染菌及其相关的问题(经典).doc

染菌概述及其相关的问题一、染菌的概念及其对发酵的影响“染菌”是因“纯种发酵”而存在。理论上，克服染菌的方法只有二种：杀灭杂菌和阻挡杂菌。“杀灭杂菌”湿热、干热、射线和化学药品（药物）灭菌法。“阻挡杂菌”过滤（绝对过滤和相对过滤）染菌对微生物发酵所造成的危害可因生产品种，杂菌种类，污染时间，污染程度等的不同而不同。但至少包括：1、培养基及能源的浪费；2、干扰了正常代谢或消耗营养而减少产量；3、发酵液性状改变而影响提取过程和降低提取收率；4、产品质量难以保证；5、增加三废处理难度；6、打乱生产计划；7、提高劳动强度；8、影响人们情绪；9、经济损失。举例：青霉素发酵染细菌；头孢菌素C、制霉菌素发酵染细菌；噬菌体污染。二、从微生物本身的生长特性分析染菌过程1、微生物的一般特性：个体小，非成群生长时肉眼看不见；是生物，有极强的生命力；对环境的适应能力强，变异也快；条件合适时生长迅速。2、微生物的结构：芽孢某些杆菌在生长到一定阶段后，细胞浆脱水浓缩，在细胞的中间或顶端形成了椭圆形或圆形的小体，这就是芽孢。芽孢的含水量很少，芽孢壁很厚，与环境的交换率低（即芽孢壁的通透性很低），抗干燥能力和抗热性很强，对化学灭菌剂也有较好的耐受性，是杆菌的一种休眠体。当遇到合适条件时即萌发成新的个体。噬菌体结构更为简单。3、微生物的营养要求和生长条件： pH 霉菌：46，细菌和放线菌：7.27.6，嗜碱杆菌能耐受20% 浓度的氨水。 温度 低温只能减慢或中止微生物的生命活动，而不易杀死微生物；高温能使微生物死亡，温度愈高死亡愈快。值得特别注意的是细菌的芽孢和霉菌、放线菌的孢子由于含有特殊的成分和含有较少的水分而具有更高的抗寒力和耐热性；细菌的芽孢富含钙离子和吡啶2、6二羧酸（简称DPA），是细菌芽孢耐热的本质所在，在酸性或碱性条件下，细菌芽孢的耐热性会降低。微 生 物最低温度适宜温度最高温度嗜冷微生物0 510 2030 嗜温微生物5 2537 4550 嗜热微生物30 5060 7080 通气 （需氧微生物、厌氧微生物、兼性厌氧微生物； O2，CO2，N2 ）。4、不同种类的微生物有不同的生长特性：霉菌、放线菌、细菌、噬菌体即病毒（形态、菌落、生长与繁殖的速度，影响生长特性的因素有：培养条件、培养基成分）5、微生物的个体大小（微米）：微生物名称细胞形状径宽径长大肠杆菌短杆状0.40.71.03.0大肠杆菌（活）短杆状1.01.12.06.0普通变形杆菌短杆状0.51.01.03.0普通变形杆菌（活）短杆状1.01.41.43.1枯草杆菌短杆状0.50.81.64.0枯草杆菌孢子广椭圆形0.51.00.91.6巨大芽孢杆菌短杆状0.91.72.45.0巨大芽孢杆菌（活）短杆状1.62.03.79.7巨大芽孢杆菌孢子广椭圆形（球杆状）0.61.20.91.7藤黄八叠球菌球状1.01.5噬菌体0.080.1三、染菌过程的分析（染菌的原因）1、 染菌时间的确定：习惯上认定的染菌时间是指在无菌检查或显微镜下看到了杂菌后根据经验往前推。鉴别杂菌和判断染菌的主要依据：在显微镜下观察微生物的形态特征和统计数量；观察无菌操作跟踪斜面上的菌落特征（应注意所使用的培养基）及出现的时间等。在宏观上或微观上看到了杂菌之前的若干小时怎么定？数量依据是什么？这个“若干小时”的长短与杂菌进入纯培养系统时的数量有关，与纯培养系统的规模有关。显然侵入的杂菌越多，规模越小，则这个“若干小时”越短。下表的计算虽然烦琐，而且与实际情况相差甚远，但通过计算将有助于对杂菌进入纯培养系统即真正的染菌时间作出判断。在实际工作中分析染菌原因，采取防范措施，都与这个真正的染菌时间有关。假设杂菌入侵的数量在几十个（如种子罐接种时操作不严密而造成杂菌入侵）到数百万个（如设备微小破损引起的杂菌入侵）。而在显微镜下能够观察到杂菌存在时的杂菌浓度至少已经达到每毫升发酵液约二十万个，如果发酵罐中发酵液的体积以15吨计，则杂菌总数已经达到了三万亿个（31012个）。从几十个或数百万个杂菌变成三万亿个杂菌是需要时间的，这段时间的长短随杂菌的种类不同而不同，也随培养条件的不同而不同。以大肠杆菌为例计算如下。大肠杆菌在最适培养条件（肉汤，37，振荡，处于对数生长期）下繁殖一代所需要的时间是20分钟。假如在某一时刻有一个大肠杆菌进入了发酵液，并且发酵液的体积是15吨（1.5107 ml），则根据理论计算（见下表所列数据）要经过8个小时，大肠杆菌的数量才能达到1.7107个，即每毫升发酵液中有一个大肠杆菌。此时在显微镜下是找不到大肠杆菌的。只有再经过6个小时，当大肠杆菌的数量由每毫升发酵液中有一个长到每毫升发酵液中约有二十万个，才能在显微镜下见到几个大肠杆菌。由此可见，在最适培养条件下从实际上已经染菌了到在显微镜下能够判断染菌了，大约需要14个小时。又假如在30吨（3107 ml）发酵液中有1000个大肠杆菌同时进入，则在4小时40分钟后大肠杆菌的数量达到了每毫升发酵液中有一个（从1024个到16777216个）。那么15吨的发酵液（4小时20分钟），7.5吨的发酵液（4小时），。这些只是理论上的计算，在实际生产中大肠杆菌的生长速度要慢得多，必须具体做一做，即分离纯杂菌和测定杂菌在生产系统中的实际生长速度。在最适培养条件下大肠杆菌生长数量和时间一览表小时20分钟40分钟60分钟数量级显微镜视野02488100见不到11632646.4101见不到21282565125.1102见不到31024204840964.1103见不到4819216384327683.3104见不到5655361310722121442.1105始能见到6524288104857620971522.1106已较明显741943048388608167772161.7107密密麻麻833554432671088641342177281.3108非常严重判断染菌并寻找原因必须依次做好：（1）在显微镜下看到了杂菌，并且在下一个取样时间的样品中杂菌数量明显增多，这是判断染菌的第一时间。（2）观察到无菌跟踪的斜面和肉汤也已经染菌，且染菌现象越来越严重。此时应该做杂菌的纯化分离工作，以获取纯杂菌斜面备用。（3）测定杂菌在生产用培养基中和生产培养条件下的生长速度，兼顾在有生产菌参与竞争和无生产菌参与竞争的情况。（4）根据“（3）的结果”推算大致的染菌时间，为从操作和设备等方面寻找染菌的根源圈定一个大致的范围。染菌的防止需要细心、耐心，需要全面的知识和综合判断的能力，需要丰富的经验和对生产环境的熟悉。切记：在制服染菌时不能想当然！2、引起染菌的可能途径与原因：a：种子制备；b：接种和移种；c：培养基灭菌不彻底d： 设备与管道灭菌不彻底；e：空气过滤系统；f：设备损坏或不严密；g：补料过程；h：发酵液逃液；i：人为操作失误；j：操作者的观念、知识及技术，企业的管理措施；k：配套工业相关技术的发展等。染 菌 原 因概率染 菌 原 因概率种子被污染0.08培养基灭菌不彻底0.09接（移）种时罐压为零0.01设备与管道灭菌不彻底0.03空气过滤系统造成染菌0.18补料过程造成染菌0.05发酵液逃液0.02设备损坏或不严密0.26人为操作失误0.09原因不明0.19三、染菌的防止1、种子染菌时，由于染菌的时间不同（早期为020小时、中期为3050小时、后期为6078小时），种类不同（霉菌、酵母、放线菌、球菌、杆菌、噬菌体），原因也不同。接种操作（冷冻管、甘油管、沙土管、母斜面、单菌落挑取）；无菌室的环境（包括超净工作台）及其灭菌方法；无菌室的通气要求（冷冻）；种子培养环境不可忽视。种子带菌时的一个易被忽视的染菌媒介螨 关于螨的描述：蛛形纲，螨目。体小，头、胸、腹合成躯体，分节不明显，在躯体前端有突出的口器，称“颚体”。角皮极薄，腹面有足四对。分布遍及地下、地上、高山、水中和生物体内外，分布及其广泛。繁殖快、数量多。不同的种类有不同的特性，如叶螨（亦称红蜘蛛）、粉螨能危害农作物、果树及仓库贮粮；疥螨、毛囊螨和肺螨能寄生人和动物体内外；革螨、恙螨能传播多种疾病；尘螨可引起人体过敏性疾病。螨喜食微生物的孢子，能穿过斜面试管的棉塞而将杂菌带到斜面中，引起斜面种子带杂菌。螨甚至可以进入用石蜡熔封的斜面试管。如何发现螨引起的污染：偶尔可见有螨爬过的痕迹。对螨污染事故的处理：废弃所有的斜面。最好将菌种制成冷冻牛奶管保藏。防止螨入侵的措施：低温法。2、接种管道的检查及无菌清洁的保证（关键是严格按操作程序工作）。3、发酵罐、补料罐、各路管道、冷却系统、阀门轴封等，只要设计合理，定期检查，规范操作，一般是容易控制的比较安全的部分。但要特别注意因长期使用而造成的渗漏，一般不容易被检查得出来，需要特别细心和经验。4、空气系统的无菌防止，依靠相关技术的进步与产品开发，如膜过滤器和无油空压机等。5、培养基和设备的蒸汽灭菌，完全依靠消毒工的责任心和工作经验。需要特别注意染菌罐的处理，如何清洗，如何强化灭菌等。培养基的配制也要讲究技巧（或称顺序）。其他制服染菌是操作者和管理者共同的责任，更新操作者的观念和知识、提高操作者的技术是首选的一个措施。坚强管理，建立必要的记录与检查制度是制服染菌的根本保证。1、灭菌与消毒的区别（对数残留定律 -dN/dt=Kn， t=2.303/k * log（No/Nt）、湿热灭死细菌芽孢时的温度与时间的关系（121，15min）、常用化学药品的特性及其使用范围如甲醛、过氧乙酸、新洁尔灭等）；2、空气除菌的基本概念及所用