微生物实验指导书

微生物学实际测试参考指南目录实验1玻璃器皿的清洁、装订和常用灭菌技术3实验2培养基的制备8实验3从土壤11中分离和纯化微生物实验4微生物接种技术14测试5细菌、放线菌、酵母和霉菌的形态学观察17实验6细菌20的简单染色和革兰氏染色实验7大肠杆菌23生长曲线的测定实验8实验室环境和人体表面的微生物检查25实验9乳酸菌的检测28实验一玻璃器皿的清洗、包装和常用杀菌技术目的要求1.学习和掌握卫生棉条制作的目的、原则和方法；2.学习和掌握玻璃器皿的清洗和装订方法；3.掌握高压蒸汽灭菌的基本原理和操作方法。4.了解其他常用消毒灭菌技术的原理和技术基本原则棉塞有两个功能：一是防止杂菌污染；另一个是确保良好的通风。因此，棉塞的质量对实验结果有很大影响。微生物实验中使用的大多数器具在用于培养微生物之前需要清洗、消毒和灭菌。玻璃器皿的包装方法正确合理，能有效防止使用过程中杂菌的污染。玻璃器皿包装后，通常用高压蒸汽灭菌。高压蒸汽灭菌是将待灭菌物品放入密封的加压灭菌锅内，加热灭菌锅内的水，使其沸腾，产生蒸汽。当锅内的冷空气被蒸汽从排气阀迅速排出时，排气阀关闭，继续加热。此时，由于蒸汽不能溢出，灭菌锅内的压力增加，沸点升高，达到100以上的高温，导致菌体蛋白凝结变性，达到灭菌的目的。此外，常用的灭菌方法包括干热灭菌、燃烧灭菌、紫外线灭菌、过滤灭菌等。对于空间灭菌，常用甲醛加高锰酸钾熏蒸、喷洒消毒剂等消毒灭菌方法。实验用品公司棉花、试管、培养皿、纱布、三角瓶、棉线、量筒、牛皮纸(或旧报纸)、LDZX-50KB立式高压蒸汽灭菌锅、常用灭菌工具、药剂等。方法步骤一.棉塞的生产正确的棉塞要求形状、尺寸和紧密度完全适合试管口(或三角形瓶口)，太紧会妨碍空气循环，并且不便于操作。太松不能达到过滤细菌的目的。制造过程如图1所示，包括摘棉、分拣、折角、卷绕、成型、堵管等步骤。当棉塞堵塞时，棉塞长度的1/3应在试管口外，2/3应在试管口内。图1棉塞制造过程用作棉塞的棉花应该由更长的纤维制成。一般来说，脱脂棉不被用作棉塞，因为它容易吸水变湿，造成污染，而且价格昂贵。此外，通气塞常用于微生物实验和科学研究，即几层纱布(一般为8层)相互重叠，或者在两层纱布之间均匀铺一层棉花。这种通气塞通常被添加到装有液体培养基的三角烧瓶口中。接种后，在摇床上进行摇瓶培养，获得良好的通气性，促进菌体生长或发酵。通气塞的形状如图2所示。A.准备期间纱布堵塞；b .消毒过程中包装牛皮纸；c .在培养期间生产纱布图2排气塞二。玻璃器皿的清洁1.不要使用腐蚀性化学品或硬度大于玻璃的物品擦拭玻璃器皿；新玻璃器皿应在2%盐酸溶液中浸泡数小时，并用水彻底清洗。2.用过的器具应该立即清洗。3.强酸、强碱、琼脂和其他可能腐蚀和堵塞管道的物质不能直接倒入清洗槽，而必须倒入废液槽。4.含有琼脂培养基的容器可以5.一般的餐具可以用洗衣粉、肥皂或洗涤剂清洗，油脂过重的餐具应该先擦掉。用煤泥、焦油和树脂浸泡，可以用浓硫酸或40%氢氧化钠或洗液浸泡。蜡或油漆可以加热熔化并擦掉，或者用有机溶剂(苯、二甲苯、汽油、丙酮等)擦掉。)。6.载玻片或盖玻片，先擦去油脂，然后清洗，再用稀洗液浸泡2小时，用清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗，干燥后用95%酒精浸泡备用。7.清洗后的容器应确保玻璃壁能被水均匀浸湿，没有条纹和水滴。三。玻璃器皿的包装1.培养皿的包装A.内框架b .带盖的外筒图3培养皿金属消毒缸培养皿通常用旧报纸紧密包装，每包7-10套，然后用干热或湿热灭菌。如果将培养皿放入金属筒中进行干热或湿热灭菌，则不需要用纸包裹。金属圆筒具有带盖的圆柱形外圆筒，用于保持培养皿的底部框架(图3)放置在金属圆筒中。这可以将框架从圆筒中提出来以固定培养皿。2.移液器的包装准备一个干燥的移液管，将约1.5厘米厚的棉花塞在距其粗头顶部约0.5厘米的地方，以避免将杂菌吹入其中或无意中将微生物吸出试管。棉花应该有适当的弹性(太紧，吹吸液体太费力；如果太松，吹动时棉花会滑落)，然后按照图4的方法将其包裹，然后将吸管收集在一起，用大报纸包裹，并进行干热或湿热灭菌。图4移液管的包装方法和步骤3.试管和三角瓶的敷料用棉塞或硅胶塞堵住管口和三角瓶口后，用双层报纸包裹(如果有牛皮纸更好)，进行干热或湿热灭菌。当试管较多时，通常以7或10个为一组包装，然后用双层报纸包裹。四、灭菌净化设备操作技术(一)高压釜的使用使用高压水蒸气以高强度穿透细胞，杀死所有微生物和细胞。图5 LDZX-50KB灭菌锅图6 LDZX-50KB灭菌锅和控制面板主要的灭菌原理是高温蒸汽(通常为121)作用于细胞一段时间(通常为20-30分钟)，使细胞蛋白质凝结和变性，导致所有微生物变性和死亡。这是最彻底的消毒方法之一。主要操作技术见教材和实验操作程序。(2)清洁工作台的使用1)依次打开电源开关和工作开关，照射紫外线灯20分钟，打开风机10分钟，然后进行实验操作。2)将紫外线灯切换到照明灯(鼓风机保持运转)，打开玻璃门(玻璃门的开启范围不应太高，最好不要超过下巴)，手臂进入操作平台时先点亮酒精灯，然后用75%酒精棉球擦拭工作面，并纠正手的消毒。3)操作时，应在工作台中心的无菌区进行(尽量不要说话)。图7摆斜率4)操作完成后，关闭酒精灯，清洗工作台。离开前，关闭工作台的工作开关和电源开关，将所有物品放回原位，并带走废弃物。(3)其他常用消毒工具图9电烤箱的外观和结构图8微孔膜过滤机理五、实验的具体操作步骤1.容器清洗：清洗玻璃容器，如试管、三角瓶、培养皿等。2.干燥：将清洗干净的试管、三角瓶、培养皿等玻璃器皿放入烘箱中，并保持适当的间距，以确保干燥效果；打开烤箱电源，设定合适的温度(取决于具体情况)和干燥时间。3.制作棉塞：按照选棉、棉整理、折角、卷绕、成型、塞头测试、尺寸调整等步骤。制造合适的棉塞，使得棉塞长度的1/3在试管口的外面，2/3在试管口(或三角瓶)的里面。另外，量筒或吸管4.包装：用牛皮纸或旧报纸一次包装7 10套培养皿。按照切割牛皮纸、放置培养皿等玻璃器皿、缠绕、折叠、包装等步骤进行。包装后的空培养皿和移液器美观大方，不能放置和紧密包装以防止玻璃器皿暴露。5.杀菌：1)打开电源和开关，检查水位指示灯，根据水位指示灯的状态，不要添加或添加适量的水(高水位：不需要水；低水位：视情况而定；缺水：必须加水；无显示：视情况而定)。2)添加灭菌物品(注意：物品不能太密，否则会影响灭菌效果)。3)将锅盖拧到灭菌锅正上方的密封位置(注意：锅盖用手慢慢拧到上部，不要接触密封圈，以免损坏密封圈，也不要将锅盖拧得太高，否则锅盖不能回到上部)。4)根据待灭菌物品的要求设定温度和时间。5)进入工作状态后，检查排气(水)阀，并将阀旋至排气位置。6)当产生大量白色蒸汽时，关闭排气阀，关闭后温度会继续上升(注意：使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷气的排除是否极其重要)。7)灭菌结束，压力降至“0”时，打开排气阀。只有在气体耗尽后才打开盖子。在取东西之前，用锅里的温度来烘干棉条和纱布。(注意：只有当压力降到“0”时，排气阀才能打开，盖子才能拿东西，否则锅里的压力会突然下降，由于内外压力的不平衡，导致容器里的培养基冲出正在燃烧的瓶口或试管口，造成棉签被培养基污染，造成污染，甚至灼伤操作者)。3.其他常见的消毒方法实验结果记录自己制作的实验物品(包括无菌水)的名称、规格和数量。预防措施1.实验前，熟悉实验室的布局，了解实验仪器和用品的放置规则和用途；2.配制无菌水时，试管内的水量一般控制在试管高度的1/53/5，三角瓶中的水量不应超过规格容量的1/2(水量过大，消毒时棉条容易喷溅或弄湿)；3.灭菌锅操作安全。实验思维问题1.为什么要在高压蒸汽灭菌开始前将锅里的冷空气排出？2.灭菌后，当压力降至“0”时，为什么排气阀可以打开，盖子可以打开来取货？3.使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，如何消除所有不安全因素？4.灭菌在微生物实验中的意义是什么？实验二培养基的制备目的要求1.掌握培养基制备的原理；2.通过几种培养基的制备，掌握制备培养基的一般方法和步骤。基本原则培养基是人工配制的适于微生物生长繁殖或代谢产物积累的营养培养基，用于培养、分离、鉴定和保存各种微生物或积累代谢产物。培养基的原料可分为碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水。本实验通过制备适用于普通细菌、放线菌和真菌的三种培养基，了解和掌握了培养基制备的基本原理和方法。通常，牛肉膏蛋白胨培养基用于培养细菌。它是一种广泛使用的天然介质。牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素。蛋白胨主要提供氮源和维生素，氯化钠提供无机盐。高1号培养基是一种用于培养和观察放线菌形态特征的合成培养基。合成培养基包含各种具有已知化学成分的无机盐，这些无机盐可以相互作用形成p加入培养基的所有成分后，用稀酸或稀碱将培养基的酸碱度调节到所需的酸碱度，在制备固体培养基时加入一定量的琼脂作为凝固剂。培养基配制完成后，应立即进行灭菌。实验用品公司1.药物、试剂牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、可溶性淀粉、硝酸钾、K2HPO43 H2O、硫酸镁H2O、硫酸亚铁H2O、蔗糖、纳米3、KCl、葡萄糖、KCl、酵母提取物、乙酸钠、1摩尔/升氢氧化钠、1摩尔/升盐酸、琼脂2.仪器及其他用品试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、角勺、酸碱度试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、细绳、纱布、漏斗、漏斗架、橡胶管等。方法步骤一、牛肉膏蛋白胨培养基的制备(1)配方：牛肉膏5克，蛋白胨10克，氯化钠5克，琼脂15-20克，水1000毫升，酸碱度7.4-7.6；(2)步骤：1.称取根据配方计算的实际剂量后，称取各种药物并放入烧杯中。牛肉膏通常会拿起玻璃棒，放入一个小烧杯或表镜中，称重，用热水融化后倒入烧杯中。它也可以在称重纸上称重，然后放入热水中。当牛肉膏与称重纸分离时，称重纸将立即取出。蛋白胨容易吸收水分，所以应该快速称重。2.溶解在烧杯中，加入少于所需量的水，放在电热套上，用小火加热，用玻璃棒搅拌，待药物完全溶解后补充水至所需量。如果制备固体培养基，将称重的琼脂放入溶解的药物中，加热并熔化，最后补充损失的水。3.调节酸碱度以检测培养基的酸碱度。如果酸碱度呈微酸性，滴加1摩尔/升氢氧化钠，边加边搅拌，用酸碱度试纸随时检测，直至达到要求的酸碱度范围。如果是碱性的，用1毫升/升盐酸调节。通常在加入琼脂之前进行酸碱度调节。注意不要调节太多的酸碱度，以免因回潮而影响培养基中各离子的浓度。4.过滤后的液体培养基可以用滤纸过滤，固体培养基可以趁热用4层纱布过滤，以便于观察培养。但是，对于一般用途的介质，可以省略该步骤。5.包装根据实验要求，制备好的培养基可以装入试管或三角瓶中。可以使用漏斗或分配器来避免培养基粘在喷嘴或瓶口而造成污染。包装数量：固体培养基约为试管高度的1/5，灭菌后制成斜面。建议将瓶子分成体积不超过一半的三角形瓶子。半固体培养基应为试管高度的1/3，灭菌后应垂直放置。6.用普通棉加棉塞管嘴和三角瓶口塞(不图10简单分配器脱脂棉制成的棉塞)。卫生棉条的形状、尺寸和紧密度应该合适，卫生棉条的所有侧面都应该紧紧地贴在管壁上，不留下任何缝隙，以防止杂菌的侵入并促进通风。如果一些微生物需要更好的通风，可以使用通风塞。有时可以用硅胶塞、试管盖或塑料塞代替棉塞。7.用一层牛皮纸或双层报纸包裹三角瓶的棉塞，以防止消毒过程中冷凝水弄湿棉塞。如果培养基单独包装在试管中，应该用5-7片包装在一起，然后用一层牛皮纸包在棉塞周围并用绳子捆住。然后用一个标记来表示培养基的名称、组和日期。8.灭菌上述培养基于121度。c .湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时消毒，应放入冰箱临时保存。9.对倒立摆斜面灭菌后，制成倒立板或斜面。如果是斜面，灭菌后冷却前应将其放入斜面，必要时可将倒置板放入，然后加热熔化制成。10.无菌检查将灭菌后的培养基放入37