中国药典年版仪器分析增修订概况.ppt

1、现代分析技术的应用进一步扩大,中国药典2010年版一部新修订项目,2010年版二部与2005年版药典主要项目收载情况比对表,柱色谱 纸色谱 薄层色谱 气相色谱,色谱法在2010年版药典的应用,高效液相色谱 离子色谱 凝胶色谱 毛细管电泳,正相色谱 反相色谱 离子对色谱,色谱法的应用：纸色谱,纸色谱的基本原理-分配色谱 固定相-吸附在滤纸上的水 移动相-展开剂 样品在水和展开剂中的溶解度不同，故分配不同而达到分离。例：盐酸苯乙双胍,色谱法的应用：薄层色谱,2010版药典（二部）采用TLC的品种数量，共435个,色谱法的应用：气相色谱,色谱法的应用：高效液相色谱,20世纪70年代中期，HPLC仪开

2、始出现，主要填料：10 m 的无定型硅胶颗粒。 70年代后期，发展了反相液相色谱。 80年代，HPLC 被广泛应用于化合物的分离，主要填料：粒径为5 10 m 球形硅胶。 90年代早期，粒径为 5 m 的高纯硅胶，即所谓的 B 型硅胶被发展，并成为这个行业填料的标准，这种 B 型硅胶含有微量的金属。 90年代后期，为了满足快速分离的需求，发展了 3 m 或 3.5 m 的球形硅胶，其作用和性能逐渐的获得了人们的认同和接受。手性色谱柱的开发。 21世纪早期，为适应超快速的分离要求，粒径小于 2 m 的填料被开发出来，发展出了整体柱、无机和有机杂化硅胶。 目前，市场上流行的分析用的 HPLC 硅胶

3、基质填料主要为 B 型硅胶。,填料发展史,色谱法的应用：高效液相色谱,填料发展史,色谱法的应用：高效液相色谱,技术A：低金属不纯物的含量,色谱法的应用：高效液相色谱,技术B：不同的配体密度,色谱法的应用：高效液相色谱,Inersil（ ODS-2，5m，4.6mm250mm）柱色谱图 （阿奇霉素）,色谱法的应用：高效液相色谱,迪马公司（钻石，5m，4.6mm250mm）柱色谱图,色谱法的应用：高效液相色谱,Waters(XBridgeTMShield RP18 5m，4.6mm250mm)柱色谱图,色谱法的应用：高效液相色谱,资生堂MG5m，4.6mm150mm色谱柱图谱,色谱法的应用：高效液

4、相色谱,2010版药典二部中色谱柱的使用情况,色谱法的应用：高效液相色谱,离子对色谱法是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。 分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。 离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入310 mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相

5、组成及其pH值、离子强度有关。,色谱法的应用：高效液相色谱,色谱法的应用：高效液相色谱,2010版药典主要修订项目 1、色谱柱 （1）常用色谱柱填料粒径310m （2）微径柱填料粒径 约2m（UPLC或UFLC） 硬件须匹配 色谱条件可适当调整 以品种正文规定条件的测定结果为准 2、柱温 （1）通常为室温 （2）以硅胶为载体的普通色谱柱，最高使用温度不得超过 60，（HTLC）,色谱法的应用：高效液相色谱,3、有些色谱条件可适当调整，但流动相比例的调整有明确 规定。组分比例较低者（50%）相对于自身的改变量 不超过30%，相当于总量的改变量不超过10%。如 30%的相对改变量超过总量的10%时

6、，则以后者为准。 4、系统适用性试验 （1）理论板数n 或 （2）分离度R（关键指标） 或 5、拖尾因子 必要时，应规定拖尾因子,基本原理 离子色谱中发生的基本过程就是离子交换，因此，离子色谱本质上就是离子交换色谱。 在离子色谱的基本组成中，重要的和与其他高效液相色谱不同的就是抑制器和电导检测器，离子色谱用的泵是PEEK材料衬里的不锈钢泵。,色谱法的应用：离子色谱,离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸等离子型化合物的分离。,固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季铵基（阴离子交换树脂）。 被分离组分在

7、色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。,色谱法的应用：离子色谱,色谱法的应用：离子色谱,阳离子交换柱 山梨醇及制剂 甘油果糖氯化钠注射液 甘露醇及制剂 利巴韦林及制剂 盐酸二甲双胍及制剂 苹果酸及制剂 富马酸及制剂,阴离子交换柱 肝素钠及制剂 帕米磷酸二钠及制剂 氯膦酸二钠及制剂 硫酸软骨素钠及制剂,例：离子色谱（氯膦酸二钠）,照离子色谱法（附录 J）试验 用阴离子交换色谱柱（推荐使用IonPac AS11-HC，或效能相当），柱温30， 以水为流动相A，以0.1mol/L氢氧化钾溶液为流

8、动相B，梯度洗脱，流速为1.2 ml/min。 检测器为电导检测器，检测方式为抑制电导检测。,用于氯膦酸二钠原料药的有关物质与制剂的含量测定,固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。 它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。 常用于分离高分子化合物，如多糖、多肽、蛋白质、核酸等。,色谱法的应用：凝胶色谱法,色谱法的应用：凝胶色谱法,固定相多孔性凝胶 流动相水凝胶过滤色谱(GFC) 流动相有机溶剂凝胶渗透色谱(GPC) 渗透系数（Kp）仅取决于待测分子尺寸和凝胶孔径

9、大小，与流动相的性质无关。,分离机制： 利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离 排阻色谱可以将尺寸不同的高分子按照保留时间分开。保留时间越小的高分子（也就是流经色谱柱需要时间越短的高分子）的分子量越大，相反，保留时间越大的高分子（也就是流经色谱柱需要时间越长的高分子）的分子量越小。,2010版药典二部采用常压凝胶色谱的品种,2010版药典二部采用高效凝胶色谱的品种,2010版药典二部采用高效凝胶色谱的品种,2010版药典二部采用电泳法的品种,色谱法的应用：电泳及毛细管电泳法,2010版药典二部采用CE的品种,例：毛细管电泳（抑肽酶）,SDS-PAGE凝胶电泳图,例：毛细管电泳（

10、抑肽酶）,生物分析（芯片）仪对抑肽酶分子量和纯度的测定结果,兰州大得利生物化学制药（厂）有限公司提供的抑肽酶的分子量和其它两个厂家的分子量有明显差异。 抑肽酶的纯度测定结果7批供试品都接近100%，可能是抑肽酶和有关物质的分子量相差不大，生物分析（芯片）仪采用的是SDS-PAGE电泳分离的原理，不能将其分离，不能作为分析抑肽酶纯度的方法。,例：毛细管电泳（抑肽酶）,sigma抑肽酶对照品毛细管电泳谱图,例：毛细管电泳（抑肽酶）,供试品毛细管电泳谱图（杭州澳亚生物技术有限公司生产，批号：071015）,例：毛细管电泳（抑肽酶）,色谱法的应用：毛细管电泳,分离模式 毛细管区带电泳CZE 胶束电动毛

11、细管色谱MEKC 毛细管等电聚焦CIEF 毛细管凝胶电泳CGE 毛细管电色谱CEC,高分子化合物的分析 手性化合物的分析,色谱法的应用：液相色谱常用检测器,光学检测器：紫外、荧光、示差折光、蒸发光散射（通用型检测器） 电化学检测器：极谱、库仑、安培 电学检测器：电导、介电常数 质谱检测器 选择性检测器：灵敏度较高,2010版药典二部采用检测器情况,色谱法的应用：液相色谱常用检测器,色谱法的应用：蒸发光散射检测器,优点： 适用于没有特征紫外吸收或紫外吸收很弱的待测物，使用UV时灵敏度更低；无需衍生化而直接测定，避免了衍生带来的误差。 可以应用有强紫外吸收的试剂，如氯仿、丙酮等。 适用于组分复杂样

12、品的分析，可以进行梯度洗脱，基线平稳。 通用型检测器，只要待测物挥发性低于溶剂，即可适用。对不同物质，ELSD相应因子的变化比其它检测器要小得多。 对环境影响不灵敏，室温下即可操作。 没有溶剂前缘峰，适用于保留时间短的物质的检测。 与LC-MS的色谱条件一致，可直接进行方法转换。,色谱法的应用：蒸发光散射检测器,影响ELSD响应的因素 载气流速、雾化器设计与温度、流动相的组成和流速等影响雾化过程。 被分析物的浓度和体积质量决定了进入光散射池的气溶胶中的颗粒的直径。 被分析物的折射指数、光源发出的光的强度和波长、光电倍增管的位置等影响散射光强度。 光电倍增管的灵敏度和入射光的强度决定了检测的效率

13、，反映为实验者所观测的峰面积。,色谱法的应用：蒸发光散射检测器,色谱法的应用：蒸发光散射检测器,图 硫酸核糖霉素有关物质色谱图 （蒸发管温度：65，分流模式）,色谱法的应用：蒸发光散射检测器,图 硫酸核糖霉素有关物质色谱图 （蒸发管温度：110，不分流模式）,色谱法的应用：蒸发光散射检测器,谨慎使用，充分优化实验条件。企业质控人员和药检所人员均需要。 漂移管温度的优化：温度对响应值的影响无明显的规律性。最优温度为在流动相基本挥发的基础上，产生可接受噪音的最低温度。 雾化气流速的优化：流速越大，响应值越低。最优气体流速应是在可接受噪音的基础上，产生最大检测响应值的最低气体流速。,色谱法的应用：示

14、差折光检测器,原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组分浓度。 优点：通用型检测器 缺点： 1）对温度变化敏感 2）对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度检测 3）属于中等灵敏度的检测器,色谱法的应用：示差折光检测器,山梨醇 山梨醇注射液 甘露醇 甘露醇注射液 乳果糖口服溶液,葡甲胺 麦芽糖 乳糖 倍他环糊精 羟丙基倍他环糊精,色谱法的应用：电导检测器,原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电导变化来测定电离物质含量。 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用于梯度洗脱。 缺点：对温度变化敏感（每升高1度，电导率增加2%-2.5%)。 广泛应用于离子色谱。主要用于检测水溶性无机和有机离子

15、。,色谱法的应用：电导检测器,帕米膦酸二钠注射液 注射用帕米膦酸二钠 盐酸头孢吡肟 注射用盐酸头孢吡肟,氯膦酸二钠 氯膦酸二钠注射液 氯膦酸二钠胶囊,色谱法的应用：质谱检测器,色谱法的应用：质谱检测器,离子化方式： 电喷雾 大气压化学电离 MALDI,质量分析器： 四级杆 离子肼 飞行时间 磁分析器 傅立叶变换离子回旋共振,方 法 学 验 证 的 重 要 工 具,红外光谱,红外光谱集，将出第四卷，谱号是唯一性的，如第四卷重新收录了上卷已收录品种的图谱，则上卷图谱作废。 红外光谱广泛应用于原料药的鉴别中，2010年版药典增加了红外光谱在制剂鉴别中的应用。如样品制备方法能够较好地排除辅料的干扰，则

16、采用全谱比较法；如不能，则采用了特征波数法。 对于具有同质异晶现象的药品，应选用有效晶型的图谱，或分别与同晶型对照品/光谱比较；晶型不一致，需要转晶的，应规定转晶条件，给出处理方法和重结晶所用溶剂。,红外光谱主要修订项目,1、原料药鉴别 遇多晶干扰 （1）按规定对样品进行预处理（重结晶与干燥） （2）采用对照品平行操作 （3）采用溶液法 2、制剂鉴别 （1）提取（溶剂的选择） 辅料无干扰，晶型不变 直接与标准光谱比对 辅料无干扰，晶型有变 与对照品同法处理后比对 辅料有干扰，晶型不变 在指纹区选择35个特征谱带 波数允差为0.5% 辅料有干扰，晶型有变 不宜采用红外鉴别 3、多组份原料药的鉴别

17、 可借鉴制剂鉴别的方法 4、混晶中无效或低效晶型的限度控制 采用基线密度计算指定谱带的吸光度后，再计算各晶型的相对含量（甲苯咪唑和棕榈氯霉素）,附一农药残留量测定法,中药中农药残留量的状况 中药材及饮片22个品种,共165批样品 1、方法学 由单一GC法扩大为GC、HPLC、GC/MS和LC/MS 2、农药品种 由24种（其中有机氯9、拟除虫菊酯3和有机磷12）扩充为色谱法124种（其中有机氯和拟除虫菊57、有机磷54和氨基甲酸酯13），按色-质联用法统计则为128种。 3、测定方法分两个层次： 一为色谱法（GC、HPLC） 方法包括样品前处理（提取、净化）、色谱测定、色谱验证和 质谱确证 二

18、为色-质联机法（GC/MS、LC/MS） 方法包括样品前处理（提取、净化）、色-质联机测定,农药分析质谱图及色谱图,53种农药混合标准品GC/MS总离子流图,74种农药混合标准品LC/MS/MS总离子流图,15种有机氯类农药对照品溶液色谱图-ECD,19种有机磷类农药对照品溶液色谱图FPD,附二中药指纹图谱,色谱指纹图谱 确实能够反映中药内在质量的整体变化情况和质量的均一程度 本质上是药典色谱技术在应用上的延伸 控制产品批与批间的稳定切实可行。 2005版收载高效液相色谱特征图谱1项 2010版收载高效液相色谱特征图谱11项，指纹图谱11项 使整体性控制中药质量的方法学和实际应用方面有了大幅度的提高，确保中药质量的均一稳定,中药指纹图谱,中成药收载指纹图谱6项，特征图谱2项。 采用指纹图谱检测的品种 桂枝茯苓胶囊 天舒胶囊 复方丹参滴丸 注射用双黄连 腰痛宁胶囊 诺迪康胶囊 采用特征图谱检测的品种 乌灵胶囊 百令胶囊,注射用双黄连指纹图谱,注射用双黄连药材、提取物、成品的相关性,HPLC 指纹图谱 HPLC 指纹图谱上的10 个峰均得到了明确的指认，指认的峰面积之和已占总峰面积的89%。,肿节风,乌灵胶囊样品色