现代科技综述知识文库：结核杆菌的基因诊断技术

1、现代科技综述系列结核杆菌的基因诊断技术科技是人类区别于动物的重要文明之一，是人类对自然规律研究和利用的学科。本文提供对科技基本概念“结核杆菌的基因诊断技术”的解读，以供大家了解。结核杆菌的基因诊断技术结核杆菌的检出和鉴定始终是结核病防治工作中最紧迫的课题，长期以来缺乏一种简便、快速、敏感性高、特异性强的理想方法。随着分子生物学和基因工程技术的发展而研究开发的核酸分析基因诊断技术，以分析病原菌的遗传物质核酸而达到快速、敏感和特异的检出和鉴定目的，为结核病和其它分支杆菌病的快速诊断和分支杆菌的分类、鉴定提供了更先进的手段，在分子和基因水平上弥补了细菌学传统诊断方法的不足。现用于结核杆菌检出和鉴定的

2、基因诊断技术有核酸探针、染色体指纹和聚合酶链反应(体外DNA扩增)等技术。核酸探针：它是能识别特异性核苷酸序列的带标记的一小段单链分子。其制作方法是，将已知标准菌的脱氧核糖核酸(DNA)或其片断标记后与待检菌的靶DNA行复性杂交，组成探针DNA靶DNA双链。标记的参比菌核酸称为核酸探针，与探针菌同源性高的待检菌则可判定为与探针菌同种。迄今为止，在结核杆菌诊断中应用的探针有cDNA探针、全染色体DNA探针和克隆DNA探针。cDNA探针是以分支杆菌核糖体核糖核酸(rRNA)为模板，通过反转录合成而后标记成的探针，与rRNA的基因互补。结核分支杆菌的cDNA探针是群特异性探针，杂交百分率高于10%者

3、为探针阳性。Musial等(1988)检测102株结核分支杆菌分离株，阳性分离率为99%，特异性为992%。由于被检菌中常存在一些中间型，因此，Sherman等(1989)将阳性切值重新划为杂交百分率大于15%者为探针阳性，低于5%为阴性；294株结核杆菌分离株，其敏感性、特异性均达100%。cDNA探针的敏感度为3104结核杆菌，一般用于分离株群的鉴定。Ellner等(1988)曾尝试在临床标本的直接检测中将BACTEC技术和探针技术相结合，缩短了报告时间。176株结核杆菌分离株，23可在2周内检出和鉴定，4周内全部检出；与此相比，罗氏培养基和TH11琼脂平板培养的两周报告率分别为5%和50

4、%，最后报告时间为8周。美国加利福尼亚圣地亚哥基因探针公司生产的鸟复合分支杆菌快速诊断试剂盒和结核复合分支杆菌快速诊断试剂盒已在国外普遍使用。斋藤等(1988)的实验证明，这两个试剂盒具有高度的敏感性和特异性，主要用于液相杂交，测定过程只需两小时，其局限性在于检测菌种种类有限，只能用于检测从培养菌中提取的rRNA，不能直接检查临床标本中的细菌，从而限制了cDNA探针的进一步开发研究和推广应用。全染色体DNA探针是将探针菌的整个染色体核酸剪切并标记制备而成的核酸探针。结核杆菌的染色体核酸是一个分子量为30109道尔顿的大分子，存在种、群、属多种特异性核苷序列。结核杆菌群内的各种染色体同源序列高达

5、776%95%，而鸟型的、细胞内的和堪萨斯分支杆菌同源性分别仅为80%、260%和235%，其他分支杆菌低于5%，因此，用结核杆菌全染色体DNA探针具有很好的群特异性和很高的敏感性，可检测01ng的人型结核杆菌NDA即灵敏度104mgDNA，相当于20000个细菌。Shoemaker(1985)利用斑点杂交加以证明，切点为01gDNA可鉴别结核杆菌和鸟细胞内分支杆菌群。Roberts等(1987)制备了结核杆菌等3种全染色体DNA探针，均显示良好的群特异性，DNA检测灵敏度可达10100pg(相当于104105菌体细胞的DNA)。利用菌液杂交，61株临床分离株鉴定率为93%。中国吴雪琼等(19

6、90)报告所制备的人型结核杆菌全染色体DNA探针也显示相似的群特异性和敏感性。全染色体DNA探针制备较简单，有较好的群特异性，其主要缺点是难于鉴别少数同源性高的分支杆菌，有待进一步研究。克隆的DNA探针即全染色体DNA经限制性内切酶消化后，利用基因工程技术进行重组、克隆、筛选出特异性NDA片段标记形成的NDA探针。Chia等(1988)制备的人型结核杆菌克隆DNA探针可检测005ng的结核杆菌DNA，相当于10000个细菌，与前两种探针具有同样的敏感性。Patel等(1989)报告了两株群特异性克隆DAN PMTb4和PMTb5探针，可用于鉴别结核复合分支杆菌和鸟复合分支杆菌。迄今，克隆的DN

7、A探针的研制未取得突破性进展，主要原因在于分支杆菌的基因遗传背景不甚清楚，对其基因克隆带有很大的盲目性和机遇性，只有对分支杆菌的基因图谱以及它们在发病机理中所起的作用有清楚的了解，才有可能有目的地扩增克隆基因片段，分支杆菌分子生物学才可能有突飞猛进的发展。今后的努力方向是：改进直接检测未培养的临床标本中分支杆菌DNA的方法，如通过聚合酶链式反应扩增标本中特异DNA片段，使敏感性、特异性大大提高，达到快速诊断的目的；探索非同位素标记方法，分析几种主要的致病性分支杆菌的染色体基因序列，并克隆其特异性DNA片段作为探针，从实验室研究过渡到临床应用。染色体核酸指纹技术：核酸探针不能鉴别结核杆菌种下单位

8、型和株，而种下单位的鉴别在结核病流行病学和防治工作中有重要的意义。染色体核酸指纹技术是一种高灵敏度的株和型的鉴定手段。利用染色体经限制性内切酶酶切后，在电泳中呈现数目众多的带谱，经转印后杂交出现不同的杂交带谱表型而达到种和株的鉴别。Collins等(1984)研究了结核杆菌群17种限制性内切酶裂片电泳带谱，发现BSTELL酶切图有最明显的差异。除种间差异外，对两株牛型结核杆菌参比株、结核杆菌H37Rv和H37Ra之间的差异均可鉴别出。Whipple等(1987)认为，转印指纹可检测到微小基因变异，是缓慢生长分支杆菌种、型和株鉴别中最有前景的方法。聚合酶链反应(PCR)：又称体外DNA扩增技术或

9、体外核酸克隆技术，是近几年分子生物学技术最重要的发展。PCR技术融合了快速、高敏感、高特异性、操作方便和无需培养可直接检测临床标本等优点，特别适用于难以培养和生长缓慢的病原微生物的诊断。因此，PCR技术就成为结核病细菌诊断学最令人鼓舞的研究课题。1985年PCR技术用于结核杆菌的诊断，立足于对结核杆菌特异性抗原编码基因和特异性核酸片断的核苷序列分析的基础上。PCR扩增DNA的原理是，用DNA聚合酶引发样板DNA，在所设计的一对引物之间序列特异性合成。经过样板DNA变性，引物与样板DNA结合，聚合酶自动延长引物而合成新的互补单链。此反应在12h自动循环2030次，样板DNA可人工扩增105106

10、倍。扩增后的DNA可电泳检出或以寡核苷酸探针检出，整个鉴定过程可在24h内完成。Hance等(1989)报告PCR检测分支杆菌的敏感性，将结核杆菌65KD抗原编码基因序列的两个引物TB1、TB2扩增到383碱基序列，电泳检出敏感度为50毫微克DNA，相当于600菌体DNA，TB3寡核苷酸探针检测灵敏度可提高10100倍。Pater等(1989)扩增了群特异性克隆片断PMTb4的部分核苷序列，溴化乙锭电泳检测灵敏度可达1ngDNA，相当于1个结核杆菌DNA。Hermans等(1990)也扩增了克隆核酸片断PH7311中158碱基序列，寡核苷酸探针可检测到100ng，相当于20个结核杆菌的DNA。PCR灵敏度高，又可从不同来源的临床标本中检测出分支杆菌DNA序列，在分支杆菌病早期诊断和鉴别上有很高的实用价值，亦不失为在大批人群中进行结核病及其他分支杆菌病流行病学调查和随访的有效手段。总之，基因诊断技术的建立，是结核病细胞学诊断领域中最重大的突破，具有简便、快速、高敏感、高特异性、无培养依赖性等优势，将会为结核病的病因、诊断、治疗、预后、复发和流行病学的研究带来深远的影响。【参考文献】： 1 Shoemaker S A，et alAm RewRespir Dis，1985，131：760