H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建

H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建及其RNA干扰的研究,汇报提纲：,文献综述 RNA干扰对A型流感病毒基因表达及病毒复制 的抑制作用的研究 H5N1亚型禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004 全基因组克隆、测序及其感染性克隆的构建,1 文献综述,文献综述,禽流感的发生与流行,文献综述,禽流感（Avian Influenza, AI），是由A型流感病毒引起的一种禽类的烈性传染性疾病或疾病综合征。1878年，首次在意大利发现了禽流感的流行。高致病性禽流感（Highly Pathogenic Avian Influenza, HPAI）是由A型流感病毒中H5、H7亚型流感病毒引起，目前已经呈世界性分布， 全世界50多个国家和地区（OIE数据）报道了高致病性禽流感的发生和流行。我国自1996年首次报道分离到H5N1亚型高致病性禽流感病毒之后，其流行一直呈上升趋势。,世界上高致病性禽流感感染人的发病与死亡情况（截至2006-6-03）,文献综述,禽流感病毒的结构模式图,文献综述,流感病毒为单股负链RNA，由8个片断组成，共编码8种结构蛋白和2种非结构蛋白。其表面有一层由双层脂质构成的囊膜，镶嵌着二种重要的纤突，分别为 HA、NA。,病毒粒子的主要蛋白成分：血凝素（HA）神经氨酸（NA） 核蛋白（NP） 基质蛋白(M1,M2) 聚合酶 （ PB1、PB2、PA） 非结构蛋白（NS1、NS2）,1995年康奈尔大学Guo Su博士试图（1995）用反义RNA 去阻断秀丽新小杆线虫（C. elegans） 中的par1 基因的表达时, 意外发现给对照实验组线虫注射正义RNA，不但不增加该基因的表达，反而产生与反义RNA同样的结果。 1998年2月，华盛顿卡耐基研究院的Fire博士和马萨诸塞大学癌症中心的Mello博士才证实Guo Su博士发现的正义RNA 抑制基因表达的现象是由于体外转录的RNA中污染了少量双链RNA 而引起。,RNA干扰的历史研究和发现过程,文献综述,Fire和Mello实验表明在线虫消化道中注入双链RNA不但可以阻断整个线虫的同源基因表达，还会导致其子一代的同源基因沉默。他们将这一现象首次称为RNA 干扰（RNA interference，RNAi）。 RNA干扰现象随后在昆虫、锥虫、果蝇、涡虫、斑马鱼、真菌、植物拟南芥等生物及哺乳动物细胞株中也分别被发现。,RNA干扰的历史研究和发现过程,文献综述,RNA干扰的基本原理,文献综述,ATP、RNA解旋酶,通过作用于病毒特定基因的siRNA抑制病毒在细胞内的复制，siRNA可作用于细胞中病毒靶受体以干扰病毒的侵染，期望达到治疗病毒性疾病的目标。RNA干扰技术已经在多种病毒研究中得到了成功的应用：人类免疫缺陷病毒型、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、甲型流感病毒、口蹄疫病毒、西尼罗病毒和SARS冠状病毒等。,RNAi在病毒研究中的应用,文献综述,病毒的感染性克隆其实就是模拟病毒复制、转录等病毒生命周期，人工构建病毒的过程。病毒的感染性克隆也称为病毒的反向遗传操作技术（Reverse Genetic Manipulaton）。,病毒的感染性克隆,文献综述,反向遗传学及其操作技术,反向遗传学是直接从生物的遗传物质入手来阐述生物生命发生的本质现象，与之相关的各种技术统称为反向遗传学操作技术。病毒反向遗传操作技术解决了对RNA 病毒基因组难以操作这一困扰研究者多年的难题，开创了病毒研究的新时代。,文献综述,禽流感病毒的复制,以辅助流感病毒为基础的反向遗传操作系统核糖核蛋白转染法RNA聚合酶方法完全以克隆的cDNA为基础的反向遗传操作系统RNA聚合酶系统:17质粒系统RNA聚合酶系统:12质粒系统双向RNA聚合酶/转录系统: 8质粒系统,流感病毒反向遗传操作技术的发展历程,以辅助流感病毒为基础的反向遗传操作系统,核糖核蛋白转染法： 采用T7 RNA聚合酶体外转录系统，NS-CAT-NS，体外转录 RNA聚合酶方法： RNA聚合酶I（pol I）启动子代替T7 RNA聚合酶启动子,完全以克隆的cDNA为基础的反向遗传操作系统,17质粒系统,12质粒系统,2000年，Hoffmann等建立了RNA聚合酶/系统， vRNA和mRNA的合成来自于一个模板，不需要构建专门的蛋白表达质粒，为拯救病毒而构建的质粒数将大大减少。 这一系统采用共培养的293T细胞和MDCK细胞，8质粒转染细胞后， RNA聚合酶转录产生负链vRNA，RNA聚合酶合成正链mRNA 。转染的293T细胞中产生的病毒随后将感染MDCK细胞并大量复制。,RNA聚合酶/转录系统: 8质粒系统,RNA聚合酶/转录系统: 8质粒系统,双向RNA聚合酶/转录系统: 8质粒系统,利用反向遗传学操作技术研究流感病毒的致病性利用反向遗传学操作技术研究流感病毒的生命周期利用反向遗传学操作技术研究流感疫苗,流感病毒反向遗传操作技术的应用,“62”流感疫苗,2 RNA干扰对A型流感病毒基因表达及病毒复制的抑制作用的研究,2.1 研究目的和意义,本研究选用NP和M2基因作为RNA干扰的靶基因，针对NP和M2基因保守区段设计了5对siRNA。研究了siRNA对基因表达的影响及其对H1N1、H5N1和H9N2亚型流感病毒在体内和体外复制的影响，筛选出能有效抑制流感病毒复制的siRNA序列，为探索RNAi技术应用于抗禽流感研究奠定基础。,研究目的和意义,2.2 研究内容,禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004 NP和M2基因的克隆及M2基因跨膜区的缺失(M2 ).NP和M2 基因同eGFP共表达真核质粒的构建及其在HeLa细胞中的表达.NP和M2基因特异性siRNA的设计及其真核表达质粒的构建siRNA对NP和M2基因在HeLa细胞中表达水平影响的研究.siRNA在体外（MDCK细胞上）对流感病毒(H5N1, H9N2, H1N1)复制的影响.siRNA的体内试验和攻毒保护试验,研究内容,2.3 结果与分析,NP基因的PCR扩增及同报告基因（EGFP）融合表达质粒的构建,结果与分析,NP基因的PCR扩增结果,质粒pCDM-NP的酶切鉴定和PCR鉴定,PCR方法缺失M2基因跨膜区,结果与分析,M2基因的克隆、跨膜区的缺失及同报告基因（EGFP）融合表达质粒的构建,结果与分析,M2基因跨膜区缺失的PCR扩增结果,质粒pCDM-M2的酶切鉴定和PCR鉴定,结果与分析,NP基因同EGFP在HeLa细胞中的融合表达,M2基因同EGFP在HeLa细胞中的融合表达,质粒pCDM-NP、pCDM-M2在转染HeLa细胞后12小时就可以检测到特异性荧光，转染后24小时发出荧光的细胞明显增多，荧光主要呈弥散性分布于整个细胞中，说明NP基因与EGFP，M2基因与EGFP均发生了融合表达。,NP、M2基因同报告基因（EGFP）在HeLa细胞中的融合表达,NP和M2 基因特异性siRNA的设计及其真核表达质粒的构建,BamHI+HindIII,结果与分析,NP和M2 基因特异性siRNA真核表达质粒的构建,siRNA表达质粒bamHI + HindIII的双酶切鉴定M: DNA marker (DL-15000)1: pSCMV- M48 2: pSCMV-M7543: pSCMV-M949 4: pSCMV-NP749 5: pSCMV-NP1383,结果与分析,结果与分析,siRNA表达质粒与pCDM-NP共转染,siRNA表达质粒与pCDM-M2共转染,siRNA表达质粒与pCDM-NP或pCDM-M2共转染,siRNA对NP和M2 基因在HeLa细胞中表达水平影响,结果与分析,siRNA表达质粒同pCDM-NP共转染后24h的流式细胞检测,结果与分析,结果与分析,siRNA表达质粒同pCDM-M2共转染后24h的流式细胞检测,半定量RT-PCR检测NP、EGFP mRNA的水平,结果与分析,A: pNP-EGFP + pS-NegativeB: pNP-EGFP + pS-NP749C: pNP-EGFP + pS-NP1383D: Cell Control,结果与分析,A: pM2 -EGFP + pS-Negative B: pM2 -EGFP + pS-M48C: pM2 -EGFP + pS-M754 D: pM2 -EGFP + pS-M949E: Cell Control,半定量RT-PCR检测M2、EGFP mRNA的水平,半定量RT-PCR检测看家基因GAPDH mRNA的水平,结果与分析,A：pCDM-NP pSilencer 4.1-negativeB：pCDM-NP pSCMV-NP749C：pCDM-NP pSCMV-NP1383D：pCDM-M2 pSilencer 4.1-negativeE：pCDM-M2 pSCMV- M48F：pCDM-M2 pSCMV-M754G：pCDM-M2 pSCMV-M949H：Cell Control,Western blot 评价siRNA对目的基因表达的抑制作用,结果与分析,Western blot检测M2基因的表达水平 A：pCDM-M2 pSilencer 4.1-negative C：pCDM-M2 pSCMV-M754B：pCDM-M2 pSCMV-M949 D：pCDM-M2 pSCMV- M48E：Cell Control,Western blot检测NP基因的表达水平A：pCDM-NP pSilencer 4.1-negative C：pCDM-NP pSCMV-NP1383B：pCDM-NP pSCMV-NP749 D：Cell Control,Western blot 检测GAPDH基因的表达,结果与分析,A：pCDM-NP pSilencer 4.1-negative E：pCDM-M2 pSCMV- M48B：pCDM-NP pSCMV-NP749 F：pCDM-M2 pSCMV-M754C：pCDM-NP pSCMV-NP1383 G：pCDM-M2 pSCMV-M949D：pCDM-M2 pSilencer 4.1-negative H：Cell Control,siRNA对A型流感病毒在MDCK细胞中复制的抑制作用,结果与分析,在6孔板上培养MDCK细胞，待细胞长至80%满时分别转染siRNA表达质粒，同时设置pSilencer 4.1-negative对照和空白细胞对照。转染后18-24h分别接种流感病毒H1N1（106 TCID50），H5N1（104 TCID50），H9N2（106 TCID50），接毒后48-72h收获细胞及上清进行病毒TCID50的测定。,siRNA对A型流感病毒在MDCK细胞中复制的抑制作用,结果与分析,siRNA对A型禽流感病毒在小鼠肺中复制的抑制作用,结果与分析,各攻毒组小鼠（4只/组）注射质粒的种类和剂量,siRNA对H5N1亚型禽流感病毒在小鼠肺中复制的抑制作用,结果与分析,siRNA 的瞬时表达特异性抑制H5N1亚型禽流感病毒在小鼠肺脏中的复制,siRNA对H5N1亚型禽流感病毒在小鼠肺中复制的抑制作用,结果与分析,siRNA特异性抑制H5N1流感病毒在体内的复制,siRNA对H1N1和H9N2亚型流感病毒在小鼠肺中复制的抑制作用,结果与分析,siRNA 的瞬时表达特异性抑制H1N1亚型流感病毒在小鼠肺脏中的复制,siRNA 的瞬时表达特异性抑制H9N2亚型禽流感病毒在小鼠肺脏中的复制,siRNA对H1N1和H9N2亚型流感病毒在小鼠肺中复制的抑制作用,结果与分析,siRNA显著性降低H1、H5和H9 亚型流感病毒攻击小鼠的肺病毒滴度,siRNA对A型流感病毒攻击小鼠的保护作用,结果与分析,攻毒保护组小鼠（8只/组）注射质粒的种类和剂量,siRNA对H1N1亚型流感病毒攻击小鼠的保护作用,结果与分析,H1N1亚型流感病毒攻击后小鼠体重的变化*, Groups differ for weight loss, p0.05 (Students test),H1N1亚型流感病毒攻击后小鼠的存活率,siRNA对H5N1亚型禽流感病毒攻击小鼠的保护作用,结果与分析,H5N1亚型流感病毒攻击后小鼠体重的变化*, Groups differ for weight loss, p0.05 (Students test),H5N1亚型流感病毒攻击后小鼠的存活率,2.4 讨论,讨论,RNAi的设计,RNAi具有高度的基因特异性。在发夹式siRNA中，单个碱基的错配都可能会消除它的RNAi效果。因此，构建的siRNA表达质粒必须经过测序鉴定，保证与靶基因的100%同源性。所设计的siRNA序列不应与人或其它动物基因组同源。本研究中，“看家基因”- GAPDH的检测结果显示：所选择的siRNA没有干扰转染细胞本身的基因表达和转录。,讨论,NP和M2基因作为RNA干扰的靶基因的意义,NP和M2基因是A 型流感病毒中最保守的基因，变异很小，因而选择NP和M2基因作为RNA干扰的靶基因，这样找到的能有效抑制流感病毒复制的siRNA序列对所有A型流感病毒都是有效的。本研究的结果也显示了，能有效抑制NP和M2基因转录和表达的siRNA对A型流感病毒中不同亚型的病毒均有抑制作用，说明以NP和M2为靶基因设计的siRNA对A型流感病毒的抑制作用具有广谱性。,讨论,RNA干扰在抗病毒研究中的应用前景,依靠RNAi 技术获得病毒复制的强有效抑制的同时，不得不考虑病毒逃逸的可能性。为避免这个困难，通常采用多个必需靶位点作为联合siRNA 治疗方法，以避免病毒逃逸突变株的演化。本研究中采用siRNA M-48+NP-1383联合使用时的效果明显优于二者单独使用时的效果，这可能也是因为联合使用时针对的是流感病毒的两个基因的靶位点，从而有效地减少了病毒逃逸的可能，增强了治疗效果。,讨论,2.5 结 论,完成了禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004 NP和M2基因的克隆，采用PCR方法缺失了M2基因跨膜区的第2655位氨基酸 （M2 ）。 实现了NP和M2 基因分别同EGFP在HeLa细胞中的融合表达，融合蛋白呈弥散性分布于细胞浆中。以NP和M2 基因为靶序列，设计合成了五个siRNA，并构建了各自的表达质粒。将siRNA表达质粒分别与对应的pCDM-NP和pCDM-M2共转染HeLa细胞后，通过荧光观察、流式细胞、半定量RT-PCR和Western blot等方法检测证实，针对NP基因设计的2个siRNA均对NP基因的转录和表达产生了显著的抑制作用，针对M2基因设计的3个siRNA也均对M2基因的转录和表达产生了显著的抑制作用。,2.5 结 论,设计的siRNA抑制流感病毒（H5N1，H9N2，H1N1）在MDCK细胞上的复制，其中pSCMV- M48和 pSCMV- NP1383对流感病毒复制的抑制作用最强。设计的siRNA导入小鼠体内能有效降低H5N1，H9N2，H1N1流感病毒感染小鼠的肺病毒滴度，pSCMV- M48和 pSCMV- NP1383联合使用时，攻毒小鼠体重减轻幅度较对照组小，且能部分保护小鼠遭受致死性流感病毒的攻击。,3 H5N1亚型禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004全基因组克隆、测序及其感染性克隆的构建,3.1 研究目的和意义,本研究针对2004年春禽流感爆发流行期间在湖北省家禽感染病料中分离出的一株H5N1禽流感病毒，对其全基因组进行克隆、测序及遗传进化分析，根据基因核苷酸序列绘制出了H5N1亚型禽流感病毒基因组系统发育进化树。目的是揭示H5N1禽流感病毒湖北分离株与其它流感病毒流行株间的亲缘关系及遗传演化规律，为高致病性禽流感的预测、监控、防制提供有力的证据。,研究目的和意义,反向遗传操作技术发展到现在，实现了使用完全以质粒为基础的操作系统，因此可以对病毒基因组方便地操作，显示了良好的应用前景。病毒的反向遗传操作技术在深入阐明病毒的生活周期和致病性、基因组的结构与功能、研制基因修饰的疫苗候选株、发展病毒载体等方面可以广泛地应用。,研究目的和意义,3.2 研究内容,H5N1亚型禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004全基因组克隆、测序及遗传进化分析用于流感病毒拯救的八个转染用质粒的构建H5N1亚型禽流感病毒湖北分离株的体外拯救拯救病毒的鉴定,研究内容,3.3 结果与分析,基因组八个片段的PCR扩增结果,H5N1亚型禽流感病毒基因序列及遗传进化分析,H5N1亚型禽流感病毒基因序列及遗传进化分析,H5N1亚型禽流感病毒基因序列及遗传进化分析,全基因组的亚克隆及八质粒转染系统的构建,BsmBI & BsaI,流感病毒的拯救,SPF鸡胚增殖,拯救病毒在SPF鸡胚中增殖不同代次的血凝价,结果与分析,1,5：The NO.1 generation virus titers2,6：The NO.2 generation virus titers3,7：The NO.3 generation virus titers4,8：Negative control,获救病毒和野毒对MDCK细胞病变的比较,结果与分析,原始野毒在MDCK细胞上形成的病变,拯救病毒在MDCK细胞上形成的病变,正常的MDCK细胞对照,RT-PCR扩增鉴定拯救病毒,结果与分析,1 DNA marker (DL15000)2 RT-PCR product of PB2 gene3 RT-PCR product of PB1 gene4 RT-PCR product of PA gene5 RT-PCR product of HA gene6 RT-PCR product of NP gene7 RT-PCR product of NA gene8 RT-PCR product of M gene9 RT-PCR product of NS gene,拯救病毒的电镜观察结果,结果与分析,A：放大倍数为10万倍 B：放大倍数为20万倍 C：放大倍数为80万倍Note：病毒呈圆形或椭圆形，直径在100nm左右，病毒有囊膜，且病毒表面呈现出明显的冠状结构,具有典型的流感病毒的形态特征，电镜观察结果证实了流感病毒的拯救。,3.4 讨 论,讨论,八质粒拯救系统,八质粒系统大大减少了转染质粒数目，实现了在同一个载体上既控制vRNA的转录，也控制mRNA的合成。操作更加方便，效率更高。Hoffmann等（2000）在对人源流感病毒WSN进行拯救时，每毫升转染上清能产生8107个的感染性病毒粒子，这样的效率在所有负链RNA病毒的拯救中都是最高的。 由于质粒pHW2000的启动子是人源化，因而其用于禽源流感病毒的拯救效率就大大降低。因而，本试验完成的H5N1禽流感病毒的拯救就显得尤为不易。,讨论,基因序列的准确性,获得准确可靠的cDNA序列是流感病毒拯救的前提。本研究使用高保真DNA聚合酶进行基因扩增，而每个阳性克隆送3-5个进行测序，并将测序结果同GenBank中收录的序列进行比较，从而确定一个序列比较可靠的阳性克隆。这些操