现代科技综述知识文库：水稻外源基因转化

1、现代科技综述系列水稻外源基因转化科技是人类区别于动物的重要文明之一，是人类对自然规律研究和利用的学科。本文提供对科技基本概念“水稻外源基因转化”的解读，以供大家了解。水稻外源基因转化水稻外源基因的转化、表达及其转化植株的鉴定利用已进入实质性启动阶段。首先是因为水稻原生质体培养成苗技术取得了长足进展；其次为提高转化子植株分化率，开发新一代的水稻受体系统也获初步成功。另一方面，DNA直接转化手段从微生物、动物实验向植物细胞的有效移植，特别是外源基因的克隆、提纯、含有根癌农杆菌、花椰菜病毒NOS、35S启动子的多种多样新质核的构建以及高效启动子aefin的发现启用，都是为推动水稻等禾谷类作物基因工程

2、研究不可或缺的杠杆和动力。据哈特(Herdt，1990)估算，现有水稻推广品种的生产潜力可达2182Lhm2，而第三世界国家的实产只有1091L，其中728L减产于抗劣性；364L出于灌溉与施肥不当。对于前者基因工程有着较大的潜在优势：针对育种目标引入生产品种不足的性状，如抗病、抗虫等并避免不良性状的干扰；按照基因图、扩大基因库利用范围，不但从野生稻，甚至包括其他生物种属；鉴定后期表达的某些性状在个体成熟前即可按基因图着手；鉴定隐性可不必自交，节约时间，等等。为此美国洛克菲勒基金会从1985年开始年投资600万美元支持国际水稻生物技术研究。并在以下方面取得了显着成果。开发水稻外源基因转化的高效

3、受体系统，提高转基因植株的得率；开发和提高转化技术程序及新型设备；筛选并克隆具有重大经济效益的目的基因，体细胞工作、花培育种及RFLP技术。水稻基因工程技术不会取代常规育种，它只是带动常规育种进入新层次的阶梯，新型的转基因水稻材料仍然需要田间试验以确立自身的地位。水稻转化中的标志基因与报告基因 水稻原生质体的转化率极低。进行转化细胞选择必需使之具有有效的选择标志。选择培养基能抑止植物细胞生长，但对转化细胞无碍或影响较少。这样经过一定时间的培养和扩增，转化子便会脱颖而出。目前使用广泛的标志基因多属对抗菌素的抗药性。如细菌中Tn5转座子来源的NPT(新霉素磷酸转移酶)基因，所编码的新霉素磷酸转移酶

4、通过对氨基葡糖苷素抗菌类的磷酸化，而使此类菌素失活，因之当培养基中含有一定浓度的卡那霉素或庆大霉素时，NPT的转化细胞可以正常生长；非转化细胞则受到抑制。CAT(氯霉素乙酰转移酶)基因，来自细菌转座子Tn9，产物酶可催化氯酶素形成氯酶素3乙酸、氯霉素1乙酸及氯霉素13二乙酸。同位素14C标记氯霉素用层析法可将底物及其反应物分开。从放射自显影式直接测定放射性强度，即可估算CAT基因的表达活性，十分灵敏简便。hph(潮霉素磷酸转移酶)，潮霉素对大多数植物有毒害作用。把从细菌中分离获得的hph基因用作转化的选择标志，其作用高出NPT20倍，对某些卡那霉素不敏感的基因型效果尤佳。从理论上说，所有在选择

5、培养基上能存活并扩增的细胞克隆应都是转化细胞。但是选择剂并不一定完全抑制或杀灭非转化细胞，这样形成的转化克隆，特别是非单细胞起源的转化克隆常常是转化细胞与非转化细胞的嵌合体。报告基因是指可借以直接测定并确认在受体细胞或器官组织中得到表达的外源基因。在这一意义上抗菌素标志基因也就是报告基因。不过还有一些非选择标志基因，其表达产物，不仅可以定性、定量，而且还可以进行定位。在水稻转化中最为出色的此类报告基因应推GUS(葡糖苷酸酶)。杰夫逊(Jefferson，1986)首先将大肠杆菌中分离获得的GUS基因应用于植物细胞转化，并建立了一整套的检测系统。在转化细胞中GUS可使底物XGlu(5溴4氯3吲哚

6、葡糖苷酸脂)形成兰色沉淀而定位，也可以用荧光分光光度计作定量测定(底物为4MuG，4甲基伞形花酮D葡糖苷酸脂)。1990年胡等(Ching-yeh Hu)报道在水稻中并不能排除某些基因型中有细胞内源GUS的存在。加之在实验操作中可能产生的细菌污染而造成假阳性现象。因此选择适用的基因型是保证实验数据正确性的必要前提。植物细胞启动子与水稻转化 在细菌中功能正常的基因在植物细胞中未必能够表达。原因是缺乏真核类植物细胞可以识别的启动子。因之用于水稻直接转化的基因必须采用质粒重组技术接上在水稻细胞中可资识别的特异性启动子及有关末端顺序。当然作为选择标志NPT或hph等抗药性基因也是重要的组成部分，有些甚

7、至还包含有水稻ARS(自主复制顺)等特定的DNA顺序。事实上水稻基因工作中的启动子都是自然产品。NOS启动子是根癌农杆菌Ti质粒中胭脂碱合成酶的启动子，CaMV35S启动子是花椰菜病毒DNA分子转录mRNA(沉降系数为355)的启动子。转化用基因DNA一般采取质粒分子的形态，便于保存扩增和大量提取。如常用的pB121质粒、启动子为35S、结构基因GUS和一个NOS末端，选择标志为NPT。1984年帕兹科斯基(Paszkowski)等提供了有关用根癌农杆菌中Ti质粒直接转化烟草原生质体的第一手证据。但Ti质粒分子太大(约200000)提取困难，不久即为较小的大肠杆菌粒所代替，从而为构建层出不穷的

8、新质粒转化水稻细胞开辟了广阔的前景。PEG法(Polyethylene，聚乙二醇) 通常用水稻原生质体为受体，经热激处理。PEG(分子量为40006000)浓度为40%，使用携带DNA(小牛胸腺DNA)时效果较佳。一般用量是1g材料游离获得的原生质体加2mlPEG溶液、15g质粒线型分子(pBI含有GUS和NPT基因)充分混和置于室温30min即可完成转化过程。1991年杨金水、南茜(Nancy)等采用新开发的部分酶解以及完整的悬浮小细胞团代替原生质体(转化率06%)亦获得良好结果(转化率05%09%)。电击法 基本原理是利用瞬间高压电脉冲在细胞膜上形成可逆性的微孔通道。处理电压300900V

9、脉冲时间为1218g，电容25F。受体为原生质体或部分酶解小细胞团。使用PEG法后再进行电击法双重处理，转化率会有显着提高。基因枪法 将DNA分子包被于微细钨粒表面，在爆炸压力下使钨粒高速穿透受体细胞或组织，介导外源基因DNA分子整合入核染色体并得以表达。其优点是可以直接瞄准芽或胚组织的分生细胞组织或胚性细胞，获得转基因植株。但钨粒透入深度有一定限度，命中原始分生组织的概率不高。1991年克里斯托(christou)以水稻未成熟胚盾片组织进行基因枪操作通过再分化成苗。在当代及有性后代中GUS基因均显示稳定遗传。低压脉冲电泳转化 为避免电击法对受体细胞的过度损伤、降低转化细胞得率和分化能力而设计

10、的新型转化装置，由低压电泳、脉冲时控和样品标3部分组成。特点是以低压脉冲代替高压电击以长期作用代替瞬间效应。经过一系列测试和改进使用效果理想。转化率在电压3Vcm、脉冲时间30s、电泳时间30min的条件下可达到82%。尤其是对大片段DNA分子转化可能具有现有转化手段所不具备的效果。除此之外，水稻中必曾尝试用酚类诱导物诱导农杆菌直接转化及用花粉管带动外源基因进入受体细胞。但此类实验有些未获得转化植株，有些缺乏充分证据尚有待于验证。外源基因在转基因水稻后代中的表现报道不多。巴特洛(Battraw，1990)在用电击法得到的当代GUS转基因水稻植株中发现只有12个分子拷贝整合进受体染色体组。基因表

11、达区在维管束四周，但不具特异性。克里斯托的转基因水稻后代，GUS基因呈31孟德尔式分离，与烟草中NPT11基因的转基因植物相类似。在现有研究中目前可资实验的目的基因尚仅限于BT毒蛋白、抗菌肽基因等少数非水稻基因库源的材料。它们在水稻中的表达量及其抗虫、抗病的范围及能力仍缺乏可以确信的资料。在抗莠剂方面，如抗Bialaphos的转基因植株，也见有报道(抗性达500ppm)。不少实验室正考虑水稻本身的基因分离，进行DNA大片段分子以及YAC(酵母人工染色体)基因库的研究。前景十分乐观。【参考文献】： 1 Cocking E C,et al. Gene transfer in cereals, sc

12、ience 1987,236:12591262 2 Zhang W , et al. Efficient regeneration of transgenic plants from rice protoplasts and correcty regulated expression of the foreign gene in the plants. Theor Appl Genet, 1988, 76:835840 3 Chrislou P,et al. Production of transgenic rice (oryza sativa L. ) plats from agronomically important indica and japonica varieties via electric discharge particle acceleration of exogenous DNA into immature Zygotic embryos. BiolTechnology. 1991,9:957962 4 Lee N,et al. Huang s,Tan