【毕业学位论文】（Word原稿）镍冶炼职工氧化损伤修复标志物的作用研究

兰州大学硕士研究生学位论文 镍冶炼职工氧化损伤修复标志物的作用研究 1 第一章 前 言 及其化合物的研究进展 镍及其化合物是重要的工业有色冶金产品，但镍生产过程中的一些镍化合物具有一定毒性，有关流行病学调查和实验室研究已证实某些镍化合物可引起人类健康损害 1。 化性质 的理化性质 镍，银白色硬金属。元素符号 镍的原子序数 28， 原子量 对密度 熔点（ 1453 1） 。 沸点 2732 。不溶于水 ， 可溶于硝酸 ， 稍溶于盐酸和硫酸。镍的无机 化合物中氧化物和氢氧化物不溶或微溶于水 ， 其盐类则易溶于水。 在 20时的密度为 熔点 (1453 )时液体镍的密度为 500为 他镍产品的密度（ g 别为：铸镍 丸 学纯致密镍 单位体积的镍能吸收 体积的氢气。镍在大气中不易生锈，能抵抗苛性碱的腐蚀。大气实验结果表明， 99%纯度的镍在 20 年内不生锈痕，在空气或氧气中，镍的电极位为 25时为 溶液中有少 量杂质，尤其是有硫存在时，镍即显著钝化。 在 20时镍的比电阻为 10 镍基合金虽然广泛用于热元件，但由于易氧化的原因纯镍实际上无此用途。低矫顽力为 的主要化合物及其性质 在自然界里镍存在氧化物、硫化物和砷化物三种基本形态。它的氧化物有三氧化二镍（ 氧化亚镍 (。 低温时稳定，待加热到 400450时即离解为四氧化三镍（ 当温度进一步提高最终变成 可形成多种 两价镍盐，如氧化亚镍溶于盐酸、硫酸、亚硫酸和硝酸等溶液中就会形成绿色的两价镍盐。不稳定的 常作为氧化剂，用于镍电解液净化除鈷（ 熔点为 16501660，易被碳或一氧化碳还原。同时它还具有氧化作用，可使 变成 可以形成稳定的硫酸盐。 兰州大学硕士研究生学位论文 镍冶炼职工氧化损伤修复标志物的作用研究 2 镍的硫化物有硫化镍（ 硫化镍（ 硫化亚镍（ 。 高温下不稳定，在中性和还原条件下受热时离解： 3。在冶炼温度下， 离解 压比 ，但比 。 镍的砷化物有二砷化三镍（ 砷化镍（ 自然界中为红砷镍矿，在中性条件下可解离： 3s。 镍在 40压下，可与一氧化碳（ 成羰基镍 O)43，反应式为 ： i(+ 当温度至 150316时，羰基镍又分解为金属镍。 途及暴露机会 镍及其化合物 (常见的工业毒物 ， 是人类在职业和环境中广泛接触的工业物质之一 。同时镍又是人体必需的生命元素 ,过量的镍会对人体造成危害。随着工业的发展 ， 镍矿的开采和利用日益广泛，职业性镍所涉及的作业和生产达 30 余种，镍及其化合物已成为制造业广泛应用的原材料 ， 接触镍的工业有采矿、 选矿、 冶炼、 熔炼与精炼、合金制造、 化工、电镀、石油提炼 ，染料及硬币制造等。在生产过程中可接触镍粉尘和蒸气。常接触的镍化合物有一氧化镍（ 氧化镍 ( 氢氧化镍 （ H)2） 、氢氧化高镍（ H)3）、硫酸镍（ 7 氯化镍 ( 硝酸镍（ 6等。 谢 镍及其化合物的粉尘不能经皮肤吸收。镍作业工人主要通过呼吸道吸收镍。被机体吸收后的镍及其化合物广泛分布于各组织器官中，随后可经粪便、尿及汗液等排出体外。另外，吸收量与化合物的溶解度有关。镍的可溶性化合物易于被机体吸收并很快排出体外，它通过血液转运至肾 ,由尿排出；而对与镍的不溶性化合物经动物染毒后 ,其在组织中存留时间较长 ， 这可能是其对机体产生有害作用的原因之一。 性 镍化合物经口毒性低 ,金属镍毒性更低。大鼠经口半数致死量（ ： 5 mg/化合物中羰基镍 (无色透明液体，毒性最高，短期吸入高浓度羰基镍可引起急性毒性，表现为呼吸系统和神经系统损害。镍及其水溶性化合物具有致敏性，还有一定的镍化合物具有潜在致癌性与遗传毒性。 从事冶炼、焊接以及煅烧操作的人群可发生过敏性反应、肺癌、口腔癌等病变 2, 3。 炼镍工人呼吸道癌（肺癌、鼻窦癌）发病率增高。动物实验中镍粉、硫兰州大学硕士研究生学位论文 镍冶炼职工氧化损伤修复标志物的作用研究 3 化镍和碳酸镍均能致癌 4, 5。长期接触镍盐或镍粉尘的工人，常有呼吸道刺激症状 甚至肺纤维化 和接触性皮炎等。 皮疹发作期尿镍含量可增高。 而在 镍矿冶炼作业场所中可检测到的多为可溶性镍化合物，这些化合物 对于环境中的生物也有明显的毒害作用，它们呈气雾状，颗粒小，易达肺部，以致肺癌为主；而难溶性镍化合物呈粉尘状，颗粒大，除致肺癌外，易滞留鼻腔致鼻咽癌。两者可呈现联合作用，致癌的危险性会加强。 床症状与处理 镍皮炎也称为 镍痒症 ，佩带镀镍饰品、镀镍器具以及接触金属镍粉和硫酸镍等都可引起变应性皮炎。它的皮损表现与一般接触性皮炎类似，但常伴奇痒。对镍及其化合物高度敏感者，可产生呼吸道损害，如支气管哮喘或肺嗜酸粒细胞浸润症 (合征 )， 可出现轻度咳嗽 ， 低热、胸闷等症状，病灶可呈游走性 ，周围血嗜酸粒细胞轻度增高 ， X 线表现为肺部有散在扇形阴影。大多在 2 4 周内自行恢复正常。尚 可发生急性与亚急性肺炎。 对镍高度敏感者，应脱离镍作业。对于 镍痒症 可按一般变应性接触性皮炎处理。镍引起的呼吸道损害，应给予对症治疗。 毒机制 镍进入机体后能够抑制或激活一系列的酶 , 如抗氧化酶系统、精氨酸酶 , 羰化酶等 , 从而影响体内的代谢 ,对人体产生毒害作用。镍化合物被机体吸收以后 , 可以对先刺激神经系统产生兴奋，过后抑制和麻痹 6。 国外有关报道提示镍及其化合物可以诱导氧化应激发生 ， 产生超氧阴离子自由基和脂质过氧化，可扰乱机体内多种抗氧化酶活力变化 ， 导致对机体造成氧化性损 伤，表观遗传学改变甚至引起细胞突变、肿瘤发生 7, 8。 化应激损伤 镍是一种有效的环境致癌物，暴露于镍可使肿瘤抑制基因的基因位点形成异染色质结构，诱导肿瘤抑制基因的从头甲基化。 镍化合物中的某些物质如羰基镍、氧化镍和硫酸镍等是一类多器官毒物 。 国内外有关报道 提示镍及其化合物可诱导氧化应激发生 ， 产生超氧阴离子自由基和脂质过氧化， 可扰乱机体内多种抗氧化酶活力 ， 导致机体氧化损伤 ，甚至引起细胞突变、表观遗传学改变和肿瘤发生 7。 兰州大学硕士研究生学位论文 镍冶炼职工氧化损伤修复标志物的作用研究 4 化应激 氧化应激（ 指 机体或细胞的促氧化和抗氧化之间失平衡而致的机体损害反应 9，它一般由外源性或内源性 (最常见的是活性氧 由基的产生和机体抗氧化体系的缺陷而引起。 许多学者从不同角度研究外源性化学毒物所致急性肺损伤 ， 研究结果提示 ， 氧化应激和脂质过氧化反应在急性肺损伤发病机制中 可能占有重要地位。而 氧化应激水平的上升，使得机体内氧化抗氧化系统失衡，引起生物大分子如 白质结构和功能改变，进而使细胞结构和功能破坏，引发一系列疾病 10。 化损伤 由基 由于某种原因电子的成对性被破坏 ， 或由于共价键断裂使外层轨道产生带有不配对电子的任何离子或分子均是自由基 11。自由基具有顺磁性、化学反应性高、作用半径与半衰期短的特点。活性氧自由基（ 击生物大分子会造成机体内生物大分子氧化损伤。自由基一类是正常参与线粒体电子转动过程的笼蔽的自由基；另一类是现在研究备受瞩目的自由的非结合状态自由基 12。 自由基的形成分为外源性和内源性 13。 内源性自由基主要是生物体新陈代谢自发产生地自由基，主要来自酶促和非酶促反应。引起外源性自由基产生的主要是能进行氧化 还原反应循环的物质，特别是化学毒物作用，可能是自由基的主要来源。有许多化学物质能够引起组织或细胞 增加，主要通过两种途径：一是阻断电子传递，增加阻断位点上游的还原水平；二是通过氧化还原反应，使化学物还原为不稳定的中间产物，最终形成 ，中间产物则再生为原化学物。在正常的生理情况下大约有组织总耗氧量的 2%用于 产生。 由基对机体的作用 在正常生理状态下，自由基在体内产生和清除达到平衡，从而使机体维持有利的生理性自由基含量。自由基的积极作用是需氧生物进行新陈代谢的必需因子，可以增 强肝脏解毒作用，提高机体免疫力，并参与生殖与胚胎发育过程 14, 15。现已证明，自由基在需氧生物的内分泌、循环、神经等生理活动中作为信号传导分子发挥功能，并在细胞稳态调节等活动中发挥重要作用 16。 一旦机体处于应激状态或机体本身清除自由基的能力下降时，体内自由基就会因不能被完全清除而累积过多，极易与其他物质反应形成新自由基，使机体许多重要的生物大分子如 白质发生结构和功能改变，进而使细胞结构和兰州大学硕士研究生学位论文 镍冶炼职工氧化损伤修复标志物的作用研究 5 功能被破坏，发生不可逆的氧化损伤导致机体病变。 自由基对机体的损伤作用主要表现在：（ 1）通过攻击生物膜磷脂，产生脂质过氧化反应 17。（ 2）蛋白质是自由基攻击的重要靶分子。与蛋白质功能相关的几种氨基酸，如组氨酸、半胱氨酸等，对自由基特别敏感。现已证实，自由基对蛋白质的损伤要早于脂质过氧化的发生 18。由于蛋白质的降解和交联，特别是蛋白巯基的氧化可引起酶活力的改变。而蛋白质的氧化又使它对酶促和非酶促蛋白质水解反应敏感，最终导致蛋白质的破坏和病理性组织降解。（ 3）自由基攻击 螺旋外侧的嘌呤和嘧啶碱基，使得碱基被修饰和双链断裂 19。 可与核酸反应，形成不同类型的碱基修饰产物。其中，以八羟基脱氧鸟苷（ 8常见，且数量最多，所以 8经作为反映 化损伤的重要指标。另一方面， 攻击 子中的核糖，可能在核糖 点造成 裂。而自由基攻击胸腺嘧啶碱基所致损害，经修复酶的切除也会产生相似的 单链断裂。 复酶也因受自由基攻击而影响其功能，因此，自由基导致的 害严重时可直接造成细胞的死亡。（ 4）自由基可引起蛋白酶释放，降低抗氧化酶活性。还可以使多糖断裂，影响其功能发挥。（ 5）自由基可使转录因子活化后异位到细胞核，并与特殊基因的启动子区结合从而诱导转录，产生大量细胞因子和炎症介质等参与器官损伤 20。 镍化合物进入细胞后被溶解或者酸化，被转化为镍离子（ 。 入机体后产生自由基，包括活性氧自由基（ 活性氮自由基 ( 进一步发生细胞膜的脂质过氧化，使细胞膜的功能受损，最终导致细胞损伤甚或死亡。有 研究表明， 1。 使碱基修饰和 致聚二磷酸腺苷（ 酸转移酶的活化和蛋白 53（ 积累，从而导致细胞凋亡。 近年来国内外学者研究证实，羰基镍可 诱导氧化应激发生 ,产生 22。 有研究表明，巨噬细胞刺激因子和脂多糖（ 在的情况下，镍可以使细胞产生 酸镍是胎儿树突状细胞 23。 质过氧化对机体的作用 脂质过氧化（ 不饱和脂肪酸氧化降解的链反应过程，它可以将活性氧氧化作用放大化，使得少量的活性氧导致很多脂类过氧化产物的生成。它的过程 分三期 24：（ 1）启动期：自由基与不饱和脂肪酸产生脂肪酸自由基。（ 2）生成期：反应中加入氧原子，生成过氧自由基或 些生成物会进一步分解为酮类、醛类和烷烃类物质。（ 3）终止期：在 应中，不饱和脂 肪酸氧化兰州大学硕士研究生学位论文 镍冶炼职工氧化损伤修复标志物的作用研究 6 分解最终释放出反映性醛类如丙二醛（ 体内脂质过氧化反应的主要代谢产物，并且存在于生命活动物质 代谢和能量代谢的整个过程 25，是 基的双功能团化合物。当个体处于剧烈运动、过度脑力和体力劳动、炎症和疾病等各种应激（或者紧张）状态时，都会产生过量的 起细胞损伤的机制：（ 1）对生物膜的损伤 26： 产物和自由基一样都能够破坏生物膜的完整性，使生物膜功能发生改变， 导致细胞破坏， 从而引起一系列病理过程的发生，导致机体出现相应的病理改变 27。（ 2）对蛋白质的损伤 28： 引起蛋白质分子内和分子间的交联致蛋白质损伤。（ 3）对核酸的损伤 29： 子损伤，其基本反应过程与蛋白质一样，是在分子内和分子间发生非酶促碳 可与 起损伤。 而 使细胞的生物膜功能受到持续性损伤，最终导致机体功能受损。它既是组织进一步损伤的原因，又是组织损伤的结果。 所以测定 接反映 机体内细胞 受自由基攻击的严重程度 30。机体内 示受伤害机率越大。 镍盐不仅可以引起细胞膜 使终末产物丙二醛 (含量明显升高 31, 32，而且在线粒体、微粒体 使 导致细胞走向程序性死亡 33。氯化镍导致 改变与氯化镍存在剂量反应关系。硫酸镍可以 引起大鼠明显的 2。 闫铭锋等 34的研究也显示，羰基镍可诱发大鼠肺、肝等组织 起 在组织间存在差异。羰基镍特有的脂溶性可能更容易引起细胞的通透性而加重机体的细胞发生氧化应激，从而引起氧化损伤。 由基的清除 自由基在人类的体内维持着动态平衡，自由基生成与自由基清除的两套系统相互制约。机体抗氧化系统通过三条途径：消除自由基和活性氧避免引起脂质过氧化；分解过氧化物，阻断过氧化链；除去起催化作用的金属离子。防御体系的各成分之间起到了协同，代偿和依赖作用。自由基的清除系统主要包括酶类抗氧化系统和非酶类抗氧化系统 35。 机体内抗氧化酶系统主要由超氧化物歧化酶 (过氧化氢酶 (谷胱甘肽过氧化物酶 (过氧化物酶 (成。它们能将自由基转化为低毒的或是能被体内其它机制进一步消除的产物； 机体内清除自由基的第兰州大学硕士研究生学位论文 镍冶炼职工氧化损伤修复标志物的作用研究 7 一道防线，它能有效控制体内 量，避免组织与细胞受到过量 损伤36。镍离子抑制体内抗氧化酶的活性 ， 间接削弱细胞的抗氧化能力 ， 而机体抗氧化能力的降低会使体内产生的活性氧中间体不能及时消除，使机体遭到伤害。有研究显示 ， 镍可以引起淡水鱼抗氧化物酶活力降低，并且肾脏的损伤大于脾脏 22。 37研究表明，过量的 入体内可影响含锌、含镁等多种酶的活力及功能 ， 干扰组织器官代谢。 38研究显示，大鼠镍染毒后出现明显的氧化损伤，表现为 显降低。 抗氧化非酶系统包括抗坏血酸 (谷胱甘肽（ 维生素 E(类胡萝卜素等。镍与非酶类抗氧化系统中的物质不是直接激活，而是当镍对机体造成氧化损伤时，非酶类抗氧化系统对氧化损伤进行拮抗。 有较强的抗氧化性和抑制 肿瘤的作用。 细胞膜上存在的主要脂溶性抗氧化剂，能保护细胞膜防止脂质过氧化。研究显示，镍可使肺巨噬细胞膜脂质过氧化程度显著增加，对细胞膜有损伤作用。 有明显的抑制染镍肺巨噬细胞膜脂质过氧化作用，同时发现 通过提高抗氧化酶活性抑制 表达，减少活性氧及一氧化氮的产生，拮抗镍对肺泡巨噬细胞的氧化损伤 39。有研究证明，维生素 E 可以通过增加 量而拮抗金属诱导的毒性 40。 可通过影响41。研究非酶类抗氧化系统可以帮助我们干预和保护易感人群。 由基及 检测方法 诸多研究证明自由基与很多疾病有关， 对自由基的研究也已成为热点，如何有效、快速和灵敏的检测自由基就尤为重要。因机体内存在氧化与抗氧化平衡系统，所以我们可利用机体的各种抗氧化酶或氧化产物的水平来间接表示自由基水平。现有检测自由基的方法主要有化学发光法、高效液相色谱法、电子顺磁共振法及分光光度法等 42。 本试验采用分光光度法试剂盒测定超氧化物歧化酶（ 脂质过氧化产物丙二醛（ 间接测定机体自由基水平， 含量也能间接反映机体氧化损伤程度。通过比色法，根据溶液的光密度（ 化值可计算出相应含量。 兰州大学硕士研究生学位论文 镍冶炼职工氧化损伤修复标志物的作用研究 8 观遗传学组蛋白甲基化修饰研究进展 观遗传学 表观遗传学 (要包括 基化、基因组印迹、染色质重塑和X 染色体失活 43。它发生的不涉及 列改变，而是通过组蛋白修饰，非组蛋白的结合和染色质重塑等去有序地调整基因表达。这些修饰在细胞增殖和个体发育过程中能通过细胞分裂稳定地进行传递。它与人类的生长发育、疾病和衰老密切相关。 到目前为止表观遗传学涉及的组蛋白修饰发现至少 9 个类型：磷酸化、乙酰化、 糖基化、甲基化、泛素化修饰 (生物素化、 脯氨酸同分异构化和去精氨酸化 (44。它们通过影响组蛋白 相互作用从而改变染色质的结构。一种修饰的存在可以协同或拮抗同一组蛋白上另一修饰的存在 ， 但其发挥作用是通过多种修饰共同调节形成一个修饰的级联。繁多的修饰类型及时间和空间上的组合与生物学功能的关系可以编译出很多潜在的调控信息，形成了“组蛋白密码” 45。 组蛋白氨基末端残基的翻译后修饰与染色体的重塑和功能状态紧密相关，对染色体结构和基因转录进行调控 ， 并且在决定细胞生长及致癌作用的过程中发挥着重要的作用 46，是目前表观遗传学研究领域的重要部分。研究表明 47组蛋白磷酸化就在有丝分裂、 伤修复、细胞死亡、 制和重组过程中发挥直接作用 。 组蛋白乙酰化与基因转录的激活与抑制相关，乙酰化激活基因转录，去乙酰化抑制基因转录。而组蛋白甲基化修饰在基因活性调节中扮演关键角色。如组蛋白赖氨酸的甲基化在许多生物学过程中发挥了重要作用， 它们包括异染色质的形成、转录调控等 ， 而且它的紊乱可能导致癌变的发生。 蛋白甲基化与去甲基化的产生 蛋白甲基化的产生 组蛋白甲基化是在组蛋白 N 端赖氨酸或精氨酸残基上，由组蛋白甲基转移酶 ( 化发生的。 如 及 催化 生甲基化的酶。 精氨酸残基甲基化是由精氨酸甲基转移酶 (催化下发生单甲基化或者双甲基化的过程。组蛋白赖氨酸残基上可发生甲基化的共有 6 个位点，这些赖氨酸的氨基侧链在不同特性的组蛋白赖氨酸甲基转移酶 (的催化兰州大学硕士研究生学位论文 镍冶炼职工氧化损伤修复标志物的作用研究 9 下可发生单 (双 (三甲基化 (48, 49。在 化的过程中同一 以催化组蛋白赖氨酸不同位点使其产生甲基化； 不同 催化同一位点 ， 使其产生不同程度的甲基化；在催化一种形式的赖氨酸甲基化时，多数 有产物和底物特异性。 由于甲基化位点的不同，组蛋白赖氨酸甲基化可以对转录起激活或抑制的作用 ,但是对某些生物学过程如 X 染色体失活 ， 甲基化作用于相同位点 ， 但也会因甲基化数目不同而致不同结果。如首个被发现的组蛋白甲基转移酶 ( 白，这个家族包括人 变酵母 ( 能特异性地使组蛋 白 基化 50。 蛋白去甲基化的产生 组蛋白的甲基化作用开始人们认为是稳定不可逆的，但 51发现去甲基化酶使组蛋白甲基化过程更具有动态性。特异性作用于组蛋白 点的去甲基化酶是赖氨酸特异性去甲基化酶 1(它是单胺氧化酶，能够通过氨基氧化作用达到去除甲基的目的，并且它只作用于 者 对于 酰精氨酸去亚胺酶 4(， 组蛋白精氨酸去甲基化酶，它能去除精氨酸的单甲基化，而对双甲基化无效 52。它的去甲基化过程是使精氨酸转变成瓜氨酸，精氨酸甲基转移酶失去作用位点而实现的。 蛋白甲基化的作用 在表观遗传调控中起关键作用的是组蛋白赖氨酸甲基化。组 蛋白 赖氨酸第 4 位点（ 第 9 位点（ 第 27 位点（ 第 36 位点（ 第 79 位点（ 组蛋白 赖氨酸第 20 位点（ 可被甲基化。组蛋白间的化学修饰存在顺式或反式作用，它们互相协同或者拮抗从而产生不同的基因调控效果 53。组蛋白 甲基化与基因失活相关 ； 组蛋白 甲基化与基因激活相关 ; 组蛋白 甲基化与 X 染色体失活、同源盒基因沉默、基因印记等基因沉默现象有关 ； 组蛋白 基化与遏制基因失活和 复有关。与此同时 , 组蛋白的去甲基化与甲基化的竞争作用也受到更为广泛的关注。 3基化 基化与基因激活相关。它不同程度的甲基化和在不同生物体内的分布情况共同表明 ， 富集于活性转录基因。这两种程度的兰州大学硕士研究生学位论文 镍冶炼职工氧化损伤修复标志物的作用研究 10 甲基化并不会完全一致的出现在同一地方 ， 布在活性转录基因主要部分 ， 而 限分布在这些基因的 5端 54。组蛋白甲基转移酶都含有 构域，而方式与 特异磷酸化形式的 聚酶有关 55。 3基化 组蛋白 类参与 , 3具有组蛋白甲基转移酶活性 56； 39a， 参与体内 57。 基化使得基因沉默的关键可能就是 在一些细胞系中 ， 基因（ 构体聚集在大量活性基因的编码区。 基化会因发生区域的不同如在编码区还是启动子而起到不同的功能 58。 基化是通过抑制 合酶 结合到染色质上以及与其他表观遗传学修饰酶产生协同作用来发挥生物学功能。 蛋白甲基化与染色质 镍化合物在 1990年就已经被国际癌症研究机构 (为确定的人类致癌物 59。目前有关镍化合物致癌机制的研究认为 ， 镍化合物致癌的关键是 细胞染色质的作用 60， 染色质结合后 ， 可直接或间接引起染色体畸变损伤 ， 从而导致细胞染色体丢失或断裂。 染色质是染色体在细胞周期的间期 网状或斑块状不定形物质。它的基本化学成分为脱氧核糖核酸 核蛋白 ，是由 组蛋白 、非组蛋白、染色质（ 1色深。以浓集状态存在；常染色质（ 色较浅且均匀，以分散状态存在。 性染色质 与性染色体有关，称 染色质 。在 度致密的染色质结构极大地妨碍了 核生物细胞中通过组蛋白的共价修饰和 们改变染色质的结构，对 复进程起关键的调控作用。研究表明，组蛋白的磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化等修饰在 修复过程中起到重要的调节兰州大学硕士研究生学位论文 镍冶炼职工氧化损伤修复标志物的作用研究 11 作用 61。如在染色质上的任何一个部位 甲基化都可 以发生，但在 生损伤时，甲基化只在损伤位点周围出现，其他位点不发生 62。在整个基因组都会发生这种 中也包括异染色质区域 63，它的进行可以维持整个基因组的稳定性。人类肿瘤的形成机制目前还不清楚，但是表观遗传学信息的改变是其重要因素之一。 染色质蛋白 1 与组蛋白甲基化 异染色质蛋白 1 (， 人类细胞中的主要生物学功能是维持染色体结构的完整 ， 参与异染色质形成并调控基因转录。 种 亚型。在异染色质区分布的主要是 而在常染色质和异染色质区都有分布的是 3 从而使 64。基化修饰可能是 当甲基化酶 会使得 因启动子区 水平降低 ， 结合在该区的 量也随之减少。从而使 这些区域的招募降低 ， 基化水平也会随之下调 ， 因得以表达 65。 基化修饰通常与基因转录抑制及异染色质形成有关。蛋白)， )可以与甲基化的 50发现， 3甲基化使其不受去甲基化酶攻击，而 甲基化也是 异性结合位点。该位点即可发生甲基化，也可发生乙酰化，它的竞争性修饰在维持转录抑制时可以在常染色质与异染色质之间形成精密调控的生物学过程。异的结合 后 ， 募集 使附近区域的组蛋白 点甲基化。这些位点甲基化修饰后又可招募 使得经甲基化修饰的 虫体内 缺失会使其对 电离辐射的敏感度增加，所以 能在 伤识别及修复过程中也起着重要作用 66。 染色质域解旋酶 合蛋白 1（ 组蛋白甲基化 个刺激核小体的 个串联的兰州大学硕士研究生学位论文 镍冶炼职工氧化损伤修复标志物的作用研究 12 具有染色质修饰功能的区 (被认为能够介导甲基化地赖氨酸与 究发现， 且它还是一个染色体装配因子，与转录的延伸和终止有关 67, 68。人的 可以与3在数量上相等结合。当 蛋白甲基化与相关指标的检测方法 组蛋白可以在很多位点发生修饰，并且这些修饰与基因调控和疾病的发生存在紧密的联系。目前利用抗体以及质谱的手段可以检测组蛋白氨基酸残基发生的修饰 61。现有检测组蛋白甲基化修饰的方法主要有染色质免疫共沉淀技术（ 术，也称结合位点分析法，是研究体内蛋白质与 互作用的有力工具。通过与 微陈列芯片（ 测序（ 技术的结合，可实现活细胞内特定蛋白与特异性基因序列结合的研究。随着测定技术的不断创新和完善，目前酶联免疫吸附（ 定组蛋白甲基化的方法也日趋完善和稳定 69。 本试验采用 剂盒测定组蛋白 过比色法，根据溶液的光密度（ 化值可计算出相应含量。 究目的与意义 镍 化合物是重要的工业有色冶金产品，随着工业化进程加快和社会进步，镍的应用范围日益广泛。但镍生产过程中的一些镍化合物具有一定毒性，从事冶炼、焊接以及煅烧操作的人群可发生过敏性反应、肺 癌、 鼻咽癌、 口腔癌等病变 2, 3。国外有关报道 提示镍及其化合物可以诱导氧化应激发生 ， 产生超氧阴离子自由基和脂质过氧化， 可扰乱机体内多种抗氧化酶活力变化 ， 导致对机体造成氧化性损伤 ，甚至引起细胞突变、肿瘤发生。 然而镍及其化合物致癌的细胞与分子机制 ，目前并不十分清楚。 为了进一步了解镍及其化合物氧化应激损伤生物标志物，以及探索 机体作用导致肿瘤的原因， 探讨 镍职业接触人群损伤的细胞与分子机制是本实验关注与研究的 重点。 本课题拟通过建立镍职业人群队列及健康预警模型，找出检测镍暴露人群灵敏的生物标志物及其与某些生化指标之间的关联 ， 综合评价镍化合物暴露职业接触人群不同工龄段的时间效应关系，为镍冶炼职工早期健康损伤生物标志物的筛兰州大学硕士研究生学位论文 镍冶炼职工氧化损伤修复标志物的作用研究 13 选提供科学依据，并探讨肿瘤发病的分子机制。 兰州大学硕士研究生学位论文 镍冶炼职工氧化损伤修复标志物的作用研究 14 验技术路线 流行病学调查 生化检测指标 职工健康体检 氧化 损伤修复指标检测 暴露时间效应分析 损伤修复的交互作用分析 职业人群人口学、生活行为因素分布特征 生化指标分布、肿瘤标志物分布资料 损伤修复指标分布资料 确定职业暴露早期损伤可能的早期预警生物标志物 提供科学合理的预防保健措施维护职工健康 3职业人群体检职工 肿瘤标志物指标 损伤修复与其他指标关联分析 镍冶炼职工组 机关职工组 整理分析 质量控制 质量控制 兰州大学硕士研究生学位论文 镍冶炼职工氧化损伤修复标志物的作用研究 15 第二章 镍冶炼职工暴露时间对氧化损伤标志物的影响 象与方法 查收集的目标人群 本次研究对 象总体为 2011 年 6 月至 2012 年 1 月，在金川公司职工医院体检中心接受健康体检和流行病学调查表格资料收集的 12,388 名金川公司在职职工，其中男性 8,434 名，女性 3,954 名。 冶炼职工 中 暴 露 的抽样 方法 金川集团股份有限公司镍职业暴露人群二级单位整体分布状况 表 2金川集团股份有限公司二级单位分布状况 二级单位 调查人数 百分比（ %） 冶炼厂 3649 应分公司 347 炼厂 3298 动化工程公司 338 运分公司 1223 运分公司 826 关 950 盐厂 1086 化冶金厂 198 他 473 计 12388 上表所示，从金川集团股份有限公司二级单位的分布来看，由金川集团有限公司专业技术人员根据二级单位不同的生产工艺流程以及产生的镍化合物种类以及车间中职工所接触的镍化合物浓度，选取人数所占比例最多的冶炼厂（ 和精炼厂（ 作为候选厂研究对象，由于冶炼厂在接触暴露的浓度、剂量和人数比例上占优 势，所以选取冶炼厂作为重点厂区来进行抽样研究。 兰州大学硕士研究生学位论文 镍冶炼职工氧化损伤修复标志物的作用研究 16 冶炼职工组和 机关职工 组的抽样情况 我们依据不同职业人群对镍及其化合物的接触机会的不同，根据金川公司的划定，从体检人群抽取 280 人。其中 镍冶炼职工 组为冶炼厂镍冶炼作业工人，男性 ,共 140 人 , 20 ， 平均年龄 ( 岁 ； 机关职工 组为该企业的机关 职工 ，男性，共 140 人 , 平均年龄 , 24 。 两组在性别 、年龄上差异无统计学意义 （ p=。根据不同职业将两组分为干部、 工人、技术人员和内勤服务人员。 镍冶炼职工组 将 140 个人按照工龄段分为七组，样本抽取情况见表 2机关职工组 依据与 镍冶炼职工组 年龄匹配的原则相应分成七组 (对角线每组抽取 20 人 )。 所有调查对象均身体健康 ,近期未使用任何药品 。 表 2镍 冶炼 职工 组 7工龄段抽样分布 工龄段 年龄段 合计 20- 25- 30- 35- 40- 45- 50- 00 4 12 19 28 22 4 109 5- 0 20 0 21 21 30 9 101 10- 0 1 20 50 17 21 6 115 15- 0 0 5 80 57 42 11 195 20- 0 0 1 36 72 26 4 139 25- 0 0 0 1 50 192 28 271 30- 0 0 0 0 1 17 21 39 合计 20 25 38 207 246 350 83 969 验材料 要仪器及耗材（见表 2 剂盒 超氧化物歧化酶（ 测定试剂盒， 96T，生产批号： 20120720；丙二醛（ 定试剂盒，生产批号： 20120720；均由南 京建成生物工程研究所生产。 品的制备 采集每个研究对象晨起空腹静脉血 5轻轻摇匀，置低温超速离心机，2000r/心 10心半径 1量移液器吸取上层的血清。取得的样本放置于 冰箱保存备用。 兰州大学硕士研究生学位论文 镍冶炼职工氧化损伤修复标志物的作用研究 17 表 2实验所用仪器与耗材 仪器与耗材 制造商 型号 生物安全柜 上海瑞仰净化装备有限公司 学显微镜 本 冰箱 青岛海尔股份有限公司 动酶标分析仪 国 电热恒温水浴锅 北京市长风仪器仪表公司 热恒温鼓风干燥箱 海一恒科技有限公司 温超速离心机 司 (德国） 5415R 漩涡混合器 北京东方生物科学器材公司 式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂 量移液器 上海雷勃分析仪器公司 550l、 20200l、 1 氧化损伤指标的测定 用紫外可见分光光度法测定各指标的 ，单个指标的测定方法为： 定采用 ； 量的测定采用硫代巴比妥酸法。 清中 力的测定原理及公式 （ 1）计算公式：在本反应体系中 制率达 50%时所对应的酶量为一个力单位（ U）。 制率（ %） =(A 对照 照空白 )-(A 测定 定空白 ) (A 对照 照空白 ) 100 血清 U/= 制率 50%反应体系稀释倍数样本测试前稀释倍数。 （ 2）简要步骤：取出 20l 血清样本，按照样本与生理盐水 1:2、 1:4、 1:5和 1:6 进行稀释，取稀释后样本 20l 进行测试。加样流程见下表。 表 2加入物（ l ） 测定孔 对照孔 对照空白孔 测定空白孔 样本溶液 20 / / 20 双蒸水 / 20 20 / 酶工作液 20 20 / / 酶稀释液 / / 20 20 底物应用液 200 200 200 200 混匀， 37 孵育 20450酶标仪测定，蒸馏水调零，测定各管 （ 3）原理： 兰州大学硕士研究生学位论文 镍冶炼职工氧化损伤修复标志物的作用研究 18 图 2定 清中 量的测定原理及公式 （ 1） 原理：过氧化脂质产物 与硫代巴比妥酸（ 合，形成红棕色的三甲川，在 532在最大吸收波长。 （ 2）简要步骤：加样流程见下表。 表 2比色法测定血清中 试剂（ l ） 标准管 标准空白管 测定管 测定空白管 10准品 25 / / / 无水乙醇 / 25 / / 血清样本 / / 25 25 试剂一 25 25 25 25 混匀 试剂二 750 750 750 750 试剂三 250 250 250 250 50%冰醋酸 / / / 250 漩涡混匀， 95 水浴 40出流水冷却，然后 4000r/心 10上清， 5321径，蒸馏水调零，比色测定各管 。 （ 3）计算公式：血清 量（ nm/=（测定管 定空白管 （标准管 准空白管 标准品浓度稀释倍数 O 2+ 州大学硕士研究生学位论文 镍冶炼职工氧化损伤修复标志物的作用研究 19 据整理与统计学分析 计量资料用均数标准差（ x s）表示，采用 行统计分析， 镍冶炼职工组与机关职工组 的数据比较采用析因（平衡数据）设计的双因素方差分析，同一组别不同工龄段的数据比较采用单因素方差分析进行显著性检验，同时进一步采用 进行两两比较，使用 003 及 公软件制作图表，以 量。 不同工龄段 *不同接触组两个因素间不存在交互作用（ p无统计学意义，而两个因素对 量改变可能存在独立的影响。 方（ b= b a*b， 可以认为各处理因素对总变异的和贡献是因素 a因素 b因素 a*b。 由以上分析可知不同工龄段之间存在统