谷氨酸发酵机制以及杂菌噬菌体防治

谷氨酸发酵机制,一、谷氨酸合成途径二、葡萄糖发酵谷氨酸的理想途径三、细胞膜通透性的调节四、谷氨酸生产菌的特征和种类,一、谷氨酸合成途径,糖酵解途径（EMP途径） 磷酸戊糖途径（HMP途径）三羧酸循环乙醛酸循环丙酮酸羧化支路（CO2固定反应）,谷氨酸发酵的代谢途径,生成的丙酮酸，一部分在丙酮酸脱氢酶系的作用下氧化脱羧生成乙酰CoA，另一部分经CO2固定反应生成草酰乙酸或苹果酸.草酰乙酸与乙酰CoA在柠檬酸合成酶催化作用下，缩合成柠檬酸，进入三羧酸循环，柠檬酸在顺乌头酸酶的作用下生成异柠檬酸，异柠檬酸再在异柠檬酸脱氢酶的作用下生成-酮戊二酸，-酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前体。-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶作用下经还原氨基化反应生成谷氨酸,谷氨酸,脱氢酶,合成酶,Glc,丙酮酸,草酰乙酸,CO2,天冬氨酸（Asp）,乙酰-coA,CO2,羧化酶,柠檬酸,顺乌头酸,异柠檬酸,-酮戊二酸,Glu,反馈抑制,异柠檬酸,脱氢酶,反馈阻遏,优先合成,谷氨酸生物合成调节机制,-酮戊二酸脱氢酶,优先合成 谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，就会抑制和阻遏自身的合成途径，使代谢转向合成天冬氨酸柠檬酸合成酶的调节 柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，除受能荷调节外，还受谷氨酸的反馈阻遏和顺乌头酸的反馈抑制，谷氨酸合成过量时，代谢转向天冬氨酸的合成。,优先合成与反馈调节,-酮戊二酸脱氢酶的调节在谷氨酸产生菌中，-酮戊二酸脱氢酶活性微弱，使-酮戊二酸不能继续氧化。谷氨酸脱氢酶的调节 谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈阻遏 -酮戊二酸合成后由于-酮戊二酸脱氢酶活性微弱，谷氨酸脱氢酶的活力很强，故优先合成谷氨酸,控制谷氨酸合成的重要措施,丙酮酸羧化酶,柠檬酸合成酶作用生成柠檬酸,乙醛酸循环基本不发生,一柠檬酸脱氢酶作用,-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱,谷氨酸脱氢酶能力强,细胞膜通透性强,（1）葡萄糖经过EMP和HMP生成丙酮酸，以EMP途径为主，生物素充足时HMP占38%，亚适量为26%.(2) 生成的丙酮酸在脱氢酶系作用下生成乙酰辅酶A，另一部分生成草酰乙酸或苹果酸。（3）草酰乙酸和乙酰辅酶A在柠檬酸合成酶作用下生成柠檬酸，然后再顺乌头酸酶作用下生成异柠檬酸，再在异柠檬酸脱氢酶作用下生成-酮戊二酸。控制谷氨酸合成的重要措施 1、-酮戊二酸氧化能力弱 2、谷氨酸脱氢酶活性强 3、细胞膜对谷氨酸通透性高,二、细胞膜通透性的调节,对谷氨酸发酵的重要性：当细胞膜转变为有利于谷氨酸向膜外渗透的方式，谷氨酸才能不断地排出细胞外，这样既有利于细胞内谷氨酸合成反应的优先性、连续性，也有利于谷氨酸在胞外的积累。,细胞膜是在细胞壁与细胞质之间的一层柔软而富有弹性的半渗透性膜，磷脂双分子层为其基本结构，在双分子层中镶嵌蛋白质。,一种是通过控制脂肪酸和甘油的合成，实现对磷脂合成的控制，使得细胞不能形成完整的细胞膜；一种是通过干扰细菌细胞壁的形成，使得细胞不能形成完整的细胞壁，丧失了对细胞膜的保护作用。在膜内外渗透压差等因素影响下，细胞膜物理性损伤，增大膜的通透性。,根据细胞膜的结构特性，控制细胞膜通透性的方法主要有两种：,1控制细胞膜的形成,1、利用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵时，限制发酵培养基中生物素的浓度。生物素是催化脂肪酸合成起始反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶，对脂肪酸的形成起促进作用，进而影响了磷脂的合成和细胞膜的形成。选育生物素缺陷型菌株，阻断生物素合成，亚适量控制生物素添加，抑制不饱和脂肪酸的合成，使得细胞膜不完整，提高了细胞膜对谷氨酸的通透性。,2、利用生物素过量的糖蜜原料进行谷氨酸发酵时，添加表面活性剂或饱和脂肪酸。 在生物素过量的条件下，添加表面活性剂或饱和脂肪酸仍能进行谷氨酸发酵，其原因在于这些物质对生物素起拮抗作用，抑制不饱和脂肪酸的合成，导致油酸合成量减少，磷脂合成不足，使得细胞膜不完整，提高了细胞膜对谷氨酸的通透性。常用的表面活性剂有吐温-60、吐温-40等。常用的饱和脂肪酸有十七烷酸、硬脂酸等。,3、利用油酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，限制发酵培养基油酸的浓度。 油酸缺陷型菌株丧失了自身合成油酸的能力，直接影响磷脂的合成，不能形成完整细胞膜，必须添加油酸才能生长，所以通过控制油酸的添加量，实现细胞膜对谷氨酸的通透性。 当油酸过量时，该菌株只长菌或产酸少；当油酸亚适量时，随着油酸的耗尽，细胞膜结构与功能发生变化，使得谷氨酸的通透性提高。,一种脂肪酸。分子式C18H34O2,甘油缺陷型菌株不能自身合成磷酸甘油和磷脂，外界供给甘油才能使其生长，因此可以通过控制甘油添加量来控制细胞膜对谷氨酸的通透性。 当甘油添加量过多时，磷脂正常合成，菌体正常生长，不产酸或产酸低； 当甘油添加量过少时，菌体生长不好，产酸低，所以控制甘油亚适量是控制的关键。,4、利用甘油缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，限制发酵培养基甘油的浓度。,5、利用温度敏感突变株控制细胞膜的生物合成,温度敏感突变株的突变位置是发生在决定与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜结构的基因上，发生碱基的转换或颠换，一个碱基为另一个碱基所置换。这样，该基因所指导译出的酶只能在一定温度下有合成完整细胞膜的活性；提高温度此酶就失活，导致细胞膜某些结构改变。,2控制细胞壁的形成,细胞壁的骨架结构是肽聚糖。对细胞壁形成的控制方法：添加青霉素、头孢霉素C等-内酰胺类抗生素。,双糖单位：N-乙酰胞壁酸（NAM）和N-乙酰葡萄糖胺（NAG）,青霉素是糖肽末端结构(D-Ala-D-Ala)的类似物，与转肽酶的活性中心结合，使转肽酶受到了不可逆的抑制，糖肽合成不能完成，结果形成不完整的细胞壁，使细胞膜处于无保护状态，易于破损，增大谷氨酸的通透性。,转肽酶功能：在蛋白质生物合成过程中肽键的形成具有必须的作用。转肽酶识别特异多肽,催化不同的转肽反应。,青霉素控制细胞壁形成的原因：,由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途径：A？B？,谷氨酸生物合成的理想途径,三、葡萄糖发酵谷氨酸的理想途径,1、当通过CO2固定反应供给四碳二羧酸时，葡萄糖的理论转化率为,1分子葡萄糖1分子谷氨酸,由上述谷氨酸生物合成的理想途径可知，由葡萄糖生物合成谷氨酸的总反应方程式为：C6H12O6+NH3+1.5O2 C5H9O4N+CO2 + 3H2O,1mol葡萄糖1mol谷氨酸，因此理论糖酸转化率为81.7%。,若CO2固定反应完全不起作用，丙酮酸在丙酮酸脱氢酶的催化作用下，脱氢脱酸全部氧化成乙酰CoA，通过乙醛酸循环供给四碳二羧酸，则反应如下：1mol 葡萄糖2乙酰CoA 四碳二羧酸0.5 mol 葡萄糖乙酰CoA 由于3葡萄糖可以生成2mol的谷氨酸，因此理论糖酸转化率仅为54.4%。实际糖酸转化率处于54.4%和81.7%之间。,2、当通过乙醛酸循环供给四碳二羧酸时,1mol Glu,噬菌体与杂菌的防治,一、什么是噬菌体二、谷氨酸发酵中噬菌体的污染三、防治噬菌体对谷氨酸发酵的污染四、染菌隐患的检查和处理五、染菌的预防措施,目录,什么是噬菌体,噬菌体是侵染细菌、放线菌等微生物并使细胞裂解死亡的一类病毒。噬菌体对理化因素抵抗力强，且寄生性具有高度特异性专一性，一种噬菌体往往只侵染一种或某一菌株,谷氨酸发酵中噬菌体的污染,噬菌体污染发酵液以后的情况，因为发酵工业的种类、污染噬菌体的特性、感染时间、培养基成分、发酵罐内物理和化学条件等不同而异，即同样的噬菌体不一定引起同样的异常发酵情况,（一）噬菌体污染的异常情况,由于污染时间和感染数量不同，以及噬菌体毒力差异表现的症状不一，但一般有”二高三低“即pH高、残糖高、OD值低、温度低、谷氨酸产量低。具体表现如下：1、二级种子污染噬菌体：OD值不长、pH上升、泡沫大、耗糖慢、不产酸等电信的噬菌体污染现象。2、发酵前期污染噬菌体：吸光度先升后降、不升或回降pH升到8以上且不下降，OD值下跌耗糖慢。产生大量泡沫粘度增大发酵液发红发灰，有刺激性气味，氨基酸产量少或不产,镜检时发现菌体数量显著减少具体不规则革兰士染色有红色碎片。平板有噬菌斑。发酵周期变长，生物素需求变大。精制中和时色素深泡沫大碱液加不进去。3、发酵后期污染噬菌体：对产酸影响不大有时还能提高产酸。但也不能忽视，因为不仅会使难于过滤且污染会前移造成更大污染,三、防治噬菌体对谷氨酸发酵的污染,1、合理使用抗性菌株：使用对噬菌体不敏感的菌株，也可以轮换使用对噬菌体敏感性弱的菌株。2、利用药物防治噬菌体：现在使用的药物分为两类：一是阻止噬菌体吸附的药物，多为螯合剂；另一类是抑制噬菌体蛋白质合成或阻断其复制的药物，多为抗生素。此外还有用染料、抗坏血酸杂蒽累等药物。但不能对人体有害。,3、采取以环境净化为中心的综合防治措施：如定期检查包括空气在内的环境中的噬菌体；严禁活菌体任意排放，凡是污染噬菌体的发酵液、洗罐水等都要加热到80C以上，发酵罐拍的气体都要与蒸汽或碱液、漂白粉充分混合；灭杀环境中的噬菌体；灭杀压缩空气中的噬菌体；避免噬菌体侵染菌株；避免噬菌体侵入设备4、污染噬菌体的挽救措施：并罐法、菌株轮换活使用抗性菌株、放罐重消法、罐内灭噬菌体法,四、染菌隐患的检查和处理,（一）染菌检查 ：检查净化空气、检查培养基和培养物、检查发酵罐、检查罐道的污染隐患、检查无法直接观察的设备部件杂菌污染,（二）染菌处理 1、前期出现染菌：轻度时降低温度，降低pH，补加适量的菌种等确立生产菌的生长优势 。严重时糖分高则实施实罐灭菌低则补加培养液，无法挽救则倒罐。2、中期染菌：降低通风量温度，停止搅拌补加糖3、后期染菌：轻度染菌则可以让其发酵完，可以适当提前放罐；重度染菌则立即放罐，并且度空罐进行清洗灭菌,五、染菌的预防措施,（一）空气的净化：减少过滤前空气的尘埃、贾少过滤前