EB病毒检测技术进展及临床应用

EB病毒检测技术及临床应用,概述,Epstein-Barr病毒（EBV）疱疹病毒科，亚科，嗜淋巴细胞病毒属，1964年由Epstein、Barr等人首次在非洲儿童的恶性淋巴瘤组织培养中发现。EBV是是传染性单核细胞增多症的病原体，也是一种重要的肿瘤相关病毒，与鼻咽癌、淋巴瘤、胃癌、移植后淋巴增殖症等多种肿瘤的发生密切相关，被列为致癌性病毒之一。,概述,传播途径：EBV感染主要通过唾液接触传播，也可通过血液传播；人感染EBV后建立终身潜伏感染，人群感染率超过90%。1-6岁儿童、14-20岁青少年及年轻成年人高度易感，发展中国家EBV感染多发生在儿童早期。,病原学,疱疹病毒科，疱疹病毒亚科，淋巴隐病毒属，人疱疹病毒4型球形双链DNA病毒，基因组平均大小约为172 kb,EBV致病机制,原发EBV感染时，EBV先是在口咽部上皮细胞内增殖，然后感染附近的B淋巴细胞，受到感染的B淋巴细胞进入血液循环可以造成全身性感染。EBV原发感染后，大多数无临床症状，尤其是6岁以下幼儿大多表现为隐性或轻型发病，但在儿童期、青春期和青年期 ，约50%的原发性感染均表现为IM。,EBV在人体B细胞建立潜伏感染，EBV只表达潜伏抗原（包括EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-LP、LMP-1、LMP-2及EBER），受感染者将成为终身带毒者。在机体免疫功能下降和某些因素触发下，潜伏的EBV可以被再激活，引起病毒复制及临床疾病。,EBV致病机制,EBV常见相关疾病,传染性单核细胞增多症 （Infectious mononucleosis,IM)慢性活动性EB病毒感染 （Chronic active EBVinfection，CAEBV）EB病毒相关性嗜血细胞综合征 （EBV-associated hemophagocytic syndrome, EBVAHS)Burkitts淋巴瘤 何奇金淋巴瘤,EBV感染的抗原表达,EBV溶解性感染期，可表达：早期抗原（EA）：EA/R和EA/D（具DNA多聚酶活性）； EA出现表明EBV活跃增殖，EA抗体出现在感染早期；衣壳蛋白（VCA）晚期表达的结构蛋白VCA-IgM出现在急性感染早期，VCA-IgG出现在急性感染期并持续存在膜抗原（MA）：细胞表面包膜糖蛋白（MA gp350/220,gp85)，是EBV的中和性抗原抗MA-IgM可用于早期诊断,EBV潜伏感染期，选择性表达早期抗原以及： 核抗原（EBNA-1,-2,-LP,-3A,-3B,-3C）：为DNA结合蛋白，在感染的B细胞核内；EBNA-1与感染有关，EBNA-2与细胞转化和永生化有关；EBNA抗体出现在感染晚期。 潜伏膜蛋白（LMP-1,-2A,-2B）：在感染B细胞表面，与细胞恶化有关， 未翻译的转录物BARF0和EBER EBNA-3、EBNA-2、LMP-1是EBV-CTL CD8+的主要目标,EBV感染的抗原表达,原发性EBV感染过程中首先产生针对衣壳抗原（capsid antigen, VCA）IgG和IgM，在急性感染的晚期，抗早期抗原（early antigen, EA）抗体出现在恢复期晚期，抗核抗原（nuclear antigen, NA）抗体产生，抗VCA-IgG和抗NA-IgG可持续终身,EBV感染的血清学诊断,传统检测策略的问题,EBV感染的血清学诊断,抗VCA-IgM和IgG可以同时出现，通常IgG出现较IgM晚，但偶尔较IgM出现早12周，抗VCA-IgM几周后检测不到抗EA-IgG在发病后3-4周后升高，34月后检测不到抗EBNA-1-IgG在发病后34周被检测到，持续终身，部分慢性EBV感染者检测不到抗VCA-IgG和抗EBNA-1-IgG终生持续阳性,EBV常见相关疾病,传染性单核细胞增多症(IM)infectious mononucleosis,特指由EBV感染引起的发热、咽炎和淋巴结肿大的综合征1889年被首次描述为“glandular fever”1920年正式定义为IM1932年发现嗜异性凝集实验1968年实验室工作人员感染EBV，出现IM临床症状和嗜异性凝集抗体，明确EBV是IM的病原,IM临床表现,25-30%的青少年和102.5copies/g 原位杂交：检测出EBER-1阳性细胞Southern杂交：受累组织或外周血中检测出EBV DNA免疫荧光：检测到抗原（EBNA、LMP）感染的B、T、NK细胞、单核/巨噬/组织细胞检测到EBNA、EBER、EBV-DNA,EBV相关的噬血细胞性淋巴组织细胞增生症EBV-associated hemophagocytic lymphohistocytosis EBV-HLH,是一种与EBV感染有关的淋巴增殖伴随吞噬血细胞现象的一类疾病EBV感染所致CD8+T细胞的异常增殖及其激活巨噬细胞，导致炎症细胞因子大量释放产生高细胞因子血症（细胞因子风暴）是EBV-HLH的主要病例生理特征临床表现发热、肝脾肿大、黄疸、全血细胞减少、DIC，骨髓和其他组织见嗜血细胞、LDH、铁蛋白、微球蛋白EBV-HLH常见于儿童和青少年,抗EBV病毒药物,无环核苷拟似剂acyclovir（阿昔洛韦），ED50 0.3ganciclovir（更昔洛韦）， ED50 0.05valaciclovir（缬昔洛韦 ）无环核苷酸cidofovir，adefovir焦磷酸盐 拟似剂 foscarnet（磷甲酸钠）作用机制作用病毒DNA多聚酶，抑制病毒复制,EBV感染的实验室诊断,外周血分类淋巴细胞50% WBC不典型淋巴细胞10% WBC（系激活的CD8+ CTL）血清学检查嗜异性凝集实验（heterophile test/spot test）VCA-IgM、IgG，EA-IgG，EBNA-IgG病毒学标志在PBMC、血清、全血或感染组织检测EBV-DNA、EBER、EBNA、LMP,EBV感染疾病的血清学诊断,临床需要回答的问题,是否感染EBV?EBV感染的时相？是否EBV活动性感染？疾病是否与EBV感染相关？,EBV实验室检测方法,病毒培养免疫学技术（免疫荧光法，免疫组化技术） 血清学方法（ELISA法，化学发光法） 基因诊断技术,嗜异凝集抗体试验：也称“Monospot”试验。在EBV还未确定为IM的病因之前，1932年引入临床实践诊断IM。当时发现IM患者的血清或血浆可以凝集马或绵羊的红细胞。该抗体在病程第12周出现，持续约6个月。在青少年原发性EBV感染中其阳性率可达80-90，约10的青少年缺乏对嗜异性抗体的阳性反应。,EBV实验室检测方法,EBV感染的血清学诊断评价,嗜异性抗体（heterophile antibody，HA）凝集实验（“spot” test）嗜异性抗体（IgM）在发病后7天内出现，2-5周达高峰，可以持续6-12个月，偶有12个月后以低水平存在HA阳性提示原发急性感染，EBV再激活感染几乎阴性阳性率：青少年和成年人71%-90%， 2-5岁儿童50%假阴性：发病第1周内假阴性率25%，10%成人始终阴性假阳性：2-3%自身免疫性疾病、HIV感染、心内膜炎、HAV肝炎,缺点需要硬件设备成本昂贵,优点敏感性高特异性强操作简便,化学发光技术,胶体金是氯金酸HAuCl4的水溶胶，氯金酸在还原剂的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态,简便，快捷，敏感度和特异度较差,EBERS原位杂交试验 EBV潜伏感染的细胞含有大量的EBERlEBER2（EBERS）转录子，其主要功能是抑制干扰素介导的抗病毒效应和凋亡。该转录子不翻译成蛋白质，每个EBV潜伏感染的细胞含有大约106拷贝EBERS，被认为EBV潜伏感染的最好标志物，因此原位杂交检测肿瘤细胞中EBERS是诊断肿瘤是否EBV相关的金标准,EBV实验室检测方法,EBV病毒核酸检测,实时荧光定量PCR是目前最主要的监测EBV载量的方法鉴别EBV健康携带者的低水平复制与EBV相关疾病患者高水平活动性感染。,EBV载量检测有多种方法，Real-time PCR是目前最主要的监测EBV载量的方法，有较强的敏感性和特异性。不同的EBV疾病进行Real-time PCR检测时，需要的标本不同。,EBV病毒核酸检测,EBV相关性疾病的病毒DNA定量检测,血清游离的EBV-DNA提示原发感染或者再激活健康携带者血清EBV-DNA通常检测不到,传单的EBV感染实验室诊断,血清学检测：同时满足下列2条者可以诊断为EBV-IM:1.下列临床症状中的3项：发热、咽峡炎、颈淋巴结肿大、肝肿大、脾肿大；2.原发性EBV感染的血清学证据，满足下列2条中任一项： （1）抗EBV-CA-IgM和抗EBV-CA-IgG阳性，且抗EBV-NA-IgG阴性（2）抗EBV-CA-IgM阴性，但抗EBV-CA-IgG阳性，且为低亲和力抗体,传单的EBV感染实验室诊断,DNA检测？:IM患者外周血中EB病毒载体在2周内达到峰值，随后很快下降。至病程14天，多数EBV-IM患者血清中已检测不到病毒核酸，病程22天后，所有EBV-IM患者血清中均检测不到病毒核酸。IM患者不推荐进行EB病毒载量检测,慢性活动性EBV感染的实验室诊断,EBV抗体检测,慢性活动性EBV感染的实验室诊断,DNA检测绝大多数CAEBV患者PBMC中EBV-DNA水平高于102.5拷贝/ug DNA部分CAEBV患者血浆/血清中EBV-DNA阴性CAEBV患者血浆/血清中EBV-DNA水平与病情严重程度和预后有关,EB病毒相关噬血淋巴组织细胞增生症,EBV-HLH可以发生在原发性EBV感染时期，既往EBV感染再激活时期EBV-HLH患者血清中EBV抗体反应呈多种反应类型，单纯血清EBV抗体检测对EBV-HLH的诊断意义不大。,EB病毒相关噬血淋巴组织细胞增生症,DNA检测:EBV-H