lamp技术介绍以及在微生物检测中的应用.doc

研究生课程论文课 程: 微生物检测技术 题 目 LAMP技术及其在微生物检测中的应用 姓 名: 王 飞 学 院: 生命科学学院 专 业: 微生物 学 号: 2011216016 20 11 年 12 月 30 日LAMP技术及其在微生物检测中的应用摘要：环介导等温扩增(1oop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是近年来发展出的一种敏感、特异、方便快捷的核酸扩增技术。与传统PCR方法相比，LAMP不需要热循环，为等温扩增，且由于LAMP反应中产生大量的副产物一白色焦磷酸镁沉淀，扩增产物可不经过电泳，通过肉眼观察或浊度计即可判定结果。因此LAMP是一种不需要热循环仪、肉眼即可判定结果的高度特异和敏感的DNA扩增方法。近年LAMP技术在病原微生物检测及食品微生物检测上已有广泛应用，本文就LAMP极其在这两方面的研究进展作一综述。关键词：LAMP；环介导等温扩增；核酸扩增Application of LAMP in detection of microorganismAbstract: LAMP (loop-mediated isothermal amplification) method, which develops in recent years, is a sensitivity, special and convenience nucleic acid amplification technique. To compare with the traditional PCR, LAMP, which neednt hot circle, is constant temperature amplification. Because LAMP can produce a mount of coproduce, magnesium pyrophosphate, which is a white precipitation, the result can be estimated by eyes or nephelometer without electrophoresis. In recent years, the application of LAMP in detection of disease pathogen and microorganism in food had been wide studied. These articles summarize the studies in these two aspects.Key words: LAMP; loop-mediated isothermal amplification; nucleic acid amplification1.引言核酸体外扩增技术是分子生物学领域最重要的研究手段之一，以检测核酸为基础的分子诊断技术已广泛应用于临床医学和微生物检测等领域。目前，核酸体外扩增技术主要包括常规PCR扩增和等温扩增两大类。常规PCR包括单一PCR1、复合PCR2、套式PCR、竞争性PCR3和实时荧光定量PCR4-8，等温扩增包括核酸序列依赖扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)9、滚环DNA 扩增(rolling circle DNA amplification，RCA)10、指数式扩增反应(exponential amplification reaction，EXPAR)11、连接酶链扩增反应(ligase chain reaction，LCR)12、链置换扩增反应(strand displacement amplification，SDA)13和环介导等温扩(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)14技术等。常规PCR扩增由于快速、灵敏度和特异性高等优点广泛用于分子诊断领域，但由于常规PCR扩增需要配套的控温精密的仪器和复杂的实验程序，大大提高了检测成本。等温扩增技术是近年来发展迅速的一类核酸体外扩增检测技术，其区别于常规PCR扩增技术的关键在于扩增反应的温度不同，无需控温精密的实验仪器和复杂的实验程序。上述几种等温核酸扩增技术中，LAMP技术由于具有快速、高效、灵敏度高、特异性高和可定量分析等优点已经广泛用于临床和微生物分子诊断领域。本文就LAMP技术的原理、引物设计及其在分子诊断和检测领域的应用进行综述。2.LAMP的技术特点2.1 LAMP技术的定义LAMP是一种敏感的链取代核酸扩增技术,这种方法能在恒温条件下(约65)、一个小时内,将目的DNA从几个拷贝扩增到109个拷贝。LAMP技术扩增、检测目的核酸片断,一般以200300bp为宜,一般实验流程包括:GenBank检索目的基因片断(并通过BLAST确定该片断与其他物种基因的同源性),人工或在线设计引物组,引物合成、Bst DNApolymerase large fragment (若进行RT-LAMP扩增,还需加入AMV反转录酶)及相关缓冲液准备,确定反应体系、扩增,反应结果判定等15。2.2 LAMP引物LAMP技术的引物设计，比PCR技术要复杂16。它针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，包括对内引物FIP和BIP，和一对外引物F3和B3。若再增加一对环引物(1oop primer)，便可使反应加速，提高扩增效率。相关文献17,18对引物设计的技术做了详细的报道，并且目前已开发出用于LAMP引物设计的相关软件，如Primer Explorer version 3软件，使引物设计更加简便。2.3 LAMP扩增原理 6065是双链DNA复性及延伸的中间温度，是一种动态活性温度，因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶，使得链置换DNA合成在不停地自我循环19。扩增分两个阶段。第1阶段为起始阶段，上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换DNA聚合酶作用下向前延伸启动链置换合成，外部引物F3与模板F3c结合并延伸,置换出完整的FIP连接的互补单链，FIP上的F1c与此单链上的F1为互补结构，自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板，下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成， 形成哑铃状结构的单链，迅速以3末端的F1区段为起点，以自身为模板，进行DNA 合成延伸形成茎环状结构，该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。第2 阶段是扩增循环阶段，以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合，开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构，迅速以3末端的B1区段为起点，以自身为模板，进行DNA合成延伸及链置换，形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮扩增，且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB,它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物，且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。2.4 LAMP产物的检测(1)电泳检测：LAMP的产物可以用琼脂糖凝胶电泳，紫外线下观察，由于产物是混合物，故呈现出特异的梯状条带，经限制性内切酶酶切之后呈现单一靶序列条带20。(2)荧光检测：SYBR Green I 荧光染料只与双链DNA小沟结合， 当它与DNA双链结合时，肉眼观察荧光染料由橘黄色变为绿色，紫外线下可以发出荧光21，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA 分子的数量，荧光强度检测可以用实时定量PCR仪进行。(3)浊度检测：是其特有也是最常用最便捷的检测方法，在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2结合， 产生副产物焦磷酸镁的白色沉淀。反应方程式如下：（DNA）n-1 dNTP（DNA）n P2O74P2O74 2Mg2 Mg2P2O7（沉淀）其具有极高的特异性，只要用肉眼观察22或浊度仪在400nm光下检测浊度就能够判断扩增与否，并对起始模板定量，达到实时定量的检测23。2.5 LAMP的特点LAMP 与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点：(1)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断，对于RNA 的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就可同步进行（RT-LAMP）,不需要特殊的试剂及仪器。(2)快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性，避免了温度循环而造成的时间损失，核酸扩增在1h内均可完成，添加环状引物后时间可以节省1/2，多数情况在2030min均可检测到扩增产物,且产物可以扩增至109倍,达0.5mg/mL，应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。(3)高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高。(4)高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。同时LAMP还有一些不足的地方。由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度好在300bp以内，大于500bp则较难扩增，故不能进行长链DNA的扩增。由于灵敏度高，极易受到污染而产生假阳性结果，故要特别注意严谨操作，以及在产物的回收鉴定、克隆、单链分离21方面均逊色于传统的PCR 方法。3. LAMP技术在人类传染病病原检测中的应用3.1 DNA病原检测DNA类致病病原主要为DNA病毒和DNA细菌。相对而言，LAMP技术对DNA病毒的检测研究相对较多。2005年Enomoto等23对单纯疱疹病毒的I型和II型分别设计LAMP引物，彼此之间保持高度特异性，并发现琼脂糖凝胶电泳比沉淀直接观测在灵敏度上高210倍；对18份病人拭子进行检测，I型和II型检出率分别为50和56.特异性为90和100。Yoshikawa24和Ihira等25分别建立了人疱疹病毒6型和7型的LAMP检测方法，他们设计的LAMP引物具有高度的特异性和敏感性，且对人疱疹病毒6型的研究还发现，当提高引物浓度时，灵敏度可提高一倍。Suzuki等26对巨细胞病毒进行了LAMP技术的研究，不但证实了该技术用于巨细胞病毒检测敏感、特异，还对构建巨细胞病毒质粒cDNA标准品的定量检测进行了探讨，其检测标准曲线的相关系数达到994。Yamada等24对细小病毒B19也进行了相应检测，证实LAMP技术比常规PCR技术灵敏100倍，还成功尝试了SYBR Green I直接染色判定检测结果。在细菌病原检测方面，Hara-Kudoa等27对沙门氏菌的39个血清型220个菌株进行了LAMP检测，运用了3种结果判定方法；灵敏度达到22cfu管，明显高出常规PCR。Maeda等27在对牙龈卟啉单胞菌的检测中也运用了3种结果判定方法，发现琼脂糖电泳和SYBR Green I的检测极限相近，直接沉淀观测法则低10倍；此外，通过real-time PCR和real-time LAMP的比较发现，后者在快速性、便捷性上有较大优势。最近，Yano等23对肠毒素大肠杆菌的LTI及STI基因的LAMP研究再次验证了该法的特异性(非LTI及STI基因型的Ecoli及其他细菌均不扩增)及高灵敏性，加人环引物后扩增时间可以从60分钟缩至35分钟。3.2 RNA病原检测人类传染病的RNA病原主要是指RNA类病毒。RNA类病毒的基因组有变异大和进化快的特点，它不但是许多重大传染病的病原，也是当前人们研究的重点。Thai等25根据SARS冠状病毒的保守序列1b Rep gene开放读码框设计了包括环引物在内的6条引物，进行了一步法RTLAMP检测；检出时间早至11分钟，检测极限达到0.01PFU，灵敏度比RT-PCR高100倍；对49例临床鼻、咽拭子进行RT-LAMP和RT-PCR对照检测，RT-LAMP的灵敏性达到100,产物经限制性内切酶酶切及测序验证其特异性达到87。Shirato等26对59例人呼吸道合胞病毒进行了RT-LAMP、病毒分离和免疫学检测，检出率分别为61、34和56;此外，还对RSV的A、B亚型分别设计特异引物，并进行产物酶切鉴定。研究表明，RT-LAMP是一种稳定可靠、敏感度高的实用型检测技术。今年Yoshida等27建立了从临床病样中检测腮腺炎病毒的LAMP方法，其引物组针对腮腺炎病毒基因组中血红球凝集素一唾液酸苷酶编码区域设计，可用于鉴别腮腺炎Hoshino疫苗株和循环野生株。Pafida等28建立了不同血清型登革热病毒的一步法real-time RT-LAMP检测，该法的检出率达100,而常规RTPCR和细胞培养分离的检出率只是87和81 且不与黄病毒科其他病毒有交叉反应。Kumsaki等28对危害性很大的埃博拉病毒(Zaire Ebola virus)也进行了real-time RT-LAMP检测研究。在体外转录得到高浓度目标RNA后实施定量RTLAMP检测，26分钟内可以测到103拷贝，30分钟内可以测到104个拷贝。Toriniwa等25也成功地将real-time RT-LAMP应用到日本乙脑病毒的检测上。由于诺如病毒(Nomvirus)基因型间的多样性和型内的高变异性，其RTLA MP引物的设计难度较高，操作也相对复杂。Fukuda等26对I型和型诺如病毒分别设计了9条和13条特异引物，并对26份临床粪便进行一步法单管RT-LAMP扩增，结果RT-LA MP对I型和型诺如病毒的检测极限分别达到100个拷贝管和1000个拷贝管；与传统的RT-PCR相比，RT-LAMP对工型诺如病毒的特异性为94 ，I型诺如病毒为100。4.LAMP在食品病原微生物检测中的应用4.1食品中大肠杆菌的检测肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli EHEC)是指能够引起人类出血性肠炎的一类大肠杆菌,主要经口传播。该菌引起的食物中毒首先在美国于1982年爆发,之后在世界各地相继发现病例。即使在卫生条件较好的国家,大多数肠道传染病已基本得到控制,但EHEC感染问题仍日益严重,越来越受到各国的高度重视。在美国、加拿大、英国和日本等发达国家,都发生过E.Coli O157的暴发流行。2001年卢林秋等进行的调查表明,我国食品中也存在E. Coli O157菌株。EHEC类型多,血清型复杂,常规检测方法难以有效实现快速、灵敏地进行全面检测。2003年Maruyama27等用原位LAMP方法检E.ColiO157H7O27(有一个stx1基因和两个stx2基因)的stx2基因,并用FITC标记抗E.ColiO157H7抗体,在紫外下照射。试验结果显示,较原位PCR而言,温和的渗透性及低等温条件使得原位LAMP引起较少的细胞损伤,并且在DNA扩增中允许使用荧光抗体标记。此外,Maruyama还发现LAMP方法的背景颜色较浅。因此,LAMP方法是一种特异性强、敏感性高、省时、省力的EHEC检测方法。侵袭性大肠杆菌(Enteroinvasive E. coli EIEC)是一种肠道侵袭性细菌。它侵入肠黏膜上皮细胞,在细胞内繁殖引起细胞变性,使肠上皮出现损伤,导致黏膜固有层发生炎症、溃疡、出血,临床上表现出细菌性痢疾症状,所以当初称之为志贺痢疾样大肠杆菌(Shigelloid E. coli)。国内于1984年首次报道了EIEC引起的食物中毒28。可见EIEC是一组较重要的腹泻病原菌。然而,由于其生化反应不典型,部分血清型与志贺菌属间存在抗原交叉,从而给鉴定工作带来了很多困难。因此,在日常检测工作中往往被忽视或误报为志贺菌属。从流行病学方面来考虑,准确的病原学诊断是必不可少的。2005年Song29等用LAMP方法对EIEC和志贺氏菌的同源基因ipaH进行检测。作者从病人的腹泻样便中分离出38株肠病原体用于检测LAMP方法的特异性,一株志贺氏菌YSH6000用于比较LAMP和PCR的敏感性。LAMP方法对所有的致贺氏菌及EIEC呈阳性,对其它菌呈阴性;整个LAMP实验在2h以内完成,其最小检测限达到8个菌落单位。相比较而言, PCR的检测限为8102个菌落单位。LAMP方法是特异性强、敏感性高的EIEC快速检测方法。4.2沙门氏菌的检测沙门氏菌(Salmonella)是引起食品中毒和伤寒的主要病原菌,主要通过污染食品和水源而传播。沙门氏菌引起的食物中毒最常见。约占细菌性食物中毒的42. 6%-60%。目前所使用的沙门氏菌分离培养、生化反应、血清学和传统PCR技术等检测方法操作繁琐、费时、灵敏度低、易污染,已不适于食品和水源的卫生监测和流行病学调查。2005年,KayokoOhtsuka30等对疑被感染沙门氏菌的水样鸡蛋中进行抽样(110个样品)检测并与分离培养及PCR做比较。结果显示, PCR漏检了10%, LAMP及分离培养的检出率为100%;LAMP是比分离培养更快速、灵敏的检测技术。因此, LAMP方法是快速、灵敏、特异的沙门氏菌检测方法,是鸡蛋车间管理的可靠监控手段。4.3白斑综合症病毒的检测白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是世界水产养殖业危害最严重的病原之一,它不仅存在对虾中,而且存在于其他的甲壳类动物中,例如,螃蟹、小龙虾等。该病毒分子量较大、结构特异,是已知动物病毒中最大的病毒。Lightner报道,WSSV在所有对虾病毒中,毒力最强,危害最大。2003年Tomoya Kono等根据WSSV-DNA序列设计4条引物F1、F2、B1c、B2c(大小分别为20nt、19 nt、22 nt、20 nt),用LAMP方法和巢式PCR对对虾组织中分离的WSSV-DNA进行扩增,比较了两种方法的检测限。结果表明,LAMP的检测限达到1fg,一步法PCR的检测限是100pg,二步法PCR是10fg,说明LAMP方法的灵敏度远远高于PCR。由此可知, LAMP方法是WSSV的快速、高效检测方法。4.4检测传染性造血器官坏死病毒LAMP方法不仅可以扩增DNA,而且可以扩增RNA。只要在原反应体系中加入RNA反转录酶(15U/L)即可传染性造血器官坏死病(infectioushematopoietic necrosis virus, IHNV)是一种RNA病毒,主要引起大马哈鱼和虹鳟鱼苗和幼鱼的传染性造血器官坏死病,造成脾脏和前肾造血器官坏死。IHNV是迄今为止世界上已经报道的共约50种鱼类病毒中危害极为严重的一种。2004年Gunimaladevi等首次发表了用LAMP方法检测虹鳟鱼及鲑鱼中的IHNV。作者同时用LAMP及RT-LAMP方法检测虹鳟鱼的IHNV,并比较LAMP与巢式PCR的检测灵敏度。研究结果显示, LAMP和RT-LAMP方法的检测限相似,而比PCR高一个10的数量级。此研究表明LAMP方法具有简便、快速、特异性和灵敏度高等特点,是极具前途的快速检测IHNV的方法。5.LAMP技术前景展望 LAMP 是本世纪发展起来的一种分子生物学技术， 虽然还存在诸多的缺点和不足，但它在不断地改进和完善，它最主要的优点是不需要昂贵的仪器设备、操作程序简单、扩增快速高效，适合各种条件下的快速检测，实用性强，故其应用范围越来越广泛。综上所述，我们有理由相信LAMP 作为一种核酸扩增的快速检测方法，将会有更广阔的应用前景。参考文献：1 Saiki RK, Scharf S, Faloona F, et al. 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