToinvestigatetheexpressionofSkp2andPTENintheastrocytoma,therelationsh

4、ipbetweenthetowandpathologicalclassification.MethodsTheexpressionsofSkp2andPTENweredetectedbyusingimmunohistochemicalSPstainingin70casesofastrocytoma(gradeItoIV)and8casesofnormalbraintissues.Results(1)ThepositiverateoftheexpressionofSkp2andPTENinastrocytomawere47.1and50.0.andthoseinnormalbraintissue

5、swere0and100respectively.FromastrocytomaofgradeI,II,gradeIIItogradeIV,thepositiveexpressionofSkp2raisedgradually,thepositiverateswere9.1%,45.5and80.8.respectively.AndPTENpositiveexpressiondecreasedgradually,thepositiverateswere90.9,50.0and15.4%,respectively.(2)UsingSpearmanrankcorrelationtest,itcoul

6、dbeconfirmedthatpathologicclassificationwaspositivelycorrelatedwithSkp2expressionindexandnegativelycorrelatedwithPTENexpressionindex.Skp2expressionwasnegativelycorrelatedwithPTENexpressioninastrocytoma.ConclusionTheexpressionofSkp2andPTENcanberegardedasdiagnosticandassessmentreferencesofastrocytomaa

7、ndprovideanewtargetgeneforeffectiveremedytoastrocytoma.KeywordsAstrocytoma;Skp2;PTEN;Immunohistochemistry2O世纪9O年代,已认识到肿瘤是一种细胞周期调控异常性疾病,几乎所有的癌基因,抑癌基因的功能效应均与细胞生命活动异常有关,肿瘤的发生和发展与细胞周期分子调控异常密切相关.因此,又可以认为肿瘤是细胞周期性疾病.S期激酶相关蛋白2(Skp2)是对细胞周期调控具有重要作用的蛋白之一,是泛素蛋白连接酶E3中的一种.在细胞周期中主要通过参与细胞调控因子的泛素依赖性蛋白水解途径,参与细胞周期的调控.

8、PTEN是目前发现的唯一具有磷酸酶活性的抑癌基因,可阻止细胞分裂.本研究利用免疫组化技术,旨在了解人脑星形细胞瘤中Skp2和PTEN蛋白的表达,探讨其在人脑星形细胞瘤发生,发展中的作用及相关关系,为临床诊断,治疗提供理论依据,揭示其异常表达与肿瘤恶性程度的关系.1材料和方法1.1材料1.1.1标本来源及资料:本实验设实验组和正常对照组.实验组全部7O例人脑星形细胞瘤标本取自本院神经外科200701200709手术切除标本,男36例,女34例;年龄157O岁,平均35.5岁.病程最长8年,最短2.0月,平均为1.4年.按Kernohan四级分类法又分工,级组22例,级组22例,级组26例,术前均

9、未行放射治疗和化疗,所有切片术后均经HE染色病理学常规检查,均经本院两位资深病理专家认定.对照组8例正常脑组织标本,均来自同期收治的急性颅脑损伤患者因颅内减压而切除的脑组织,并经病理检验证实为正常脑组织.1.1.2免疫组化试剂:鼠抗人Skp2单克隆抗体,兔抗人PTEN多克隆抗体及SP免疫组化试剂盒均为北京中杉金桥生物技术有限公司提供.1.2方法1.2.1免疫组化:免疫组化染色方法严格按试剂盒操作步骤进行.PBS代替一抗作空白对照,Skp2选取已知阳性乳腺癌切片作为阳性对照,PTEN选取已知阳性前列腺癌切片作为阳性对照.1.2.2结果判定:Skp2阳性反应部位以细胞核为主,?1O?中国实用神经疾

10、病杂志2008年1月第11卷第1期ChineseJournalofPraetiealNervousDi!as!Ja.!.:同时有胞浆着色的细胞.以细胞核出现明显棕黄一棕褐色颗粒为阳性细胞,而胞浆出现棕黄色为非特异性染色.PTEN阳性染色主要定位于细胞浆中,染色为棕黄色细颗粒状,细胞核和细胞膜几乎不着色.随机选择5个高倍视野(400倍)计数阳性细胞数,至少计数1000个细胞.参照Fromowitz方法,在高倍镜下对细胞内反应如下评分:(1)无着色为0,淡黄色为1,棕黄色为2,棕褐色为3;(2)阳性范围:G5为0,525为1,269/55O为2,519/575为3,>759/5为4.两项结果

11、相加记为标记指数(LI),并通过LI判断表达强度和表达阳性率.<2为阴性(一),23为弱阳性(+),45为中度阳性(+),67为强阳性(+).弱阳性例数,中度阳性例数和强阳性例数之和作为阳性总数.1.2.3统计学分析:采用检验,四格表确切概率法及Spearman等级相关分析,SPSS10.0统计软件处理.P<0.05为有显着性差异.2结果2.1Skp2和PTEN蛋白在正常脑组织和人脑星形细胞瘤中的表达正常对照组中Skp2蛋白均为阴性表达.Skp2在正常对照组和实验组中的阳性表达率分别为0.0和47.1,两者相比差异有显着性(PG0.05).正常对照组中PTEN蛋白均为阳性表达.PT

12、EN在正常对照组和实验组中的阳性表达率分别为100.0和50.09/6,两者相比差异有显着性(PG0.05).见表1.表1Skp2和PTEN蛋白在正常对照组与实验组中的表达注:P=0.018;P一0.0012.2Skp2和PTEN蛋白在不同病理级别人脑星形细胞瘤组织中的表达Skp2蛋白表达阳性率在人脑星形细胞瘤I,级组中为9.1,IlI级组中为45.5,IV级组中为8O.8.Skp2蛋白表达阳性率随病理级别增高呈增高趋势,各组间相比差异均有显着性(PG0.05).Skp2标记指数与病理分级的关系采用Spearman等级相关分析,结果两者呈正相关(一0.582,P<0.05).PTEN蛋白

13、表达阳性率在人脑星形细胞瘤I,级组中为90.9,III级组中为50.0,IV级组中为15.4.PTEN蛋白表达阳性率随病理级别增高呈降低趋势,各组间相比差异均有显着性(PG0.05).PTEN标记指数与病理分级的关系采用Spearman等级相关分析,结果两者呈负相关(r一一0.618,PG0.05).见表2.2.3人脑星形细胞瘤中Skp2与PTEN蛋白表达问的关系在33例Skp2表达阳性的人脑星形细胞瘤标本中PTEN阳性表达8例,而在Skp2阴性表达的37例中PTEN阴性表达1O例,经统计学分析两者表达呈负相关(rs一一0.478,PG0.05).表2Skp2和PTEN蛋白在各组星形细胞瘤中的

14、表达组别Skp2PTEN一+阳性一+阳性I,级组级组级组.P22222621O2124.6070.0002O11d27.1890.000注:行分割,a与b相比,P=0.007;b与C相比,P=0.011;a与b相比,P=0.003;b与C相比,P一0.0103讨论Skp2的主要功能是作为SCF复合体的底物识别亚基,特异性识别磷酸化的底物,并介导其泛素化降解.Skp2介导多种细胞周期调节因子的泛素化降解,其异常表达必然引起细胞周期的异常,而细胞周期的异常是肿瘤中的常见现象.Skp2在转化细胞系中有过表达,Skp2在肿瘤发生中属于正性调节因子.本研究发现Skp2在正常脑组织组中阴性表达,而在人脑星

15、形细胞瘤各级组中的阳性率表达随恶性程度的升高而增加(PG0.05),表达的标记指数与病理分级呈正相关(一0.582,P<0.05),表明Skp2是细胞周期调控的正性调节因子,具有原癌基因的功能,参与细胞转录及其在肿瘤中过表达等作用.P27kipl作为一种候选抑癌基因,在脑肿瘤中,DavideS用免疫组化和Westernblot检测人脑星形胶质瘤,也证实Skp2与P27kipl呈负相关1.Skp2作为泛素蛋白酶体途径的底物识别序列,因能泛素化降解P27kip1,使肿瘤细胞G1一S期调控发生紊乱,与肿瘤的某些生物学性状,831,1542nO49147125趵中国实用神经疾病杂志2008年1月

16、第l1卷第1期ChineseJournalofPracticalNervousDiseasesJan.2008,Vo1.11No.1?11?预后及治疗应用关系密切.PTEN是一种新发现的抑癌基因,它不仅有抑癌基因的特性,还有磷酸酶的活性,在细胞内信号传导路径调控中起关键作用.通过对此通路的调控,可抑制细胞周期的进展,介导细胞凋亡.本研究发现PTEN在正常脑组织中均阳性表达,而在人脑星形细胞瘤各级组中的阳性率表达随恶性程度的升高而降低(P<0.05),表达的标记指数与病理分级的关系呈负相关(:一0.618,P<0.05).表明PTEN的失活或介导细胞调亡等特性在人脑星形细胞瘤发生中起

17、关键作用.本研究发现Skp2与PTEN在人脑星形细胞瘤中的表达呈负相关(:一0.487,P<0.05).肿瘤抑制蛋白PTEN是一个多功能磷酸酶,它通过磷脂酰肌醇3一激酶(PI3一激酶)通路抑制细胞的生长,控制细胞周期G1/S的转换等,其中P27是关键下游靶2.最近,Mamillapalli等3研究发现胚胎干细胞PTEN缺失引起P27蛋白水平下调,伴随Skp2蛋白表达的增加.相反,在人类胶质母细胞瘤,PTEN蛋白过表达导致P27聚集,伴随Skp2表达的减少;单纯Skp2的过表达可逆转PTEN诱导的P27的聚集,恢复cyclin/CDK2激酶的活性,克服PTEN诱导的G1期细胞周期阻滞;重组

18、Skp2蛋白能使加入PI3一激酶抑制剂的细胞提取物中的P27泛素化.在人前列腺癌组织研究中也发现Skp2蛋白表达与P27及PTEN蛋白表达分别呈负相关4.这些结果及本研究结果表明在脑星形细胞瘤中PTEN低表达或缺失,可能导致Skp2高表达,从而降低P27的表达,提示Skp2蛋白过表达可能是发生和发展的一个重要原因.这也提示Skp2可能是PTEN/PI3-激酶通路调节P27蛋白表达的一个重要成分.综上所述,Skp2和PTEN蛋白参与人脑星形细胞瘤发生,发展过程细胞周期的调控,而且互为影响.本实验表明上述两个基因可作为人脑星形细胞瘤的诊断和恶性程度评估的参考指标,可能成为脑星形细胞瘤治疗的新靶点,

19、可以开发以此分子为靶点的药物.参考文献1HaradaK,Supriatno,KawaguchiS,eta1.HighexpressionofS-phasekinase-associatedprotein2(Skp2)isastrongprognosticmarkerinoralsquarmouscellcarcinomapatientstreatedbyUrincombinationwithradiationJ.AnticancerRes,2005,25(3c):247124752GottschalkAR,BasilaD,WongM,eta1.P27Kip1isrequiredforPTENi

20、nducedG1growtharrestJ.CancerRes,2001,61(5):21052l113MamillapalliR,GavrilovaN,MihaylovaVT,eta1.PTENregulatestheubiquitindependentdegradationoftheCDKinhibitorP27(KIP1)throughtheubiquitinE3ligasescF(Skp2)J.CurrBio1,2001,l1(4):26326743YangG,AyalaG,DeMatzoA,eta1.ElevatedSkp2proteinexpressioninhumanprosta

21、tecancer:associationwithlossofthecyclindependentkinaseinhibitorp27andPTENandwithreducedrecurrence-freesurvivalJ.ClinCancerRes,2002,8(11);34193426(收稿2007-10-26)人mGluR1基因mRNA实时荧光定量PCR方法的建立刀筱芳伍雪英李宁徐亚欧何进宇龚玉来高晋健1)西南民族大学生命科学与技术学院成都6100412)成都三六三医院神经内科成都610041【摘要】目的建立代谢型谷氨酸受体1(mGluR1)基因mRNA表达水平的TaqManreabtimePCR检测方法.方法以actin为内参基因,根据GenBank中人mGluR1及actin基因序列,分别设计了两套特异性引物和TaqMan探针,接着对反应的退火温度,引物浓度