猪群常见疾病实验室诊断技术

欢迎参加国家生猪现代产业技术体系 “猪群常见疾病实验室诊断技术培训班”的全体学员,国家生猪现代产业技术体系,猪群常见疾病实验室诊断技术培训班,疾病控制功能室岗位专家张桂红 教授华南农业大学兽医学院主办,张桂红 博士、教授、博士生导师华南农业大学兽医学院手机公电话mail：,联系方式,注意事项,上课时间：2009年11月13日全天报到，14日22日实验技能培训。 上午8：30上课，下午2：30上课 实验培训地点：华南农业大学兽医学院传染病实验室（即23号楼一楼） 安全问题： 吃饭：各饭堂、宾馆、东园等,猪病越来越多、越来越复杂诊断病理剖检变化、流行病学资料、实验室诊断、生产记录等判定疑似疾病,细菌的染色形态学观察培养基的制备细菌分离培养移植细菌的生化试验药物敏感试验,病猪的现场剖检,病猪病料的采集、保存,总RNA的提取反转录聚合酶链式反应（PCR）,猪瘟病毒抗体 猪伪狂犬病病毒gPI抗体(野毒) 猪流感血凝抑制试验 猪细小病毒病乳胶凝集试验（LAT） 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体,DNA提取PCR,血清学检测,分子诊断,细菌分离,结果分析,日程安排,聘请原广州力智农业公司现为德国勃林格公司高级区域技术部方树河 总经理,第一部分 猪的现场剖检,采样注意事项,个人防护典型病变：具有代表性、针对性尽量无菌适时采样合理采样适量采样,猪的常规检查,检查外观部位：眼、口、鼻、皮肤、肛门检查器官：淋巴结、心脏、肺、肝、脾、胃、小肠、大肠、肾、膀胱、浆膜及浆膜腔、睾丸、肌肉、脑等,繁殖记录采食和饮水温度,各器官病理变化及可能发生的疾病,照集体照片,第二部分 病料的采集、运输与保存,血清：2-5mL，不能溶血各组织脏器：新鲜、尽量无菌疑似病毒性疾病，-20以下保存疑似细菌性疾病，尽快分离，-4保存,采样的时机是否适宜样品是否具有代表性样品处理、保存、运送是否合适及时 与检验结果的准确性、可靠性关系极大。,一、标本的采集、运送和保管的一般要求,采集检验样品时，需要符合以下规定： 1适时采样根据检疫要求及检验项目的不同，选择适当的采样时机十分重要。样品是有时间要求的，应严格按规定时间采样；有临诊症状需要作病原分离的，样品必须在病初的发热时或症状典型时采样，病死的动物，应立即采样。,2合理采样按照检疫规定要求，须严格按照规定采集各种足够数量的样品外，不同疫病的需检样品各异，应按可能的疫病侧重采样。对未能确定为何种疫病的，应全面采样。3典型采样选取未经药物治疗、症状最典型或病变最明显的样品，如有并发症，还应兼顾采样。,4. 无菌取样采集检验样品除供病理组织学检验外，供病原学及血清学等检验的样品，必须无菌操作采样，采样用具、容器均须灭菌处理，尸体剖检需采集样品的，先采样后检查，以免人为污染样品。5. 适量采样采集样品,2-5mL一次性注射器采血，将采完血样的注射器活塞，微微拔出一些，使针筒内留有部分空气，然后盖好针头盖子，将注射器针头向上成30度角，斜放，等待血液完全凝固（大概10分钟到30分钟），此过程中不能移动注射器，防止溶血。使用试管和青霉素瓶时也是一样。,（1）血样采集、保存和运送,（2）鼻、咽拭子的采集：用无菌棉拭子在咽部涂抹数次后，放入含0.5-2ml 生理盐水、Hank液的试管中，棉拭子接触手的部分应及时折断或剪断去掉，然后盖紧试管。,对黏液脓血便应挑取黏液或脓血部分；液状粪便采集水样便或含絮状物的液状粪便25ml；成形粪便至少取蚕豆大小粪便1块（约5g）放于灭菌容器内，最好加有保存液或增菌液；若无法获得粪便时，可用保存液或增菌液湿润过的棉拭子插入肛门45cm深处轻轻转动一圈，取直肠表面的黏液后取出，盛入运送培养基或保存液中送检,（3）粪便标本：,用于各种病毒性疾病病原检测病料的采集和保存以下提到病料样品，如不是直接进行实验，都需要冷冻保存（-20）以下！,（4）病毒性疾病病原检测病料,保证整个过程中，病料始终处于低温状态，十分重要。一个简单的方法是，用废弃的矿泉水瓶，灌水后，放置在冰箱中，制备冰块，在病料运输时，将足量的冰块和病料一起放置在保温箱中（用冰块包裹所有病料，如果冰块不够多，最好将冰块放置在病料的上面和下面。密封后，由专人快速运送到检测单位。,分离病毒的组织病料：可放于50甘油缓冲液中（pH8.0），在5条件下保存数周，也可用由0.5水解蛋白，2小牛血清，青、链霉素各500Uml，制霉菌素50Uml组成的溶液保存。510蛋黄生理盐水。,（5）细菌性疾病病料的采集、运送,在选择细菌性疾病病原检测病料时，要选择有代表性的病例。未经抗生素治疗的病猪（最近1周未经抗生素治疗）。有条件的最好选用活体送检。,如果是用于细菌分离的病料，必须新鲜运送，并保证整个过程中，病料始终处于低温状态（但绝对不能结冰），即4 采样尽量无菌操作，保证无人为的污染,水样：水样来源主要是下水、自来水、猪槽等。采样器具有用于手工采样的采样瓶和自动采样器。手工采样是将水样瓶用铁架固定，塞住瓶口，待瓶沉入到一定深度时拉开瓶塞，让水样进入。,水样？,用于调查中毒的样品：包括中毒猪的呕吐物、排泄物等。胃内容物：是确定中毒的最好样本之一。所采集的样本可用玻璃、聚乙烯或聚四氟乙烯器皿盛装，避免使用金属器皿。采集量最好达到1OOg（ml）以上。,调查中毒的样品：,二、疑似病原后的具体的采样部位,猪 瘟（CSFV）,病毒分离荧光抗体试验（FAT）ELISART-PCR中和试验白细胞减少,扁桃体 淋巴结 肺脏 精液 血清（病毒血症时间短） 抗体及抗原,扁桃体淋巴结血清精液肺脏,蓝 耳（PRRSV）,伪狂犬,脑扁桃体肝、脾口、咽腔拭子（活体）,圆环病毒,诊断PCVDPCR原位PCR(ISH)免疫组织化学(IHC),诊断PMWS和PDNS，最好定量检测，因为：PMWS感染猪与PCV2亚临床感染猪区别在于PCV2的感染量,血清学诊断存在一定的问题！,肺脏淋巴结(各部位)脾,圆环病毒,猪细小（PPV）,胎儿（小于16cm）或胎儿肺脏妊娠大于70天木乃伊胎、死胎不能用于诊断检测病毒血凝素（在没有抗体时）病毒分离不适合检测新生仔猪抗体,JEV,胎儿、死胎、新生仔猪、青年猪病毒分离胎儿或新生仔猪取脑、肝、脾、肺和胎盘,PEDV和TGEV,小肠、小肠上皮（哺乳仔猪小肠切片的直接免疫荧光、免疫组化）粪便RT- PCRELISA,口蹄疫,水疱液水疱皮,猪流感,口、咽拭子肺脏气管分泌物,猪脑心肌炎,心脏扁桃体,细菌性疾病,普通琼脂 血液琼脂 LB固体培养基 TSA TSB,重点是选择合适的培养基,猪副嗜血杆菌,肺浆膜表面物质渗出性脑脊髓液心脏血液心包积液关节液,需要NAD和V因子,（1）TSA固体培养基： 准确称取胰蛋白大豆琼脂（Tryptone Soya Agar，TSA）40克，加入940ml蒸馏水，充分摇匀后加热至充分溶解，120高压蒸汽灭菌15min，加入50mL过滤除菌的牛血清、10mL过滤除菌的0.001%NAD，充分摇匀后倒平皿。（2）TSB液体培养基： 准确称取胰蛋白大豆肉汤（Tryptone Soya Borth，TSB）30克溶于940mL蒸馏水，充分摇匀后120高压蒸汽灭菌15 min，加入50mL过滤除菌的牛血清、10mL过滤除菌的0.001%NAD即成。,胸膜肺炎放线杆菌,G损伤的肺组织革兰氏染色绵阳血琼脂分离巧克力血琼脂,特殊的生化特性： CAMP检测 尿素酶,链 球 菌,肺、关节液、脑等血液琼脂,大肠杆菌,肠道内容物粪便,萎缩性鼻炎,肺鼻分泌物血液琼脂1葡萄糖麦康凯琼脂,肺炎支原体,非常难分离生长时间4周核酸检测抗体检测,三、实验室设计,原则：要求工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘、实验室尽量分区。,（1）核酸检测区：核酸抽提、PCR扩增区域、电泳区。超净工作台、水浴锅、普通冰箱、离心机、PCR仪、电泳仪、电泳槽、微波炉、定时钟等等。最好分为3个房间。,（2）血清学检测区，如ELISA、乳胶凝集、HI等 酶标仪（ELISA）等,（3）细菌分离培养区 超净工作台、普通温箱、冰箱、摇床、普通天平、显微镜等等。,（4）洗刷消毒区 烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器等。,器械：,主要用于解剖动物、取材、切割组织等。常用器械有：解剖刀、解剖剪（直头和弯头）、镊子、持针器、止血钳子等，用毕擦净、凉干，以防生锈，消毒以煮沸、高压或用70酒精浸泡为上。,1. 各种储液玻璃瓶、吸管等2. 培养皿： 30mm、60mm、120mm3. 塑料制品：Tip 头、离心管等4.其它：三角烧瓶、烧杯、量筒、漏斗、注射器等,器皿,物理灭菌法（紫外线、湿热、干烤等） 化学灭菌法（各种化学消毒剂）,消毒方法分为二类：,（1）紫外线消毒：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒和培养器皿。紫外线灯应距地面不超过2.5 米。（2）温热消毒： 高压蒸气消毒：121，15 磅，20 30分钟； 干热灭菌消毒：170， 2小时。,（3）化学消毒法：最常见的是70%酒精及1的新洁而灭，前者主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理。后者则主要用器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。化学消毒法操