球菌和肠道杆菌病原学检测

实验四 （一）球菌病原学的检测,实验内容,1 球菌形态观察,2 血浆凝固酶试验,3 抗“O”试验,实验目的,1 掌握葡萄球菌，链球菌，淋球菌形态特征,2 熟悉血浆凝固酶实验的原理，方法及临床意义。,3 掌握抗“O”实验的原理，意义及方法。,4 触酶试验试验,球菌的检验程序,标本,直接检查（涂片、染色、镜检）,分离培养,可疑菌落,菌落特点,鉴定试验,第一次,第二次,生化结果观察荚膜染色结果讨论与分析,第三次,形态、色素、溶血,血浆凝固酶、触酶、菊糖发酵、甘露醇发酵、胆汁溶菌、小白鼠毒力试验,常见致病性球菌染色特点,葡萄球菌,链球菌,双球菌,革兰阳性,革兰阳性,革兰阳性,不规则成堆排列,链状排列,矛头状成双排列,脑膜炎奈瑟球菌,淋病奈瑟菌,革兰阴性球菌,奈瑟菌染色特点：肾形或豆形，成双排列、凹面相对的革兰阴性球菌,菌落可出现金黄色、白 色或柠檬色等色素血平板上，金黄色葡萄球菌可形成-溶血环,表皮葡萄球菌呈白色菌落,葡萄球菌在血平板上菌落,链球菌属（Streptococcus）,链球菌在血平板有三种溶血现象 （1）甲型溶血（2）乙型溶血（3）丙型溶血,1,3,2,链球菌菌落形态,血平板：灰白色圆形凸起的细小菌落，不同菌株溶血不一。,化脓性链球菌,草绿色链球菌,肺炎链球菌菌落,1. 血浆凝固酶试验【原理】致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使血浆中纤维蛋白原变为不溶性纤维蛋白，附于细胞表面生成凝块。【操作】取生理盐水各1滴分别滴于载玻片上，用接种环挑取细菌，混合后观察有无自凝现象。取1滴兔血浆混匀分别滴于载玻片上,观察有凝固现象（3-5s）。【结果】金黄色葡萄球菌为阳性，表皮葡萄球菌为阴性【意义】,血浆凝固酶试验可区分致病性和非致病性葡萄球菌,生化反应鉴定,2.触酶试验【原理】 H2O2 H2O + O2【操作】取洁净玻片一张，取生理盐水各1滴分别滴于载玻片上，以接种环分别取待检细菌培养物少许，滴加3 H202一滴（立刻），在H202中磨匀，立即观察结果。【结果】阳性为半分种内产生大量气泡。葡萄球菌为阳性，链球菌为阴性。【意义】 触酶试验可区分葡萄球菌和链球菌。,生化反应鉴定,过氧化氢酶,3. 甘露醇发酵试验【原理】致病性葡萄球菌多含有分解甘露醇的酶类，能发酵甘露醇产酸，培养基由紫色变为黄色。【操作】细菌分别接种甘露醇单糖发酵管，经37孵育18-24h观察结果。【结果】金黄色葡萄球菌为阳性，表皮葡萄球菌为阴性,血浆凝固酶试验和甘露醇发酵试验可区分致病性和非致病性葡萄球菌,生化反应鉴定,4.菊糖发酵试验【原理】大多数肺炎链球菌可以分解菊糖，菊糖发酵产酸，指示剂呈酸性反应，发酵管由黄色变为紫红色。【操作】细菌分别接种菊糖发酵管，经37孵育18-24h观察结果。【结果】用以区分肺炎链球菌和甲型链球菌，肺炎链球菌为阳性，甲型链球菌为阴性。,生化反应鉴定,5.胆汁溶菌试验【原理】肺炎链球菌可产生一种自溶酶，胆盐能活化自溶酶，加速自溶过程，引起细胞自溶。【操作】,胆汁溶菌试验可用以区分甲型链球菌和肺炎链球菌,生化反应鉴定,37，24 h,+ 胆盐（0.1 ml）,37，0.5 h,【结果】液体由混浊变透明为阳性，肺炎链球菌为阳性，甲型链球菌为阴性。【意义】,接种细菌,生化反应鉴定,6.抗链球菌溶血素“O”（ASO）试验（快速胶乳法）【原理】本试剂胶乳液是由溶血素O和羟化聚苯乙烯胶乳共价交联而成的抗原胶乳。ASO胶乳的灵敏度调整到200IU/ml，超过上述滴度即出现肉眼可见凝集颗粒，产生清晰凝集，为阳性；无凝集，为阴性。【操作】试剂预温至室温，并轻轻摇匀。 在反应板各格子上分别滴加1滴(约50l)阴性、阳性和待测血清，再各滴加ASO胶乳试剂1滴，轻轻摇匀，2min后观察结果。【结果】有清晰凝聚者为阳性（ASO200 IU/ml） 不出现凝聚者为阴性（ASO200 IU/ml）【意义】1.抗体滴度 200IU/ml以上，新近有可能反复感染过乙型溶血型链球菌 2.作为风湿活动期、风湿性关节炎、风心病、急性肾小球肾炎、的辅助诊断。,【注意事项】无菌操作挑取细菌培养平板上的单个菌落进行生化鉴定。,生化反应鉴定,致病性球菌的主要生物学性状,鉴别要点,革兰染色,触酶,金黄色葡萄球菌,表面葡萄球菌,乙型链球菌,甲型链球菌,肺炎链球菌,血浆凝固酶,胆汁溶菌试验,G+，球型葡萄状排列,G+ ，球型葡萄状排列,G+ ,球型长链状排列,G+ ,球型短链状排列,G+ ,球形成双,矛头相对,溶血环,无溶血环, 溶血环,溶血环,溶血环,颜色,金黄,灰白色,草绿,+,溶血,菌落特征,生化反应,白色,+,+,+,草绿,甘露醇发酵试验,菊糖发酵试验,+,+,常见肠道杆菌在伊红美兰琼脂平板（EMB）及SS培养基上的菌落特点,1. 大肠杆菌菌落：较大、圆形、光滑、不透明，在EMB上形成深紫兰色菌落（因分解乳糖产酸，与伊红美兰结合之故），在SS琼脂平板上形成红色菌落(因分解乳糖产酸，中性红指示剂变红)。2. 伤寒杆菌和痢疾杆菌菌落：中等大、圆形、光滑、半透明、在EMB上无色（因不分解乳糖），在SS上无色或淡黄色。,实验四 （二）肠道杆菌的病原学的检测,乳糖发酵试验原理：肠道杆菌能分解乳糖产酸，指示剂溴甲酚紫(pH52为黄色，pH68为紫色)，当发酵产酸时，使培养基由紫色变为黄色结果：致病菌多为阴性， 非致病菌多为阳性。用途：鉴别致病性与非致病性肠道杆菌,实验四 （二）肠道杆