肝炎的分子诊断与临床应用

肝炎分子诊断项目开展介绍-艾迪康市场部目 录1、了解肝炎分子诊断2、分子诊断在 HBV中的临床应用3、分子诊断在 HCV中的临床应用4、 ADICON已开展的肝炎分子诊断项目 我国乙肝病毒感染率概况 2006 2010年全国乙型病毒性肝炎防治规划 显示，中国是乙型肝炎病毒感染和发病人数最多的国家，全国有 6.9亿 人曾感染过乙肝病毒，其中 1.2亿 人长期携带乙肝病毒。目前全国慢性乙肝病人 2000万 人，每年死于与乙肝相关的肝病患者达 28万 例，发病率和死亡率都位居前三位。每年造成的直接经济损失约达 3600亿 元人民币。我国乙肝病毒感染率概况什么是分子诊断在临床上应用核酸（ DNA/RNA) 和分子生物学技术 , 在基因水平诊断和监控疾病情况和疗效，评估疾病的检测方法。分子技术在乙肝诊断与治疗中应用HBV 分子诊断的临床应用高灵敏度HBV DNA定量HBV 感染监测药物疗效检测感染早期检测HBV 基因分型病情预后发展检测抗病毒药物效果预测P区耐药检测抗药性监测治疗药物选择S 区变异确定隐觅性病毒变异判断疫苗效果判断肝炎预后C区启动子变异确定病毒变异类型判断治疗效果确定治疗方案高灵敏度乙肝 DNA检测 高精度病毒载量检测系统（ COBAS AmpliPrep/Cobas TaqMan ）高灵敏度乙肝 DNA检测优势 定量 PCR技 术检测 患者的血清 HBVDNA含量，能更准确地反映病毒复制程度， 对 HBV相关疾病的 诊 断、治 疗 、判断 预 后意 义 重大。 QF-PCR是国内常用的定量 检测 血清 HBVDNA水平的方法， COBAS 系 统 是美国食品 药 品 监 督管理局 (FDA)批准用于血清 HBVDNA定量 检测 的方法。它 具有灵敏度高 ， 线 性范 围 广， 实时监 控， 重复性好 ，可 检测 A、 B、 C、 D、 E、 F、G、前 C区 变 异等多基因型 DNA载 量 优 点。 由于本 QF-PCR试剂 盒的 线 性范 围为 1.0x 103 copies mL 1.0x 108 copies mL， 对 于低于 1.0 x 103 copies mL标 本的 检测结 果不能 给 出具体拷 贝值 ，有存在漏 检 的可能。 而 COBAS 系 统线 性范 围为 20-1.7108 IU/mL， 因此， COBAS 系统 更能准确反映血清 HBV DNA含量。COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0检测 灵敏度 20 IU/mL 线 性范 围 20 1.7 x 108 IU/mL检测 基因型 A-H检测样 本量 650 mLSample Type 血清或 EDTA抗凝血 浆SFDA注册 证 Q3Cobas高灵敏度乙肝： 20 IU/mL 准确判断治疗起点 /终点线性范围乙肝： 20-1.7108 IU/mL 极佳的重复性，结果可靠正确指导抗病毒治疗每批试剂均使用WHO标准品校准 保证定量结果的准确性和可溯源性每个样本使用同源性内标定量避免结果不准确采用 AmpErase酶 减少交叉污染目前在 国内唯一 满足治疗指南和专家共识的 HBV DNA和 HCV RNA检测试剂HBV DNA 监测的重要性 口服核苷（酸）类似物疗效评估部分病毒学应答60 2,000 IU/mL加其他药物治疗每 3个月监测 HBV DNA开始治疗 - 基于 HBV DNA、 ALT水平和疾病发展阶段治疗第 12周评估是否存在原发性无应答 (较基线下降 2,000 IU/mL改用或加用更强药物每 6个月监测 HBV DNA*Keefe, E. Clin Gastro Hepatology. 2007; (5):890-897.抗病毒治疗应将 HBV DNA降至尽可能低的浓度，理想是低于实时定量 PCR方法（ 灵敏度 10-15 IU/mL） 的最低检出限 11. EASL HBV Guidelines. J Hepatology. 2009;50:277-242CHB疾病管理 :治疗目标HBsAg清除及血清学转换治疗终点ALT正常组织学改善 HBV DNA降低 /消失HBeAg血清学转换HBeAg消失cccDNA 清除*Lok, A.S.F et.al. “Chronic Hepatitis B: Update 2009.” HEPATOLOGY, Vol 50, No. 3, 2009, pgs 8-9 治疗终点 2009年 EASL指南提出的治疗终点： 最 理想的 治疗终点：持续的 HBsAg 消失，伴或不伴抗 HBs 抗体出现。 满意的 治疗终点：在 HBe Ag 阳性患者中，出现持续的 HBeAg 血清转换 次级的满意 治疗终点：尽可能降低病毒 DNA水平（降至实时定量 PCR检测限以下： 10-15IU/ml）HBV基因分型根据 HBV全基因核苷酸序列的差异，分为不同基因型 :A.B.C.D.E.F.G.H共 8个型不同的基因型具有不同地域分布我国主要是 BC型为主，偶有 A型 北方 C型HBV基因分型检测临床意义特征 基因型B型 C型感染性 低 高HbeAg阳性率 低 高HbeAg自然清除时间 短 长HBV DNA载量 低 高致病性 轻 重HCC发生率 低（低年龄组高） 高（高年龄组高）干扰素治疗完全应答率 高 低抗病毒治疗效果 高 低肝癌手术治疗预后 好 差癌栓栓塞治疗效果 好 差HBV变异的基础 乙肝病毒 :高变异性 1/105 24h 一万亿 -十万亿拷贝 *变异：一千万 一亿 复制过程 :DNA-RNA-DNA HBV逆转录酶 :缺乏严格的校正机制 变异 :自然变异 ,免疫压力等等原本有效的药物对发生耐药变异后的病毒束手无策变异前，药物有效抑制病毒 变异后，药物对病毒束手无策乙肝病毒 P区耐药P区耐药位点检测HBV病毒耐药性检测 长期使用抗病毒药物可引起 HBV耐药，引起耐药的基因突变位点 主要集中于 P区 原因：抗病毒药物作用在病毒 P区药物靶点上，引起相关基因变异，使得药物与相关靶点作用下降，进而产生耐药。抗病毒治疗后 HBV从病毒变异到临床耐药原发无应答病毒学（部分）应答临床耐药抗病毒治疗后 HBV从病毒变异到临床耐药病毒耐药的临床影响耐药病毒的出现使后续治疗的药物疗效降低耐药病毒的出现抵消了之前获得的临床益处病毒反弹 , 血清转氨酶升高 , HBeAg血清转换率降低肝脏病理进展肝硬化病人出现肝功能失代偿和死亡肝移植后肝炎复发率增高公共卫生危害耐药病毒株的传播免疫逃逸Liaw et al. 1999. Hepatology 30: 567病毒的水平越低，耐药发生的几率越低初治患者耐药发生率拉米夫定 ,阿德福韦 ,恩替卡韦为基因型耐药发生率 ,替比夫定为因耐药发生的病毒学反弹发生率P区耐药位点检测 长期使用抗病毒药物可引起 HBV耐药，引起耐药的基因突变位点 主要集中于 P区 耐药基因分析在临床药物选择上的应用目前最常见 P区耐药位点 11个（ 169、 173、 180、 181、 184、 194、 202、 204、233、 236、 250） 拉米夫定 M204I/V L180M V173L恩曲他滨 V173L L180M M204I/V阿德福韦 A181V N236T恩替卡韦 T184A（ G/I/S) M250V特比夫定 M204I/V常用抗病毒药物的耐药位点常见变异的交叉耐药性敏感 界于中间 耐药抗病毒药物的选择和使用1.一种药物产生耐药时，需要用具有不同耐药位点药物代替2.为减少耐药情况，建议从治疗开始就使用具有两种不同耐药位点药物一起治疗3.由于抗病毒药物的耐药以及治疗的长期性，在治疗过程中应该定期检查，或是在发现药物治疗效果不佳时需排除产生耐 药的可能药物治疗慢性乙肝患者管理路线图 检测检测检测检测耐药检测项目 目前检测的变异位点： P区耐药位点 11个（ 169、 173、 180、 181、 184、 194、 202、204、 233、 236、 250） 专门检测 LAM变异位点： 180， 181， 204， 173 专门检测 ADV变异位点： 181， 233， 236艾迪康医学检验中心 P区基因变异检验报告单 样张 丙型肝炎病毒l传播途径 :主要血液 /体液传播 (似 HBV)l是引起输血后慢性肝炎和肝硬化主要原因l无症状 HCV携带者和慢性丙肝者多见l感染 HCV后，慢性化的比例高达 50%以上l免疫力不牢固 黄病毒科 丙型肝炎病毒属 球形有包膜的 RNA病毒，直径 50nm