【毕业学位论文】（Word原稿）柞蚕核型多角体病毒lef-3基因、lef-1基因簇的研究及嗜酸性α-淀粉酶在家蚕中的表达特种经济动物饲养硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士 学位论文 柞蚕核型多角体病毒 究及 嗜酸性 on on I 摘 要 用随机克隆法，建立柞蚕核型多角体病毒 (质粒基因组文库；通过对插入片段进行克隆鉴定和序列分析， 首次获得 晚期表达因子 3（ , 基因 、 蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶 基因 ( 晚期表达因子 1(基因 ， 对其进行同源性比对分析。克隆得到了 个 片段，其中一个片断经序列分析表明：该片段含有完 整的 因 ，与其它来源的 因具有很高的同源性。 因的阅读框为 1 110 个核苷酸，编码369 个氨基酸，编码一种 链结合蛋白 (在 27 个氨基酸序列的不完全的阅读框 。 第二个片段总长度为 3 388 序列分析表明：该片段包括 5 个完整读码框，与 苜蓿银纹夜 蛾 多 粒 包 埋 核 型 多 角 体 病 毒 (源性较高的基因、晚期表达因子 1(， 缺失的 因 ( 中 因编码蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶； 码的是晚期表达因子 1（ 分析得到 氨基酸序列有 3 个高度保守同源区，具有引发酶的活性； 因编码结构蛋白 个蛋白在出芽型病毒 (包埋型病毒 (都存在。 本论文首次应用家蚕 酸性 此 酶基因长 3 906 码 1 301 个氨基酸，蛋白质理论分子量 140 克隆进大肠杆菌表达载体 ）的 因克隆到转移载体 ，用常规方法获得病毒，感染家蚕后嗜酸性 测表达产物具有淀粉酶活性。 关键词 柞蚕核型多角体病毒，单链结合蛋白，晚期表达因子 1，结构蛋白 he is of is a 110 bp 69 to it on as NA a of to SB in be is a 27 it is a to of is to 3 ( is no We of to on is to as NA of be of is a 9 to it is V/is of ( of It PV of 906a 301 of MY 40in by 录 第一章 昆虫杆状病毒分子生物学 . 1 状病毒的分类学地位 . 1 状病毒基因组 . 1 昆虫杆状病毒基因按功能分类 . 2 本论文所涉及的基因 . 3 昆虫杆状病毒 达与复制 . 4 杆状病毒 . 5 第二章 试验材 料和方法 . 7 验材料 . 7 毒株、昆虫细胞和家蚕品种 . 7 粒载体和菌种 . 7 和主要试剂 . 7 它试剂 . 7 要仪器设备 . 8 用溶液和缓冲液 . 8 菌培养基 . 9 虫细胞培养基 . 9 用实验方法 . 10 因组 制备 . 10 法少量快速抽提质粒 . 10 法大量制备质粒 . 10 制性内切酶反应 . 11 段的分离与回收 . 11 连接 . 11 受态细胞的制备 . 12 粒 转化 . 12 组质粒的筛选鉴定 . 12 蚕饲养 . 12 粉酶活力测定 . 13 虫细胞的传代与培养 . 13 胞的冻存 . 13 胞的复苏 . 13 5 细胞计数 . 13 毒滴度的测定 . 14 毒稀释液的配制 . 14 毒 提取 . 15 转染 . 15 组病毒的筛选、纯化和扩增 . 16 列测定 . 16 据统计分析 . 16 第三章 码的 链结合蛋白基因 克隆与分析 17 料与方法 . 17 料 . 17 角体 制备 . 17 角体 隆 . 18 列分析 . 18 果与分析 . 18 因片段的克隆和鉴定 . 18 序结果及 码序列的分析 . 18 NA 因氨基酸序列的同源性比较分析 . 19 链结合蛋白 元分析 . 22 论 . 22 第四章 因组中 3 388 段的克隆与分析 . 24 料与方法 . 24 果与分析 . 24 因片段序列分析 . 24 基因同源性比较 . 25 因簇的编码框排列比较 . 27 基因的氨基酸序列比较及分析 . 28 论 . 29 第五章 嗜酸 性 . 34 言 . 34 . 34 . 34 料与方法 . 36 料 . 36 V 因克隆 . 36 建与筛选重组杆状病毒 . 36 粉酶在杆状病毒表达系统中的表达和样品收集 . 37 粉酶 活性测定 . 37 果与分析 . 37 因的克隆与鉴定 . 37 转染与重组病毒的制备 . 38 力检测 . 38 论 . 40 第六章 全文结论 . 41 参考文献 . 42 致谢 . 48 作者简历 . 49 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 蓿银纹夜蛾 多粒包埋核型多角体病毒 褐带卷蛾 颗粒体病毒 蚕核型多角体病毒 蚕核型多角体病毒 BV 芽型病毒 杉卷叶蛾 果异形小卷蛾 颗粒体病毒 胞释放型病毒粒子 外型病毒 维素酶 基因 毛虫多角体病毒 粒体病毒 国棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒 实夜蛾核型多角体病毒 毒蛾多粒包埋核型多角体病毒 晚期表达因子 园夜蛾核型多角体病毒 衣壳型核型多角体病毒 型多角体病毒 埋型病毒 杉毒蛾多粒包埋核型多角体病毒 角体衍生病毒 草潜叶蛾颗粒体病毒 菜蛾颗粒体病毒 菜夜蛾多粒包埋核型多角体病毒 纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒 粒包埋型多角体病毒 链 合蛋白 皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶 源重复区 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 昆虫杆状病毒分子生物学 1 第一章 昆虫杆状病毒分子生物学 随着现代生物学技术特别是分子生物学和基因工程的研究技术的发展，昆虫杆状病毒的分子生物学特性也得到了不断深入的研究，多种病 毒基因组全序列已被测定，杆状病毒的复制与表达机理得到了深入的阐述。昆虫杆状病毒表达系统作为一个超高效的真核表达系统，在农业、医学和生物学各个领域得到了广泛的应用，目前已经成为当今四大基因工程表达系统（哺乳动物细胞、酵母、细菌和昆虫杆状病毒表达系统）之一。 状病毒的分类学地位 杆状病毒属杆状病毒科，杆状病毒科又分为真杆状病毒亚科 (裸杆状病毒亚科，真杆状病毒亚科分为核型多角体病毒 (颗粒体病毒 (按包膜内核衣壳的多少 分为单粒包埋型多角体病毒 (多衣壳型核型多角体病毒 ( 表种是苜蓿 银纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒 ( 表种是家蚕核型多角体病毒 (吕鸿声 , 1998)。杆状病毒科，包含体杆状病毒亚科，核型多角体病毒属。 状病毒基因组 杆状病毒是一类在自然界中仅感染节肢动物的病毒，绝大多数以鳞翅目昆虫为寄主，病毒基因组是由大型双链共价闭环超螺旋 子构成，基因组为 90 230 均约为 130 毒颗粒呈杆状，自然界中杆状病毒具有高度的宿主特异性，杆状病毒可寄生的昆虫达 600 多种，主要为昆虫纲中的鳞翅目、双翅目、膜翅目、毛翅目、鞘翅目等一些无脊椎动物。 20 世纪 70 年代，杆状病毒基因组的限 制性内切酶分析成为鉴别杆状病毒强有力的工具； 20 世纪 80 年代至 90年代，各种分子生物学技术的应用，杆状病毒基因组结构和功能得到了更加深入的研究。目前多种杆状病毒基因组全序列亦得到测定，有 et , 1994)、 et 1990) 、 黄 杉 毒 蛾 多 粒 包 埋 核 型 多 角 体 病 毒 (et 1997)、云杉卷叶蛾（ 中国棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒 (et 2001)、甜菜夜蛾多粒包埋核型多角体病毒 (1999)、舞毒蛾多粒包埋核型多角体病毒 (国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 昆虫杆状病毒分子生物学 2 1999)、斜纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒 (颗粒体病毒 等多 种杆状病毒基因组全序列得到测定 。 昆虫杆状病毒基因按功能分类 杆状病毒基因的功能是多种多样的，根据它们功能的不同，可进行以下分类： 1）与病毒复制有关的基因： 合酶及解旋酶基因、 ( 2 基因 ( )、 3、 7、 35、 6 种是 制必须的基因 ， 后 4 种对 仅存在于部分杆状病毒中。其中家蚕 合酶是杆状病毒中第三个已克隆并测序的 合酶基因包括一个 码 988 个氨基酸的多肽，氨基酸序列与 同源性分别为 96和 45并含有各种真核生物的及病毒的 合酶都保守的种种序列 (张志芳等 , 1995)。以 旋酶基因为例说明此基因， 解旋酶基因全长3 663 始密码子 合 则，上游存在早期和晚期启动子序列，在上游 有一小顺反子带有符合 律的起始密码子 码的解旋酶内 含 有 合功能域基序；是一种晚期表达因子 (吕鸿声 , 1998)。家蚕 旋酶基因亦已克隆并部分序列测序 (张志芳等 , 1994)。 2）与病毒 达调节有关的基因： 外 )及 、 5、 8、 9(、 9)、 47 等 。 因编码氨基 酸序列发现一个高碱性氨基酸与一个富含胱氨酸结构域， 码蛋白通过激活 达，间接促进其它早期、晚期、晚晚期基因的表达 (et 1992)。 期表达因子 4 编码 464 氨基酸酸性多肽，内含 合基序。 码 401 氨基酸的多肽，早期表达，是晚期与晚晚期表达所需要的基因 (et 1993)。 3）与辅助功能有关的基因：包括 外 )、 外 )及几丁质酶、组织蛋白酶、成 纤维细胞生长因子、蛋白激酶的编码基因 (外 ) ，这类基因不是病毒生存、 制所必需的。这里特别提到组织蛋白酶及几丁质酶，它们一起作用使虫体液化，有利于病毒的传播。 4）与病毒结构有关的基因 ： 0( )、 要 衣壳蛋白 基因 ，编码 347 个氨基酸的多肽，上游有一高度保守区，含有 2 个晚期启动子的核心序列，在 因表达中都起作用。高度保守区的核苷酸序列同源性比编码区更高，达到81 92。 et 1989)和 1989)的主要衣壳蛋白分别有 347和 351个氨基酸残基组成。 因编码 94 氨基酸多肽，称为 白或丝状体蛋白。 白在感染细胞内丝 状 体形成及多角体释放中起有重要作用。此蛋白氨基酸序列有较少保守性，但其共同的结构与功能仍是保守的，氨基端有个结构域有聚合功能 (et 1988)。 5）与核苷酸代谢有关的基因 。 在 存在与核苷酸代谢有关的基因 ： 码核苷酸还原酶大亚基 )和 码核苷酸还原酶小亚基 )。但另外几种病毒无此类基因 ,说明并不是所有杆状病毒复制都需要病毒自身编码此类酶。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 昆虫杆状病毒分子生物学 3 6）与抗细胞凋亡有关的基因 ： 宿主域有关的基因 ： ( 旋酶基因。细胞凋亡或细胞程序性死亡是昆虫抵抗病毒感染的一种自卫机制，杆状病毒中已知有的细胞凋亡抑制基因，代表为 码的 白的 因 (1991)。 因上游具有早期启动子和晚期 启动子，能抑制病毒感染细胞的凋亡， 白影响 胞总的感染性 (1992)。 本论文所涉及的基因 柞蚕杆状病毒基因组研究开始比较晚 , 但进展比较快。自 2001 年由 隆到第一个柞蚕杆状病毒结构蛋白 因以来， 陆续 克隆 得 到了 基因，并对其功能作了分析。 到 2006 年 5 月 ， 因组 全序列已得到了完整的测定。 柞蚕核型多角体病毒病 是柞蚕的主要病害之一，一般发病率在 30%左右，重者达 70% 以上，常年因 此病 减产 30% 左右，有的甚至造成绝产 。因此研究柞蚕核型多角体病毒（ 分子生物学对于柞蚕核型多角体病毒病的防治 、 表达载体的研究 、 基因组图谱 的 构建 均具有重要的意义。 本论文通过随机克隆法，建立基因组文库进行测序分析， 首次获得 了 因， 缺失的 蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶 基因 ( 基因 ， 并对基因序列进行了同源性比较及进化分析，对 因 因参与病毒 制，是病毒 制必不可少的蛋白质因子。根据文献 (1993; et 1995)的研究方法 ， 析认为该基因编码的是一种单 链 合蛋白 ( 功能是与被解链酶解开的单链 合，起到维持复制叉结构稳定与调节 制的作用，并影响基因转录与表达的功能，是 制起始复合物的重要组成部分。 (et 1995)分析了 认 为 早期基因，编码 373 个氨基酸， 码 385 个氨基酸。两者的氨基酸同源性为 41%，虽然许多参与复制的杆状病毒基因已得到确证，但是 病毒和昆虫幼虫活体细胞相互作用的研究还不够充分，至于参与杆状病毒 制的细胞因子，有待进一步分析 (王文兵等 , 2000)。本论文分析的 因阅读框为 1 110 个核苷酸，编码 369 个氨基酸。 因 到目前为止已有 et 2002; et 1994)、 et 1990; et 1999)、 et 1997)、 茶毛虫多角体病毒（ 、 et 1999)等杆状病毒的 因已被测序。 因编码 216 个氨基酸，分子量比较小为 30 780C 端有一个核苷三磷酸 (合位点的特征性基序，感染野生云杉卷叶蛾的 因的氨基酸序列与 源性很高，说明 当保守。应用瞬