禽病病原之实验室检测方法20140425

禽病病原之实验室检测方法,沈元诊断研究服务中,成立于2011年，是集动物疫病诊断、研究和服务为一体的技术服务窗口。 通过检测服务，对畜禽健康水平和疫病状态进行全面科学系统的分析评估，指导养殖客户做好科学防疫和用药工作，建立推广“免疫+用药+监测+净化+生物安全管理”的全新方案式兽医服务模式。,与宾夕法尼亚州立兽医诊断中心联合成立“中美动物诊断服务中心”，与“中国科学院海洋研究所、中国农业科学院兰州兽医研究所、中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所、国家生化工程技术研究中心（上海）和国家兽用生物制品工程技术研究中心等5家单位签约形成战略合作。实现了技术服务升级；积极探索、实施与规模化养殖企业建立“战略合作”，实现“产业链共赢”。,瑞普技术服务体系,四大服务中心1名研究员4名博士15名硕士20名养殖专家100多名技术员,疾病诊断研究中心,5个业务室,1个综合管理室,禽病毒检测室：猪病毒检测室：血清学检测室：细菌学检测室：诊断试剂开发室：,样品接收与登记检测任务下达检测报告的复核与递送客户沟通与结果分析菌毒种归档与保藏实验室和物料平衡管理,动物疾病诊断研究服务中心,疾病诊断研究中心,四大特点,专业：人员、场所、试剂全面：禽16项；猪13项，细菌12项规范：有标准可依研究：集团化客户的专题合作研究,先进的仪器设备,先进的仪器设备,先进的仪器设备,先进的仪器设备,先进的仪器设备,先进的仪器设备,先进的设备,标准的操作程序,定性检测抓住源头,合理定点系统监测,专人服务专家咨询,固定数量全面监测,固定周期持续监测,五定监测机制,六大监测技术,实验室诊断：确诊疾病，制定防控方案,流行病学调查：掌握不同地区、不同季节疾病流行动态，事先预防,病源基因进化分析研究：掌握病源分子生物学变化情况，筛选疫苗毒株,细菌的耐药性分析：筛选特效药物，优化用药方案,环境监控：改善饲养环境、评价生物安全体系,血清监测：评价免疫状态、评价疫苗效果、确定免疫程序、诊断、控制净化,病源研究：研究病源抗原性变化，制备“适应性”疫苗,七项服务内容,4月9日晚间消息，国内民营预防医疗服务提供机构爱康国宾正式在纳斯达克挂牌上市。成为国内首家健康体检赴美IPO上市企业。,健康养殖的现状,食品安全；养殖及生物安全；疫病的多样化、复杂化、混合感染等；药物的严格合理使用及残留；规模放大的瓶颈；,病原的多方面威胁,病毒扩散：禽流感、新城疫己进入全球生态系统，由于防控措施中的某些漏洞，致使病原更广泛的扩散。免疫抑制：传染性囊病、马立克氏病、鸡传染性贫血、J亚型淋巴白血病、网状内皮组织增生症、呼肠孤病毒病等的发生，造成免疫抑制，降低鸡体免疫力，更易被细菌、支原体感染。种代净化：种禽企业对经胚传播疾病净化措施重视不够。必须强化对种鸡的沙门菌、支原体、禽白血病、网状内皮组织增生症病毒、呼肠孤病毒的净化工作，以保证养禽业的健康发展。,禽病病原检测内容,确定禽病病原，对鸡群疫病防控做到有的放矢；监测隐性感染，了解鸡群健康状况；总结疫病流行，为免疫毒株选择提供参考数据；进行疫病净化，为实现种禽健康养殖提供可行性方法分离流行毒株，为制备自制抗原和自家疫苗提供种毒材料基因测序比对，建立养殖集团病毒基因数据库,病原检测流程,样品的采集与运输,正确采样的重要性,以IBV为例,IB根据临床上病变类型主要分为：呼吸道型、肾型。目前流行发病以肾型发生最为普遍。呼吸道出现呼吸困难，有啰音或喘鸣音，雏鸡感染可引起死亡。青年鸡和产蛋鸡感染后可引起产蛋鸡停产或产蛋下降，产软壳蛋、沙壳蛋或畸形蛋，蛋清稀薄如水。病鸡排白色稀粪，脱水，肾脏肿大，花斑肾，死亡率高。符合上述临床症状之一者可以怀疑感染鸡传染性支气管炎病毒，确诊需经实验室检验。,1.临床诊断,采样工具,2.无菌、安全采样,IBV病料采集,急性呼吸道型的病鸡，应采取气管渗出物；对于刚扑杀的病鸡则采取支气管和肺组织。肾型和产蛋下降的病鸡，应采取病鸡的肾脏和输卵管。也可从大肠，尤其是盲肠扁桃体或粪便分离病毒，但从消化道分离到的病毒未必与现流行株或发生的病毒有直接关系。,3.适时采样,4.合理、典型采样,IBV病料采集,样品量：要足量，且有备份量 血清：至少0.5ml 组织：2-3g 棉拭子：旋转2-3次，且停留3-5s,5.适量采样,咽喉、腭裂、泄殖腔棉拭子采集方法如下：取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上颚裂来回刮35次取咽喉分泌液；取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔并沾取少量粪便。将棉拭子浸入分装有生理盐水的离心管，折断超出部分，盖紧，并送实验室检测。,组织样品的保存,采集样品用封口袋包装，做好标记（编号、栋舍、场名），避免产生对检测的信息干扰。病毒检验样品，若24小时内要送到实验室，可冰袋冷藏处理。若超过24小时的应冻结处理。夏天不建议送检全鸡检测。,最终原则就是选择较厚的泡沫盒，同时多放冰块。,病料的包装,病料检测前处理,将病料放在含有10000IU/mL青霉素和10mg/mL链霉素的pH值为7.4的PBS内，置于冰盒内送往实验室。将病料磨碎，加含抗菌素的PBS制成1:5体积比组织悬液，反复冻融，以3000g离心20分钟，取上清液，加入浓度为1000IU/mL的青霉素和终浓度为1mg/mL的链霉素，37作用1小时后用于PCR检测或鸡胚接种,小结,根据鸡群发病日龄、发病时间、采食情况、死淘情况、产蛋情况、鸡舍环境变化、外界气候变化等信息，再依据临床表现、流行病学、大体剖检病理变化等对鸡病做初步诊断，采集相应样品；无法判断，则需要多部位采集；保证采集样本数量；无菌处理、方法科学；记录、保温、密封；,PCR检测技术,PCR技术,PCR ：Polymerase chain reaction，即聚合酶链反应，是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。1983，由美国科学家Kary Mullis首次提出。PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。,PCR原理,PCR反应的基本成分包括5种基本成分：模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTPs）、Mg2+。,2017/12/15,47,以IBV为例,组织样品的处理：肺脏或肾脏等组织样品中加灭菌的0.85%生理盐水研磨成5倍10倍的悬浮液，反复冻融2次3次后，以4000g离心10min，取上清液作核酸抽提用。棉拭子的处理：将棉拭子充分捻动拧干后除去拭子，0.5mL样品液经4000g离心10min，取上清液作核酸抽提用。细胞培养物：取1mL细胞培养物反复冻融2次3次后，以4000g离心10min后取上清液作核酸抽提用。,抽提IBV RNA,取200uL病料研磨液中的上清液或尿囊液置于一灭菌的2mL离心管中，同时设立阴性尿囊液或阴性细胞培养液和传染性支气管炎病毒M41株阳性病毒液作为阳性对照，再分别加入裂解液1mlTrizol，剧烈混合样品15s，室温放置10min。加入200uL三氯甲烷，颠倒离心管混合5次，室温静置10min，4下10000g离心15min。,抽提IBV RNA,吸取约500uL上层液至新的无菌离心管中，加入500uL异丙醇/无水乙醇，颠倒混匀，4放置10min，4下以10000g离心15min。小心弃去全部上清液，加入1mL无RNase水配置的75%乙醇溶液，上下轻缓颠倒2次，4下以7500g离心5min。弃去全部上清（用移液器吸取或者用吸水纸吸干），风干510min，即制得RNA。,提取RNA时需要注意的问题,经常更换新手套和头套，皮肤上常带有的汗水、细菌、唾液以及空气中的灰尘都有大量RNase。使用无菌无RNase的塑料制品避免交叉污染。玻璃器皿可在150烘烤4小时，塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01v/v,放置过夜,高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。）,RT-PCR反应（40ul体系）,程序：30 10 min；42 1 h；72 15 min；冷却至4；-20保存。,设立以IBV M41株的cDNA为模板的阳性IBV 病毒对照和阴性尿囊液或阴性细胞培养物的cDNA为模板的阴性对照。,PCR材料与程序,PCR的反应体系,95预变性5 min；94 40 s；53 40s；72 50共30个循环；72延伸10min，4终止反应。,PCR检测中的常见问题,RNA酶的污染内源的RNA酶：进行组织裂解时加入RNA酶抑制剂外部环境的RNA酶：带一次性手套和口罩，所有试剂和仪器都必须经过消毒处理和RNA酶抑制剂处理EB的问题，替代物Goldview或Gel-red,PCR产物的凝胶电泳和回收,PCR产物经过1%的琼脂糖凝胶电泳，100V，45min将电泳结束的胶板置于紫外拍摄仪中观察PCR结果将目的条带用刀片切下，用凝胶回收试剂盒进行回收回收的目的条带直接送测序公司测序,IBV凝胶成像,PCR检测中的常见问题,结果出现假阳性目标序列太短或者引物序列太短，导致出现假阳性；需要重新设计引物靶序列或扩增产物交叉污染；加样时要小心，阳性对照应最后加或者通过巢氏PCR进行扩增能显著提高扩增的特异性条带出现但是与目标条带大小不一致；引物聚合形成的引物二聚体，退火时Mg2+离子浓度过高或者退火温度偏低,PCR检测中的常见问题,结果出现假阴性PCR产物放置时间过长；PCR产物最好当日上电泳，不要超过48h，超过48h再上样条带可能不规则甚至消失。Mg2+浓度过高或过低；Mg2+浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出现扩增条带。反应体系的突然改变；通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul，在放大体系时，一定要模索条件，否则容易失败。退火温度过低；可缓慢提高退火温度,PCR检测中的常见问题,PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带其原因往往由于凝胶浓度或者没有充分凝固，酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。,IBV结果判定,阳性对照在约740bp和290bp处分别有一条特异性的DNA条带，阴性对照则无相应的特异性条带出现，则实验成立。待检样品在相应的位置如出现特异性条带，或者仅在约740bp出现条带或者仅在月290bp处出现特异性条带，则均可判为阳性。如果需要进一步验证的话，可以将获得的大小约为740bp或290bp的PCR产物回收纯化后测序，将测序结果提交美国国家生物技术中心（NCBI）进行BLAST分析。,IBV测序结果分析,IBV S1基因进化分析表明，分离株SD140120-1与流行毒株A2、LX4等均属于基因型LX4，但不在同一亚分支，而与HB140116B、JS101024等处于同一亚分支，与常规疫苗株H120等不属于同一基因型。,NDV、AIV检测结果的不同分析,其他病原,DNA抽提方法,180l样品+1mlDNAiso，颠倒混匀，静置5min RT，4 10000g离心，10min；取上清移至新离心管中，加500l无水乙醇，反复颠倒直至出现云雾状DNA沉淀，4000g离心 5min；弃上清，加1ml 75%乙醇（切勿触及沉淀），轻缓上下颠倒洗涤，4 12000g离心，5min；然后再次洗涤；弃上清，室温短时干燥；加3060 l TE/ddH2O溶解，-20保存。,瑞普诊断中心PCR检测核酸的优势技术,NDV疫苗毒和流行毒株,M： 1kbMarker1#：NDV基因II型病毒2#：NDV基因VII型病毒N： 阴性对照P： NDV分离毒阳性对照,瑞普诊断中心PCR检测核酸的优势技术,PCR区分IBV的疫苗毒株和流行毒株,M:1kbMarker1#: H120株2#：4/91毒株N：阴性对照P：IBV分离毒阳性对照，4/91血清型,PCR检测核酸的优点及局限性,DNA病毒,RNA病毒,组织病料或者鸡胚尿囊液,RT,PCR,凝胶电泳,图谱观察分析,测序分析,小结,步步防止污染；设置阴阳性对照；,IBV、NDV、AIV-H9流行变化趋势,核酸检测的后续分析,禽原病毒分离,实验室常用的病毒分离方法,接种易感动物 接种SPF鸡胚接种敏感细胞，常用细胞如DF-1、CEF、Marc-145等。,鸡胚接种法检测病原,主要分离毒种：NDV、AIV-H9、AIV-H5、IBV、IBDV、IBHV、ILTV、REOV等。主要接种方式：尿囊腔接种、绒毛尿囊膜接种、卵黄囊接种等。根据不同毒种对鸡胚不同部位的敏感性进行接胚。,病料接种鸡胚的原则,一般嗜神经性病毒主要动物脑内接种；嗜呼吸道病毒接种动物鼻腔及鸡胚尿囊腔；嗜皮肤性病毒接种动物皮内、皮下或鸡胚绒毛尿囊膜；嗜内脏病毒可接种动物的腹腔、静脉、肌肉等。近年来，由于组织培养技术的广泛应用，多数病毒都能够用组织培养进行分离鉴定。,尿囊腔接种,绒毛尿囊膜接种,卵黄囊接种,照胚,病料处理,接种鸡胚,培养照胚,收胚,HA/HI,PCR,出具检测结果,用SPF鸡胚，至少使用白壳非免胚。孵化时一般选择相对湿度为60%，最低温度36，一般37.5。每日翻蛋最少3次，大头朝上，注意鸡胚位置孵化3-4天照蛋时，如果鸡胚正常可见清晰的血管及胎动，血管分支明显；去除死胚、无精胚。,鸡胚的选择,正常鸡胚,无精蛋,死胚,裂纹胚,IBV病料的处理和接种准备,取病料上清液，加抗生素（1000IU/mL青霉素和1mg/mL的链霉素）置37水浴30min或置于4过夜，然后12000rpm离心取上清液，或者用0.22m的无菌滤膜过滤除菌。照蛋用铅笔画出气室和胚胎的位置。用碘酊在接种处的蛋壳上消毒并消碘，并在该处打孔。,IBV鸡胚接种方式,接种于5枚9日龄-11日龄SPF鸡胚尿囊腔内，另取5枚接种PBS液，接种量均为0.2mL/枚。37孵育。每天照蛋，24小时内死亡的鸡胚弃去。收集接种后3d-7d的鸡胚尿囊液，将所有尿液液混合，用含1000IU/mL青霉素和1mg/mL的链霉素的PBS液稀释510倍，继续在鸡胚内传代。典型的野毒株通常在鸡胚中传至第2代或低3代，可见侏儒胚，传至第三代，某些鸡胚可出现死亡。含毒尿囊液置-60以下可长期保存，也可冻干保存4保存。,IBV鸡胚接种方式,将分离物经鸡胚传至3代或3代以上，收获接种后7d（168h）仍存活的鸡胚，取胎儿，用剪刀剪除胎儿体外的附属物，并用吸水纸吸干胎儿表面的液体。如果接种胎儿重量比对照鸡胚胎儿重量少2g以上者，可初步判定为有病毒感染。,IBV接胚结果,鸡胚呈蜷缩状，鸡胚外层包裹一层绒膜，发育不全，侏儒胚。,绒尿膜接种-人工气室法,取10-11日龄鸡胚，先在照蛋灯下检查鸡胚发育状况，划出气室位置，将绒尿膜发育区做一记号。将鸡胚横卧于蛋座上，绒尿膜区朝上。用碘酒消毒绒尿膜区及气室中心部，在气室中心部锥小孔。然后用锥子在记号处锥一约0