细胞工程原理

细胞工程原理,2012.9,细胞工程(cellengineering)是以细胞生物学和分子生物学为基础理论，采用原生质体、细胞或组织培养等试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性，以获得具有新的性状的细胞系或生物体以及生物的次生代谢产物，并发展有关理论和技术方法的学科。细胞工程的核心技术：细胞培养与繁殖目的：获得新性状、新个体、新物质,细胞工程的定义,细胞工程,植物细胞工程,动物细胞工程,植物细胞工程的发展,原因：具备该物种的全套遗传物质,细胞分裂能力越强，全能性越高。,植物动物受精卵生殖细胞体细胞(幼嫩老细胞),第三节脱分化与再分化,一、几个基本的名词术语分生（generating）：是将盆栽1年以上、内生长过于拥挤的植物带根分割成几部分，或将植物分生出来的幼植物体。分化（differentiation）：在某一正在发育的个体细胞中进行形态的、功能的特殊变化并建立起其他细胞所没有的特征，这样建立特异性的过程称之为分化。通常在胚胎发育早期，在某一胚域内具有分化成几种器官和组织的能力(多分化能力)，但随着发育的进行，分化能力就会受到限定。,植物组织培养技术,一、植物组织培养的概念1.概念植物组织培养（Planttissueculture）广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体甚至包括完整植株进行培养的技术。,2.主要特征（1）在培养容器中进行；（2）无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以及害虫等的侵入；（3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。（4）通常打破了正常的植物发育过程和格局；（5）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显微结构进行操作成为可能。,二、植物组织培养类型：根据不同分类的依据可以分为不同类型。1、根据培养材料不同分为：（1）完整植株培养（PlantCulture）：对幼苗和较大植株等的培养。（2）胚胎培养（EmbryoCulture）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。（3）器官培养（OrganCulture）：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花器官的培养。（4）组织培养（TissueCulture）：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。（5）细胞培养（CellCulture）：指对单细胞或较小的细胞团进行培养。（6）原生质体培养（ProtoplastCulture）：指对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养。,矮牵牛茎尖离体培养培养,牡丹成熟胚的离体培养与快速繁殖Matureembryocultureandrapidpropagationoftreepeony,微型月季茎段离体培养,花烛叶片离体快速繁殖,大蒜根尖培养及植株再生,大蒜试管鳞茎诱导,人参细胞悬浮培养,非洲紫罗兰原生质体分离、培养及植株再生,2、根据再生途径分为：（1）器官发生途径（Organogenesis）：直接器官发生途径：植物器官可以直接由外植体上诱导。如茎尖培养。间接器官发生途径：成熟细胞经过脱分化（dedifferentiation）及再分化（redifferentiation）过程而形成新的组织和器官的过程。如叶片培养。（2）体细胞胚胎发生（Somaticembryogenesis）：体胚发生途径是指二倍体或单倍体的体细胞在特定条件下未经性细胞融合而通过与合子胚发生类似的途径发育出新个体的形态发生过程。经体胚发生形成类似合子胚的结构称为胚状体（embryoid）或体细胞胚(somaticembryo).,直接器官发生间接器官发生,体细胞胚胎发生,贯叶金丝桃不定芽直接再生过程,优化培养基无蔗糖1%蔗糖5%蔗糖,无BAPBAP0.1mg/lBAP5.0mg/l无NAA,非洲紫罗兰叶片培养,台湾百合离体培养,大花蕙兰原球茎增殖与植株再生,器官发生途径（原球茎的形成）：,大蒜愈伤组织培养,日本牵牛花的离体培养,禾本科牧草的体胚发生过程,菊花体细胞胚胎发生及植株再生,大蒜体细胞胚胎发生过程,人工种子（Artificialseed，SyntheticSeed）：是指植物离体培养产生的胚状体或不定芽被包裹在含有营养和保护功能的人工胚乳和人工种皮中，从而形成能发芽出苗的颗粒体。作为繁殖材料。,3、根据培养基的类型分为:（1）固体培养（Solidculture）:琼脂、卡拉胶等固化。（2）半液半固体培养(SemisolidCulture)：固液双层。（3）液体培养(LiquidCulture)：震荡、旋转或静置培养。,液体培养的优点：A不使用凝固剂，节约生产成本B营养吸收充分；C操作过程简化。,固体培养：,液体培养,体胚液体培养,不同类型液体培养装置,液体培养体系,菠萝种苗液体培养系统,丹参毛状根培养,三、植物组织培养技术的理论基础植物细胞的全能性(Plantcellulartotipotency）从理论上讲，植物体的每个生活细胞都具有该植物体的全部遗传信息，在特定的离体培养条件下，具有发育成完整植株的潜在能力。,四、植物组织培养技术的发展历史1、早期探索阶段（1930年以前）1893年，Schwann和Scheiden提出细胞学说及植物细胞全能性理论。1902年，德国植物生理学家Haberlandt第一次尝试采用植物组织培养技术对小野芝麻、风眼兰叶肉组织及万年青属植物的表皮细胞进行培养，但未能培养成活。1904年，Hanning首次对十字花科的萝卜和辣根的胚培养成功。1922年，Knudson将兰花种子在离体的条件下非共生萌发。同年，Knotte和Robbins对离体根尖进行了培养。Robbins还对豌豆、玉米及棉花的茎尖进行了培养，只形成一些缺绿的叶和根。1925年，Laibach利用胚培养技术对亚麻的种间杂种胚进行了培养，并于1929年利用亚麻的胚培养来克服杂交不亲和性。,2、植物组织培养技术的初步形成（1930-1960年）1933年，我国植物生理学家李继侗培养银杏胚胎，并发现银杏胚乳提取液可促进离体胚的生长。1937年，White发现B族维生素对离体根培养的重要性。并指出IAA对植物生长发育的控制起重要作用。1937,1938年，Gantheret在培养基中加入上述生长因子，使得柳树形成层诱导形成的愈伤组织连续生长。Nobecomt对烟草种间杂种茎段的形成层细胞培养也得到了类似的结果。1948年，Skoog等通过对烟草茎段和髓培养发现，不定芽和不定根的发生由生长素/腺嘌呤的比例决定。1950年，Ball从红杉愈伤组织培养中再生获得器官。,1952年，Morel和Martin通过分生组织培养获得大丽花的脱毒植株，同年，首次应用微型嫁接技术。1953年，Tuleche首次从花粉培养中获得银杏的单倍体愈伤组织。1955年，Miller等发现了一种促进细胞分裂的植物激素激动素，后来发现激动素可用来代替腺嘌呤促进芽的形成，而且其效力比后者高3万倍。1957年，Skoog和Miller发现改变细胞分裂素/生长素比例，可以控制根和芽的发生。1958年，Maheshwari和Rangaswamy从柑橘胚珠的珠心组织培养中再生获得体细胞胚；同年，Reinert和Steward分别从胡萝卜的愈伤组织和细胞培养中再生得到原胚，为以后的组织培养中器官发生和体细胞胚胎发生奠定了基础，也为植物细胞全能性理论提供了证据。,3、植物组织培养技术的发展（1960年以后）1960年，Morel利用兰花茎尖培养对兰花进行营养繁殖；1962年，Murashige和Skoog开发出最著名的Murashige和Skoog培养基（MS基本培养基），并被后来广泛采用的基本培养基。1964年，印度人Guha和Maheshwari利用曼陀罗花粉培养获得第一例单倍体植株。从而开辟了单倍体育种技术。1971年，Takebe等获得第一例原生质体培养的再生植株。1972年，Carlson等利用原生质体融合在两个烟草属中进行种间杂交。1974年，Murashige等利用细胞分裂素诱导茎尖侧芽分枝。Zaenen和Larebeke分别发现土壤农杆菌（Agribacterium）中的根瘤诱导的主要成分是Ti质粒。1978年，Melchers等进行了番茄和马铃薯的体细胞杂交。,1979年，Marton提出了利用植物原生质体和土壤农杆菌共培养的方法进行转化。1981年，Larkin和Scowcroft引入“体细胞无性系变异（Somaclonalvariation）”这一术语。1982年，Krens等的工作证明，原生质体可以摄入裸露的DNA，表明可以用外源DNA对原生质体进行遗传转化。1982年，Zimmermann利用电刺激进行原生质体融合。1985年，Horsch等用土壤农杆菌对叶盘进行感染和转化，并得到再生的转化植株。,五、植物组织培养技术的应用,1、优质种苗的快速无性繁殖：（1）无性繁殖作物及不易繁殖作物的快速繁殖,园艺植物种苗工厂化生产,兰科植物生产,A,B,E,C,F,G,花烛属植物,厥类植物,盆栽及切花植物的繁殖,珍贵树种,无菌苗快速繁殖,无菌苗驯化,组培苗驯化移栽,茎、芽和小植株的规模培养,经济植物快速繁殖,（2）通过茎尖培养生产脱毒健康种苗：如草莓、香蕉、甘蔗、马铃薯、大蒜等。,virus-freetissue,茎尖培养脱毒,脱毒马铃薯种薯生物反应器液体培养,2、用于植物遗传育种包括种质资源离体保存；花粉花药培养产生单倍体；胚乳培养产生三倍体；胚培养拯救杂种胚克服远缘杂交障碍；原生质体培