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基因组DNA的分离和Southern杂交 付忆，梁辰，刘增辉，李松林 摘要：真核生物DNA主要以核蛋白形式存在于细胞核中，因此制备DNA必须先粉碎组织，裂解细胞膜和核膜，使核蛋白释放，在除去蛋白质、脂类、糖类和RNA等物质，得到纯化的DNA。Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列。关键词：基因组DNA，Southern杂交，琼脂糖凝胶电泳Abstract：Eukaryote DNA mainly exit in nucleus as nucleoprotein, before preparing DNA ,we should comminute the tissue, split the cell membrane and the nuclear membrane, then nucleoprotein will be released. When we remove the protein, lipoid, carbohydrate and RNA, we get pure DNA. Southern hybridization often used to detect whether the DNA fragment which was cut by restriction enzyme and probe have the same sequence.Keywords:Eukaryote DNA, Southern hybridization , agarose gel electrophoresis实验原理在低温下制备鼠肝DNA，为了使DNA酶失活，避免降解基因组DNA。通常情况下在有液氮条件下进行，产量和质量都比在无液氮条件下高。但本实验在冰水中制备鼠肝，也较好的保持了DNA不被降解。Southern杂交是由Southern等人于1977年发明的一种检测DNA分子的一种方法。通过Southern印迹转移将琼脂糖凝胶上的DNA分子转移到硝酸纤维素膜上，然后进行分子杂交，在滤膜上找到与核酸探针有同源序列的DNA分子。实验材料：0.2g鼠肝，琼脂糖，生理盐水，无水乙醇，无菌水，酚/氯仿/异戊醇，氯仿/异戊醇，3mol/L NaAc，TE缓冲液，浆液（Buffer A）500mL，溴酚蓝染料，终止液 500mL，测活液 30mL，5x电泳缓冲液（pH 8.3）600mL，印迹缓冲液（pH 8.3）2000mL，R-250染色液 500mL，10xPBS 500mL，Gold View，10X loading-buffer，Hind III，探针，酶解液，检测缓冲液，变性溶液，抗体溶液，封闭液，洗涤液，预杂交液，杂交液，SSC，SDS。实验方法：一、小鼠基因组DNA的分离本实验在无液氮的条件下，制备鼠肝DNA，与有液氮条件下相比，产量和质量都有所下降。整个操作过程中，应尽量避免DNA酶的污染，特别注意动作温和，减少对DNA的机械损伤。1取0.2g鼠肝，用冰冷的生理盐水洗3次，然后置于2.0mL匀浆液中，用玻璃匀浆器匀浆至无明显组织块存在(冰浴操作，切勿将细胞破碎，可镜检观察)。2将组织细胞移至2.0mL离心管中，5000 r/min离心2分钟，(尽可能在低温下操作)，弃上清，若沉淀中血细胞较多，可再加入5倍于细胞体积的匀浆液洗一次。3沉淀加0.8mL无菌水迅速吹散，分成两份，每份加0.4mL酶解液，翻转混匀(动作一定要轻) 55水浴处理1218小时。4向上述酶解后的无细胞悬液中加入RNase 至终浓度200ug/ml，37水浴1小时。5加入等体积酚/氯仿/异戊醇抽提一次，(慢慢旋转混匀，倾斜使两相接触面增大)。4，12000r/min离心5分钟。6用扩口吸头移出含DNA的水相(注意切勿吸出界面中蛋白沉淀；有时如果DNA含量过高，水相在下层实验时注意观察)，加等体积氯仿/异戊醇，4，12000 r/min离心5分钟(若界面或水相中蛋白含量多，可重复5，6操作)。7用扩口吸头小心吸出含DNA的水相，加1/10体积的NaAc，小心混匀(要充分)，再向管中加入2倍体积的无水乙醇，小心混匀(要充分)。 8待基因组DNA脱水成丝，即为染色体丝，用枪头小心吸出液体, 染色体丝用75冷乙醇洗涤一次，12000 r/min离心5分钟，室温干燥(不要太干，否则DNA不易溶解)，加入200uL TE缓冲液，存放于4，溶解过夜，即可得到哺乳动物基因组DNA。二、琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA1将有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好 (一定封严，不能留缝隙)。2将有机玻璃内槽放置于水平位置，并放好样品梳子。3将称取0.2g琼脂糖放入三角瓶中，加入25mL 1TAE，用封口膜封住三角瓶的上口，在微波炉中将琼脂糖溶化。4待冷到60左右的琼脂糖凝胶液时，加入1L Gold View核酸染料，轻轻混匀，将混匀的胶液缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面 (注意不要形成气泡)。5待胶液凝固后，取下橡皮膏，将有机玻璃内槽放入电泳槽内。6加入电泳缓冲液（1TAE）至电泳槽中使缓冲液刚好没过胶平面，轻轻取出梳子。7加样：DNA样品中按照10：1的比例添加10凝胶加样缓冲液(loading-buffer)，混合均匀,用移液枪将DNA样品加入样品孔中。(记录点样顺序及点样量)。8电泳：接通电泳槽与电泳仪的电源，恒压80V (注意正负极，DNA片段从负极向正极移动)。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。当溴酚蓝指示剂移动到距凝胶前沿12cm处，停止电泳。三、基因组DNA的酶切1在灭菌的0.5mL管中，按下表准备酶切反应体系核酸10 x buffer KH2OHind III基因组DNA 50uL10uL32uL8uL2. 37oC保温两小时。3. 加入110体积的3mol/L NaAc pH5.2和2倍体积的无水乙醇。4. 室温沉淀20分钟5. 12，000r/min 离心10分钟。6. 室温干燥。7. 加入10uLTE溶解。四、酶切产物的琼脂糖凝胶电泳1将50TAE稀释50倍，即为1TAE21%琼脂糖凝胶25mL(1TAE),含1uL GoldViewTM3加样： DNA Marker 8uL（DL15000或DL2000plS） 质粒10uL 1uL 10loading buffer 酶切产物（鼠肝）10ul 1uL 10loading buffer基因组DNA （鼠肝）6ul 0.6uL 10loading buffer4电泳：恒压80V电泳。当溴酚蓝染料移出凝胶前沿10min后，停止电泳。5凝胶成像仪观察和记录电泳结果。五、Southern 转膜：（注：以下操作要戴上一次性手套）1用刀片切掉未用过的凝胶区域，并将凝胶切掉一个角（对点样顺序做个标记），然后转至玻璃平皿中。2在室温下将凝胶浸泡在变性溶液中15分钟（目的是使DNA双链变性成单链），并轻轻摇动。更换变性液继续浸泡凝胶20分钟，并轻轻摇动使DNA充分变性。3将带正电荷的尼龙膜裁成比凝胶大一毫米大小，并在相应位置上剪掉一个角，再切六张与尼龙膜一样大小的滤纸，然后用重蒸水浸湿，再放入碱性转移缓冲液中浸泡约30min。4制作夹心饼式的结构（由下至上):三张潮湿的滤纸膜凝胶三张潮湿的滤纸（胶与膜的切角对齐,千万不要有气泡）两层长滤纸三层湿滤纸凝胶n+ 尼龙膜三层湿滤纸十层干滤纸10cm吸水纸5在玻璃板上先放上约10cm高的吸水纸，并在其上放上10层同样大小的干滤纸。将夹心饼结构放到其上。在其上放两层浸湿转移缓冲液的滤纸（滤纸的两端浸入转移缓冲液中）。盖上盖子，让凝胶上的DNA下行转移16小时或过夜。盖子紫外下检测凝胶上的核酸是否转移到膜上6将尼龙膜与凝胶剥离，将膜浸在中和缓冲液中，室温15分钟，并轻轻摇动。更换中和缓冲液继续室温浸泡15分钟，并轻轻摇动。六、探针标记（PCR法）：1在0.2mL PCR管中按下表加入下列试剂：10buffer 2LdNTP标记混合物（含DIG11dUTP） 2L模板（T-载体-643bp） 1L10umol/L引物（sence） 1L10umol/L引物（antisence） 1L无菌水 12uLTaq酶 1L（1.5U）2. 按下列条件进行PCR扩增：94预变性5min， 94变性30s， 55，复性30s， 72延伸30s ，30个循环，最后 72继续延伸10 min。3终止：将完成标记后的反应物煮沸5min，立即放入冰浴中,冷藏（20）或直接用于杂交。七、Southern 杂交：1预杂交：将膜放入杂交管中，加入预杂交液，在65杂交炉中预杂交5-6h（4保存一周）。（将杂交膜上的非特异性DNA结合位点封闭，减少与探针的非特异性吸附降低杂交结果的本底）。2探针变性： 完成标记后，将探针100加热5min变性，迅速将探针放入冰水浴中冷却。3杂交：将含膜的杂交管从4转入杂交炉中，待杂交液变清后取出，打开盖子，将预杂交液倒出。加入含有探针的新鲜杂交液。将杂交管放在62杂交炉杂交16小时或过夜。4洗膜：（洗膜目的是将滤膜上未与DNA杂交的及非特异性杂交的探针分子从滤膜上洗去） 一洗：2SSC 0.1%SDS 15min2，室温慢摇。 二洗：1SSC 0.1%SDS 15min2，室温慢摇。 三洗：0.5SSC 0.1%SDS 15min2，6568慢摇。四洗：0.1SSC， 15min，室温慢摇。八、检测：1将膜放入洗涤液中，在1525振摇5min。2将膜放入封闭液中，保温40min。3将膜放入抗体溶液(用封闭液1：5000稀释DIGAbAP)中，保温30min。4用洗涤液洗涤膜两次，每次20min。5将膜放入检测缓冲液中，平衡25min。6将膜放入2mL新鲜准备的有色底物溶液(2mL检测缓冲液 40uL NBT/BCIP)中，避光使可见的有色斑点产生（千万不能振动）。7终止反应：待颜色达到所需的程度时，用无菌水或TE浸泡5min即可终止反应。实验结果：1. 基因组经Hind III酶切后电泳结果图1：酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图结果：从左至右上样顺序是：DNA marker、含AKP重组质粒、酶切鼠基因组1、大肠杆菌K12基因组1、大肠杆菌K12基因组2、酶切鼠基因组2、酶切大肠杆菌K12基因组1、酶切大肠杆菌K12基因组2、鼠基因组、酶切大肠杆菌K12基因组3。可见，DNA marker条带比较清楚，重组质粒未发现条带，大肠杆菌K12基因组两个样本只有一个隐约可见；其余结果尚可，酶切鼠基因组2号有两条带，但是弥散比较严重。2. Southern杂交结果图2：Southern杂交结果图结果：仅有含酶切鼠基因组2一支条带显示，颜色很浅，淡紫色。这支条带包含了两个片段。实验结果分析与讨论：1. 基因组的分离基因组分离对实验操作的要求比对质粒的高。首先要避免内源和外源的DNA酶的降解。在实验中使用液氮（实际未用）、冰上操作、戴手套、使用洁净小指管和枪头都是为尽量减少污染，提高产率。此外实验应加快操作速度，减少操作时间。基因组DNA是很大的分子，很容易受机械剪切断成小片段，这在电泳时就会出现弥散的条带或拖尾现象（如图1第6条带）。实验中要求使用扩口枪头，避免在吸入放出液体时损伤DNA。同时，操作动作应放缓慢。2. 酶切产物电泳2.1. 电泳结果显示从电泳结果来看，由于实验的目的是提取基因组DNA，而且酶切的结果的条带都比较明亮，所以实验比较成功。除了DNA marker外，可以看到别的条带在最亮的片段两端，都有模糊的弥散条带(图 1)。2.2. 结果分析重组质粒没有条带出现，而作为对照的鼠和大肠杆菌的基因组较为弥散甚至没有。这说明用于对照的DNA量不足。可能原因：一方面主要是因为大多DNA用于酶切，用于对照的量较少；另一方面，剩余的DNA因为各种损伤或者降解而成为大小不一的分子，也能形成弥散的条带。限制性内切酶能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列并由此切割DNA双链结构，共有、3类，我们采用的是Hind。理论上来说，只要看条带是不是有多条就可以判断DNA是否被限制性内切酶切开，所以在基因组中应该存在多个Hind III酶切位点，应该切出多个片段，也就是说，在电泳结果上，应该看到多个条带。然而结果中，除了酶切鼠基因组2较为成功的能看出有两条条带外，大多只看见一个条带，推测其原因有二：一是DNA制品的污染，如蛋白质、酚、氯仿等均可影响限制性内切酶的活性，导致酶切效果不佳；二是酶切片段有的太短，在电泳时间内已经跑出凝胶，有的太长，跑的距离太短难以分辨。而呈弥散状的条带，如酶切大肠杆菌K12基因组3，则说明小的DNA片断的形成不是酶切形成的，影响限制性内切酶的因素很多，DNA制品的污染(如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、等)均能抑制酶切活性。另外，机械损伤可能是造成弥散条带的主要原因。AKP重组质粒是实验的阳性对照，它同DNA marker一样是作对照用的。但是我们的结果并没有观察到这个对照的条带。可能是因为保存不当，已经降解。3. Southern杂交Southern杂交是用具有一定同源性的两条单链DNA在一定条件下退火形成双链（常用的是待测核苷酸序列及标记的探针），该过程是高度特异性的。其原理是具有一定同源性的两条核苷酸单链DNA(或DNA与RNA)在一定条件下可按碱基互补原则退火形成双链。 杂交的双方是待测核苷酸序列及标记的探针， 次杂交过程是高度特异性的。 因此只要杂交成功就会在尼龙膜上出现杂交带，代表待测的核苷酸与探针有互补序列。3.1. Southern杂交结果我们使用的探针是AKP序列探针，用DIG标记。用DI