高效液相色谱法培训课件

1、高效液相色谱法,高效液相色谱法（HPLC）是60年代末以经典液相色谱法为基础，引入了气相色谱的理论与实验方法，流动相用高压泵输送，采用高效固定相和在线检测等手段发展而成的分离分析方法 。 与气相色谱法相比具有：适用范围广，样品预处理简单，分离效率高，流动相选择范围广，检测方法多为非破坏性的，流出组分可回收等优点。,第一节 概述,HPLC,液-固吸附,液-液分配,正相色谱 反相色谱,一般反相色谱 离子对色谱 离子抑制色谱,离子交换色谱,一般离子交换色谱 离子色谱 氨基酸分析,空间排斥色谱,凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱,假相色谱,胶束色谱 环糊精色谱,亲合色谱，手性色谱，毛细管电泳,键合相色谱,正相

2、色谱（normal phase） 流动相极性小于固定相极性的分配色谱法称为正相分配色谱。常用的分析柱有: 氨基柱、氰基柱、硅胶柱。 常用流动相为极性小的有机溶剂。 反相色谱（reversed phase） 流动相极性大于固定相极性的分配色谱法称为反相分配色谱法。常用的分析柱有：ODS( C18)， C8， C2。 常用流动相为甲醇-水，乙腈-水。,离子抑制色谱（ion suppression chromatography）调节流动相的pH值，抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的目的。 离子对色谱（ion pair chromatography）将反离

3、子加入流动相中，与呈解离状态的被测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物，从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度，改善分离效果，达到分离目的。 常用反离子有：季铵盐 用于酸类 烷基磺酸盐用于碱类,离子色谱法（ ion chromatography ） 离子色谱是由经典的离子交换色谱发展起来的一种液相色谱技术，利用物质在离子交换柱上迁移的差异而达到分离，用于亲水性阴阳离子的测定。根据是否采用抑制柱，可分为抑制型离子色谱和非抑制型离子色谱。,空间排斥色谱（steric exclusion ） 也称凝胶色谱，依据被分离组分分子尺寸与凝胶空径大小之间的相对关系而分离，类似于分子筛作用。在一定分子线团尺

4、寸内，分子越大，保留时间越短。 凝胶渗透以有机溶剂为流动相 凝胶过滤以水溶液为流动相 对于相同化学组成的高分子化合物，其分子尺寸大小与分子量成正比，因此凝胶色谱可以研究高分子化合物的分子量分布。,胶束色谱(micellar chromatography) 表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度）时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成胶束（胶粒）。 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系，不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。 因胶束色谱法的流动相是多相分散体系，在整个色谱体系中又增加了一相，故也被称为假相色谱（pseudo phase chromatograph

5、y）。,手性色谱(chiral chromatography) 用于分离手性药物对映体的一种有效技术，可分为直接法和间接法两类： 直接法 手性固定相法（chiral stationary phase;CSP) 手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA) 间接法手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR),第二节 高效液相色谱仪,输液泵 多用柱塞往复泵，柱塞向前运动，液体输出，流向色谱柱；向后运动，将贮液瓶中液体吸入缸体。如此往复运动，将流动相 源源不断地输送到色谱柱中。 柱塞往复泵属于恒流泵，流量不受柱阻影响，泵

6、压最高为400kg/cm2。 这种泵具有清洗容易，更换流动相方便等优点，但脉动性较大是其缺点。目前多采用双泵补偿法来克服这一问题。,避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。 例：硝酸、硫酸、盐酸、卤化物， 四氯化碳与异丙醇或四氢呋喃的混 合物，含强络合剂的溶液等。,过滤用滤膜过滤或垂熔漏斗过滤,脱气采用超声或过滤的方法,注意,流动相 使用前,冲洗,使用含酸、碱、缓冲液的流动相后， 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！,进样阀,注意：使用后应清洗！,进样注意点 进样阀的废液出口端高度必须与进样针在同一水平位置，以免虹吸作用，使样品向针筒方向回流，或从废液口流出。 使用前后，要用流动相（不含酸碱等缓冲液）或甲

7、醇或水冲洗针孔，用针孔清洗器）。,进样方法 整个定量圈体积进样为获得好的精密度，进样量应大于定量圈量的2-5倍以上。由于层流影响，需要有过量的样品液来取代管壁上的流动相（见下图）。,例20l定量圈，进样体积不能超过10 l。否则，部分样品将会从出口流失。这是因为由于层流的关系，样品流经管中心的速度是平均速度的两倍。 进样前应用流动相冲洗进样孔，以除去前一针留下的样品。注射针必须清洗干净。,部分定量圈体积进样当样品量少时，采用部分体积进样，进样量由微量注射器手动控制，要求： 不得超过定量圈体积的1/2量,检测器 紫外检测器 可变波长检测器 光电二极管阵列检测器 荧光检测器 电化学检测器 蒸发光散

8、射 示差检测器 质谱,色谱图,min,H,A-曲线 (定性),A-t 曲线 (定量),蒸发光散射检测器,是通用检测器，适用于无紫外吸收的化合物。 原理：组分先引入已通气体（N2,空气 ）的蒸发室，加热，使流动相蒸发而被除去，样品组分形成气溶胶而产生光散射，测定散射光强度而获得组分的浓度信号。,本法中流动相在检测前已蒸发，故梯度洗脱基线稳定。,组分的气溶胶,喷雾,蒸发,检测,注意：流动相必须是挥发性的，不能含缓冲盐，若调节pH可用氨水、醋酸。,质谱检测器,色谱柱 色谱柱有柱管和固定相组成，柱管用不锈钢制成，柱长1030cm，内径26mm，以4.6mm的内径最常用。 根据键合基团极性不同，化学键合

9、相可分为非极性、中等极性和极性三类。 常用色谱柱有： ODS柱、氰基柱、氨基柱等,非极性键合相 表面基团为非极性烃基，如C18 、C8等，主要用于RP色谱。 C18是最常用的非极性键合相，将十八烷基氯硅烷与硅胶表面的硅醇基经多步反应而成。,R1，R2 =H，Cl ， CH3,1（2，3）：1,根据R1、R2基团，含碳量可分为高碳、中碳、低碳型键合相： 高碳 R1=R2 =CH3 载样量大，吸附性能大； 中碳 R1=H, SiO Si(H) C18H37 R2 =Cl SiO 低碳 R1=R2 = Cl,中等极性键合相常见的有醚基键合相，这类键合相根据流动相的极性，可作为正相或反相色谱的固定相，

10、应用较少。 极性键合相可作正相或反相色谱使用 氨基键合相： 硅胶-氨丙硅烷基Si(CH2)3NH2 氰基键合相： 硅胶-氰乙硅烷基Si(CH2)2CN,键合相色谱pH控制在2-8,ZORBAX SB-C18键合相 使用独特的键合方式，用特殊的二异丁基硅烷对硅氧烷键进行保护，防止了极端pH和高温条件下键合相的水解，这些大侧链阻止了键合相的流失，提高了重现性，延长了柱寿命。,新型固定相,注意：pH范围0.8-8.0，最高操作温度90， 缓冲液浓度0.01-0.02M，避免使用磷酸盐与碳酸盐,ZORBAX Extend-C18色谱柱采用C-18二齿结构并用特有的步骤进行双基封端。 在pH高达11.5

11、的条件下，用于分离碱性、酸性、中性化合物，峰形优良，柱寿命长。,色谱柱使用注意点： pH范围2-11.5。使用有机缓冲液，浓度以10-50mM为好。在中高pH下避免使用磷酸盐，碳酸盐缓冲液， 最高操作温度60 ，最佳温度 40。 分离碱性物质，所用流动相pH值应高于被测物pKa一个单位。,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12,ZORBAX RP-HPLC系列柱的使用条件,色谱柱使用与保存 所有色谱柱使用缓冲液后必须用柱体积20-30倍的水冲洗色谱柱 色谱柱 柱体积 冲洗体积 150 4.6mm 2.5ml 50ml 200 4.6mm 3.3ml 65ml 250 4.6mm

12、4.2ml 80ml,保存色谱柱时用100%甲醇或乙腈，柱两端必须用接头密封。 停用数天后最使用时，应先用低流速甲醇冲洗1h左右，然后再换上流动相，否则直接用流动相，柱效会下降，峰形不好。 新柱使用前应用甲醇或乙腈冲洗（0.5ml/min）。,色谱柱失效症状 色谱柱压增高 峰变宽，拖尾，裂峰 塔板数下降，选择性下降，分离度降低 保留值减小或增大,色谱柱失效的原因 进口滤片堵塞 吸附了样品杂质 柱填充不良，使用久， 机械及热冲击造成空洞 固定相遭化学侵蚀,原因 压力 拖尾 塔板数 选择性 保留值 堵塞 # # # 空洞 # # 吸附样品 # 化学冲击 # # # #,柱凹陷出现裂峰现象，填料与色

13、谱柱顶端不齐平，可用相同填料填平凹陷处。 压力影响应避免突然的压力波动与任何的机械与热力冲击，如色谱柱掉在实验台上或骤然改变柱温等。进样过程中转动进样阀太慢引起压力波动，会使色谱峰产生裂隙。,柱压升高原因 强保留样品组分强吸附组分易聚集在柱进口填料上，严重缩短色谱柱寿命。尤其是生物样品提取物、含油成分等。当严重拖尾峰出现时往往是强保留污染物在柱口处聚集的信号。,解决办法 使用保护柱可延长分析柱寿命。 每天实验后应用强溶剂（例甲醇-水等，至少20-30倍柱体积的量）冲洗色谱柱。 并定期进行保养，以低流速的强溶剂较长时间冲洗色谱柱。,样品纯度差有微小的颗粒堵塞管路。 可用滤膜过滤样品后再进样。 样

14、品浓度高连续进样，造成过载。 如果样品吸收度不是太低，使样品浓度在1mg/ml以下较适宜。 流动相中缓冲液浓度过高，有机相比例大在色谱过程中堵塞管路，析出的盐结晶还磨损泵、进样阀密封圈造成漏液。 缓冲液浓度一般控制在20mmol以下较适宜，测定完毕后必须及时用水充分冲洗。,注意！,一旦柱压升高，应停止测定，用水 冲洗数小时或更长时间，待压力下降后 再测定，如果不清楚堵在哪一段，则应 逐级检查，换泵头上滤芯，保护柱等。,柱效低的原因 频繁更换流动相组成加速柱效降低。 最好一根色谱柱使用的流动相成分和pH值相近，如始终在酸性条件下或碱性条件下工作。 色谱柱的选择不合适或使用时间久 更换色谱柱（厂家

15、，型号） 进样操作不当 转动进样阀时应一次转到位，不能过慢或停顿，否则易造成裂峰。,样品溶剂与流动相成分不匹配 样品溶剂与流动相成分不匹配，造成前沿峰或倒峰。如样品用纯甲醇作溶剂，而流动相中甲醇比例很低，这样易出现前沿峰，改变样品溶剂成分或比例，使醇-水比例接近于流动相。,前沿峰,倒峰,结果不能重现 表现为同一样品溶液连续进样所得峰面积相差大，引起这种情况时，可从以下几方面来查找原因：,泵、进样阀、管路漏液造成峰面积变化。 检测器灵敏度改变如果同一样品两次进样峰面积相差10倍或更大倍数，则最可能的原因是检测器的灵敏度被无意中改变，软件的灵敏度改变不会影响峰面积的积分数值。,色谱软件积分方式是否

16、一致尤其是对于色谱峰较复杂的，积分时基线稍有变化将造成峰面积大的变化，如果两峰不是基线分离，则峰切割方式对峰面积有很大影响，有时候采用峰高较峰面积误差小。,样品溶液的稳定性 有些样品在流动相条件下不稳定，放置后会产生杂质峰，应注意。 例如有一样品在流动相溶液中不稳定，配制后于不同时间进样，发现在主峰后会产生一杂质峰，该杂峰随时间而迅速增大。 将流动相中缓冲液换成水后，样品测定液放置15h后仍稳定。,HPLC 法在药物分析中的应用 鉴别 采用标准品对照法 检查 中国药典规定了5种测定方法 含量测定 中国药典规定了2种定量方法 在进行HPLC测定时，中国药典规定要进行系统适用性试验,系统适用性试验

17、 柱效 n=5.54(tR/Wh/2)2 分离度 R= 拖尾因子 T= 重复性 取对照品或样品溶液，连续进样5次，测得峰面积相对标准差RSD应小于2.0%,2(tR2-tR1),W1+W2,W0.05h,2d1,(R 1.5),(T=0.951.05),其中分离度和重复性是更具实际意义的参数(ChP.2005),定量分析方法 内标法 内标物要求： 样品中不含有的组分。 保留时间与待测物相近，但分离度R1.5。（理化性质相近） 有足够的纯度。,外标法-标准对照法 C样=A样/ A标 C标,.,53,日常维护和常见色谱故障,溶剂及样品的准备 过滤溶剂的目的湿防止固体颗粒损伤仪器或柱头；未经过滤的溶

18、剂或者溶剂瓶中生长微生物，都会降低溶剂入口过滤头的寿命，并影响泵的性能，一般要求两天过滤一次。 注意：过滤水相或有机相应该选用不同的滤膜 聚四氟乙烯几乎可以过滤所有的溶剂、酸和碱 尼龙66可以和大多数的有机物、水相容，但是建议不要用于强酸、二氯甲烷和DMF 纤维素滤膜用于水相,.,54,溶剂脱气的方法 氦气脱气 真空脱气 回流加热脱气 超身脱气（最为常用） 避免使用的溶剂 卤化物碱金属溶液及相应的酸溶液 高浓度的无机酸如硝酸、硫酸 能形成自由基的试剂及其混合物 四氯化碳和异丙醇或THF混合液 含强络合剂的溶液,.,55,色谱柱的平衡,为了确保分析结果的再现性，对于反相柱应使用510倍柱体积的流动相平衡色谱柱。 注意：新装到系统的色谱柱需要进行初始化。先断开柱子和检测器