实验二 碱性磷酸酶的提取及其比活性测定

1、碱性磷酸酶的提取及其比活性测定,带教: 张学礼、戴薇薇 龚张斌、黎志萍,材料选择,细胞的破碎,分离纯化,鉴定,碱性磷酸酶 (ALP , AKP) Alkaline phosphatase,一、实验目的,1、 掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶的原理和方法； 2、掌握酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、得率及纯化倍数的概念及计算； 3、了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般方法。,二、实验原理,1、 AKP概述 催化有机单磷酸酯水解，并有转移磷酸基的作用 最适pH：8.610.3 特点：特异性低,体内位置：细胞膜表面 -肾小管的筛状缘 -肠粘膜的微绒毛 -胆小管的细胞膜缘 -肝窦状腺表面 -胎盘合

2、体细胞滋养层细胞外表面,正常血清： ALP主要来自肝（或胆管）和骨骼，约各占总活性的一半。 临床意义：血清ALP活力增高常见于 -肝胆疾病（胆道阻塞等） -骨骼疾病（佝偻病等） -甲状腺功能亢进 -妊娠和生长期儿童,2、AKP的分离、提取、及纯化,整个制备过程可分为 5 个阶段： 材料的选择和预处理， 细胞的破碎， 提取， 纯化（包括盐析、有机溶剂提取、层析、电泳等）， 浓缩、干燥及保存。, 取材 取酶含量丰富、容易提取、新鲜的组织,本次实验：肝脏, 生物组织与细胞的破碎,机械破碎法 ：高速组织捣碎机、匀浆器、研钵 渗透破碎法 ：低渗条件使细胞溶胀而破碎 反复冻融法 ： 超声波法：超声波震荡器

3、使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎 酶法 ：如用溶菌酶破坏微生物细胞, 选择合适分离提取方法,把混在酶制剂中的大量杂蛋白及其它大分子物质（核酸、脂类、多糖）去除掉,把酶从溶液中提取出来,有机溶剂方法,有机溶剂分段沉淀法 原理： 利用不同的蛋白质在不同浓度的有机溶剂中有不同的溶解度而进行分离。,有机溶剂：, 正丁醇 能去除与pro结合的脂类物质，使pro溶解在溶液中 乙醇 30% AKP 溶解状态 60% AKP 沉淀状态 丙酮 33% AKP 溶解状态 50% AKP 沉淀状态,通过离心，去除部分杂蛋白,通过离心，进一步去除杂蛋白, 保护酶活性措施,低温条件下操作 所有试管均需洗干净 选择合适

4、的pH及合适的缓冲体系，以稳定酶活性,Mg(Ac)2 NaAc 混合液提取AKP pH 8.8 Tris 缓冲液测AKP活性,保护和稳定AKP,2g新鲜兔肝剪碎匀浆管 加 0.01M Mg(Ac)2- 0.01 M NaAc 混合液2ml ，匀浆 匀浆液入离心管 用4ml上述混合液冲洗匀浆器，并倒 入离心管，混匀，记体积VA A液 A1管 A2管 剩余A液 0.1 ml A液 + 0.1 ml A液 + 4.9 ml 0.01M pH 8.8 Tris 4.9 ml 生理盐水,三、操作步骤,（待测酶活性）,（待测蛋白质含量）,加2ml正丁醇，搅拌3-5，室温放置30，过滤，入离心管,上述滤液

5、加等体积冷丙酮，混匀， 离心2000 rpm、5分钟 上清入回收瓶 沉淀 加4.0 ml 0.5 M Mg(Ac)2, 搅拌，记体积VB B液,0.10ml B 液 + 4.9 ml 0.01M pH 8.8 Tris,B1管 B2管 剩余B液VB,0.1 ml B液 + 4.9 ml 生理盐水,加 0.45VB 冷乙醇 96% 30% ，混匀， 离心 2500 rpm ,5 分钟,（待测酶活性）,（待测蛋白质含量）,上清 弃沉淀,入离心管 ，记体积VB，加 0.83 VB冷乙醇 96%（30% 60% ） 混匀， 离心 2500 rpm ,5 分钟,上清入回收瓶 沉淀,加 0.01M Mg(

6、Ac)2- 0.01 M NaAc 混合液4ml ，搅拌，记体积Vc, C液,C1管 C2管 剩余C液Vc,0.10ml C 液 + 1.9 ml 0.01M pH 8.8 Tris,0.1 ml C液 + 0.4 ml 生理盐水,加0.5Vc冷丙酮 33% ，混匀,离心 2000 rpm ,5 分钟,（待测酶活性）,（待测蛋白质含量）,上述离心结果,上清 弃沉淀,上清入回收瓶 沉淀,加 5ml 0.01M pH 8.8 Tris ，搅拌，记体积VD, D液,D1管 D2管,0.10ml D 液 + 0.9 ml 0.01M pH 8.8 Tris,入离心管 ，记体积Vc,加1/3 Vc冷丙酮

7、 50% ，混匀， 离心 2000 rpm ,5 分钟,剩余D液,（待测酶活性）,（直接待测蛋白质含量）,上述离心结果,比活性： 指单位质量的蛋白质制剂中所含的酶活性单位 比活性= 酶活性单位数 / mg 蛋白,二、实验原理3、建立测定酶比活性的方法,磷酸苯二钠法 原理：,磷酸苯二钠,AKP,苯酚,K3Fe (CN) 6,4- 氨基-安替比林,醌类化合物,= 510nm, 测定酶活性,AKP活性单位定义:,37, 反应15分钟, 产生1ug苯酚 一个AKP活性单位（u）,计算酶活性：,各制剂总AKP单位数（U） = 查表所得值 稀释倍数 总体积,注： A1、B1、C1、D液分别稀释50、50、

8、20、10倍,（标准曲线）,考马斯亮蓝法 （Coomassie Brilliant Blue G-250 ，Bradford法）,考马斯亮蓝G-250红色和蓝色,酸性游离状态,棕红色,465nm,+蛋白质,蛋白质-染料复合物, 测定蛋白质含量,计算蛋白质含量：,各制剂总蛋白含量（mg） = 查表所得值 稀释倍数 总体积,注： A2、B2、C2液分别稀释 50、50、5 倍, 各制剂的比活性，得率及纯化倍数的计算,1、AKP比活性： AKP比活性（U/mg）=,每ml制剂中AKP活性单位数（U）,每ml制剂中蛋白质含量（mg）,2、得率 得率 =,每一制剂中总的酶活性单位,溶液A中总的酶活性单位

9、,100%,3、纯化倍数 纯化倍数 =,每一制剂AKP比活性（U/mg）,溶液A制剂AKP比活性（U/mg）,AKP分离纯化小结表：,有机溶剂体积的计算96%乙醇,VB/中加乙醇96% 30%,（VB/ + VX） 30% = 96% VX,VX = 0.45 VB/,VB/ /中加乙醇（96% ）从30% 60%,（VB/ / + VX） 60% - VB/ / 30% = 96% VX,VX = 5/6（0.83） VB/ /,注意事项,低温条件进行 有机溶剂边加边搅拌 加完有机溶剂后，立即离心，分析沉淀 加有机溶剂的量计算精确 乙醇上层液入回收瓶,比色分析的原理,代表：有色物质对光的吸收能力,入射光 IO,透过光 I,C,L,Beer定律： A C,合并Lambert-