应用现代生物技术开展辣椒新品种技术研究与示范可行性研究报告

- - 应用现代生物技术 开展 辣椒 新品种 技术研究与示范 可行性研究报告 - - 前言 我国是农业大国，调整农业产业结构，增加农民收入，是国家切实关心农民利益的行动之一。我国农业比较落后，其主要原因是优良品种少，作为提高农业效益的品种改良措施不足。利用传统的杂交育种进行品种改良周期长，见效慢，解决这一问题最有效的方法是利用现代生物工程技术，加快品种改良速度， 随着基因工程、细胞工程、酶工程在农业生产上应用不断扩展， 基因技术已得到广泛应用，成效显著。生物技术在农业生产上的推广和应用，对人类的生产和生活产生了极大的影响。 农 业生物技术作为生物技术的重要应用领域之一，已经成为农业科技革命的强大推动力。农业生物技术不仅加快了传统农业向现代农业的转变进程，在保障食物安全、保护环境、寻求替代能源等方面更是发挥着越来越大的作用。加速生物产业发展已经成为世界许多国家经济社会发展的战略重点。目前，农业生物技术领域是我国高新技术领域与国外差距最小的领域。我国转基因稻和转基因棉花的研究和开发已达到世界前沿水平，在农业生物技术研究的整体实力上处于发展中国家领先地位。来自自然界中动植物的基因是现代生物技术产业的基础，丰富的生物资源优势带动生物技术的 快速发展。我国农业生物技术企业约有 200家，正在研究的转基因植物种类达到 47种，涉及各类基因 103 个。我国的杂交水稻技术现已推广到 20多个国家，转基因抗虫棉花面积已占棉花总面积的 40%，转基因水稻、玉米、大豆、蔬菜等 400多个品种进入安全性评价阶- - 段，并有许多品种具备了产业化条件。 经过近年来的快速发展，我国在农业生物技术领域已经取得了一系列成就。在应用基因工程技术方面，开展了大豆、水稻、小麦、马铃薯和甜菜等作物转基因技术研究，获得了一批转基因植株。专家分析认为，生物技术是未来农业经济和农产品竞争的重要领域，加快自主创新推动农业生物技术产业化进程，对于促进我国传统农业向现代农业转变、加快建设社会主义新农村具有重大意义。 一、 项目的目的、意义和必要性 辣椒原产于南美和墨西哥等中美洲热带地区及西印度群岛，在明朝末年传入我国，现成为人们喜爱的重要的辛香食料。在甘肃、陕西、湖南、四川、贵州、 *等省区栽培甚广，资源丰富。 辣椒是 *乃至 *州、 *省的一大特色产业。 2007年 *州内 *、 *、*、 *四县种植面积超过 60万亩，其中 *县种植面积达到 20.2万亩，总产量 2315万公斤，覆盖农户 5.3万户、 20多万人， 种植 *辣椒已经成为广大农民增收的主要经济来源。 辣椒由规模种植到实现产业化还有较大差距。 主要障碍有两个方面：一是辣椒种性退化，严重影响规模效益。由于长期种植种性逐渐退化，加之品种混杂更加剧退化，抗疫病和病毒病的能力较差，亩产仅 100公斤 左右。 辣椒个体大小、色泽差异明显，严重影响了外观质量，出口容易受阻，加之没有在食品生产上形成知名品牌，体现不出规模效益。 二是缺乏高辣椒素和辣椒红色素含量的加工专用型品种，是辣椒产业效益最终不高的关键。 辣椒中所含有的 辣椒红色素是一种优良的天然食用色素，已被 FAO、美、英、日、中 等国际组织和国家定为无限制性使- - 用的天然食品添加剂，其国际市场非常紧俏，市场前景广阔；而辣椒素则在食品工业、医学和军事上都具有广泛的用途，市场前景广阔。但由于 *辣椒其 辣椒素含量平均仅为 0.24%，约相当于 4万“史高维尔”辣度国际单位，色素仅有 10个色价左右， 致使企业加工微利，严重影响了辣椒产业的发展和效益提升。 辣椒种植业规模发展的同时，加工流通企业已得到不断发展，以 *天然辣素有限公司为代表的深加工企业，在省科技厅的支持下通过省院省校合作引进辣椒红色素和辣椒素提取技术，形成规模生产，年生产能力达到 240吨，由于采取三种溶剂同时萃取，一次投料可以同时获得辣椒素和辣椒红色素两个产品，其辣椒素和辣椒红色素的提取工艺技术先进，该公司是 *省首家获得国家颁发的食品添加剂工业品生产许可证的企业， 并通过了 ISO9001： 2000质量管理体系认证、食品安全体系 HACCP的认证，也是国内食品添加剂行业第二家通过以上认证的企业，现已成为国内食品添加剂行业的知名企业，所生产产品辣椒素和辣椒红色素品质优良，一直处于供不应求状态 。 辣椒中的辣味成分为辣椒素类物质，是具有辛辣剌激性的活血管香草胺合成的衍生物 , 主要成分之一为辣椒素 。辣椒中的主要辣味成分 辣椒素 (Capsaicin)，又名辣椒碱、辣椒辣素，最早由 Thres(1876)从辣椒果实中分离出来，并为它命名。其化学名称为 8-甲基 -6-癸烯香草基胺，分子式为 C18H27NO3, 是香草基胺的酰胺衍 生 物 ， 其 化 学 结 构 式 为 ：H3CO(HO)-C6H3-CH2-NH-CO-(CH2)4CH=CHCH(CH3)2。此后又有一些辣椒- - 素的同系物从辣椒果实中被发现，它们统称为辣椒素类物质。迄今为止，已发现辣椒素同系物约十四种以上，其同系物结构类似辣椒素，为： H3CO(HO)-C6H3-CH2-NH-CO-R，相互之间只是 R基团有所不同。其中辣椒素 (75%)辣味最强 (郭建明等， 1998)，与二氢辣椒素(Dihydrocapsaicin)共占辣椒所含辣味物质的 90%以上，其余同系物仅占少量 (Constant et al,1996)。最近在甜椒果实中发现两种无辣味的类辣椒素物质辣椒素酯 (Capsiate) 和二氢辣椒素(Dihydrocapsiate)，研究者推测是辣椒素类物质合成的前体物，但还需要进一步研究证实（ Kenji Kobata,et al,1998）。 辣椒素纯品呈单斜长方形片状无色结晶 ，熔点 65 ，沸点 65220，易溶于乙醇、乙醚、苯以及氯仿，微溶于二硫化碳。辣椒素可被水解为香草基胺和癸烯酸，因其具有酚羟基而呈弱酸性，并可以与斐林试剂 (Folin)发生呈色反应。八十年代初， Iwai(1979)等人利用同位素示踪技术、电子密度扫描显微镜等先进技术对辣椒素的形成做了详细研究，认为辣椒素主要在果实胎座表皮细胞的液泡中形成积累，并通过子房隔膜运输到果肉表皮细胞的液泡中积累。同时 Jinap(1992)研究认为，辣椒素在果实中的含量极不均匀，胎座中含量最高，果肉次之，种子中含量最低。而且不同辣 椒品种的总辣椒素含量变化非常大，大多数品种辣椒鲜果中的辣椒素含量在 0.21.0%之间。 辣椒素是由香草基胺和 C9支链脂肪酸两部分组成。香草基胺部分是由芳香族氨基酸苯丙氨酸衍生而来，支链脂肪酸部分则是由缬氨酸衍生而来。由于辣椒素合成的酚类前体物：对香豆酸- - (Coumaricacid)、苯丙氨酸、咖啡酸 (Caffic acid)、 3-甲氧基 -4-羟基肉桂酸 (Ferulic)、香草醛 (Vanillin)等同时是蛋白质、生物碱、类黄酮以及木质素的合成前体物 (Hall and Yeoman,1991)，因此辣椒素的生 物合成与其它生物合成途径存在着竞争共同前体的问题，所以如能通过代谢调节或基因调控最大限度地促进辣椒素的生物合成，则对辣椒素的生产具有重大意义。 Fujiwake(1980)研究认为，辣椒素合成酶是辣椒素合成中的关键酶主要定位于果实胎座表皮细胞的液泡膜上，同时是辣椒素合成过程中最后一个酶，也是关键性的限速酶，因此如能对辣椒素合成酶进行基因克隆，促使其在果实和细胞中充分表达，然后筛选出高辣椒素的突变体，培育出转基因高辣椒素的辣椒品种等将成为可能，这也会大大促进辣椒素的生产，满足社会需求。 辣椒素的降解主要是通过辣 椒果实中过氧化酶 (Peroxidase)氧化而完成的。 Bernal等 (1993)研究发现，辣椒素在过氧化物酶(POD)的作用下，转化为其它次生物质，降低辣椒果实中辣椒素的含量。他进一步研究发现过氧化物酶，特别是碱性过氧化酶同工酶B6与辣椒素共同定位于胎座表皮细胞的液泡中，它能强烈氧化辣椒素及其酚类前体物。 Bernal等 (1995)用凝胶渗透层析柱分析了过氧化物酶氧化辣椒素的产物特性。结果表明：辣椒素的氧化产物主要有 5， 5-二辣椒素聚合体 (5， 5-dicapsaicin)、 4 -0-5二辣椒素酯 (4 -0-5 dicapsinether)以及一些高度聚合的脱氢产物(Bernal and Ros Barcelo,1996)。这些氧化产物都具有类木质素(Lignin-like)特性，说明在辣椒素的降解代谢中存在着氧化竞争- - 库，辣椒素合成的酚类前体物于辣椒素竞争氧化产生了类木质素物质，用于细胞壁的构成。 辣椒素可以促进肾上腺分泌儿茶酚胺并显著抑制蜡性芽孢杆菌及枯草杆菌，具有抗病菌、抗肿瘤和镇痛消炎作用，还可作为健胃剂，促进食欲、改善消化等生物学功能（狄云等， 2000）。动物采食后，能促进胃液分泌、增强食欲，促进血液 循环，提高机体的抗病能力，还有驱虫、发汗等功效，可用于动物的腹泻、炎症等疾病防治 (郭建明等， 1998)。郑春泉等 (2000) 还研究发现，应用辣椒素局部治疗有抑制或延缓鼻息肉术后复发的作用。因此，辣椒素在食品餐饮、畜禽饲料与医疗药品等方面具有较高的应用价值。 辣椒素广泛应用于食品、医学、军事和环保等领域， 保守估计，目前世界上对辣椒素的市场需求量已超过 4000吨 /年，而世界总生产能力不足 2000吨，需求缺口高达 50 ；而 辣椒红色素作为 一种优良的天然食用色素广泛运用于人们生活的各个领域，目前在发达国家已限制使用 甚至明令不得使用，其国际市场非常紧俏，市场前景广阔， 预计全世界对 辣椒红色素 的需求已达 3000吨 /年。 色素分为天然色素和合成色素两类。合成色素长期食用将影响人体健康甚至致癌，而天然色素是以自然界的各种无毒植物为原料，用提取、分离、精制的方法获得，它无毒、无害，含有各种维生素和氨基酸，是我国色素工业发展的必然趋势。而辣椒红色素则是国际上公认的最安全、用途最广的天然食用色素。辣椒素和辣椒红色素是以辣椒为原料 ,运用溶剂萃取法提取纯化而得的产品，是具有广阔市场前景的绿色产品。 - - 根据农业生物技术应用国际服务组织（ ISAAA）在北京发布的全球转基因作物概况报告，转基因生物育种已成为最具活力的一项现代农业技术，其发展势头已不可逆转。基因是一切生物细胞内决定遗传特性的最小单位。在原有品种基础上对遗传基因进行改造和转移，基因工程能使育种过程更为精确、更有预见性、效率更高，因而更具发展潜力，现已成为新品种培育的重要途径。 目前国内外均 缺乏 辣椒红色素和辣椒素含量高的 专用型辣椒加工品种，尤其是缺乏两素含量都高的品种，其选育种工作也 一直是国内外该领域中一项十分薄弱的环节，因而难以通过一般育种方法解决解决这个问题。 拟 应用现代生物技术定向 培育辣椒加工专用新品种，解决好辣椒原料种植问题，满足企业加工需求，做大做强辣椒产业。 为适应市场要求，提高辣椒产业效益，充分利用 *丰富的辣椒资源， *天然辣素有限公司和项目合作单位、项目参与单位提出应用现代生物技术 加快 辣椒产业 化进程 技术研究与示范 项目。项目的实施可以促进辣椒种植业高效发展，辣椒初加工向深加工发展，延长辣椒产业链，加快产业化进程。项目建设紧紧依托当地资源，发展特色经济、开发特色农业，符合 *省委、省政府提出的“绿色经济强省”思路和国家加快现代农业产业化建设要求，其项目建设具有区域性经 济和社会发展的必要性。 二、项目主要申请单位概况 （一） *天然辣素有限 *天然辣素有限公司 成立于 2003 年，公司位于 *县 *镇，- - 占地面积 45亩，注册资金 500万元，总资产 3700万元。拥有职工队伍 95人，其中：高级职称 4 人，中级职称 9 人。公司拥有自主知识产权的提取工艺及配方。主要产品有：辣椒碱、辣椒精、红辣素、辣椒红色素等。是国内第一家以生产辣素为主的高科技企业，是 *省首家、国内第二家食品添加剂行业获得国家颁发的食品添加剂工业品生产许可证的企业，已通过 ISO9001： 2000 质量管理体系认证 、食品安全体系 HACCP EC 01 的认证。 目前已形成辣椒素300吨，辣椒红色素 450吨生产能力。 截止 2007年 11月底，公司已生产销售辣椒辣素和红色素 148 吨 ,产品符合 GB10783-1996 标准、实现产值 6000 余万元、税利 151.2万元。公司地址： *县 *镇。法人代表 *。联系电话。 （二） *市农业科学院生物技术研究所植物基因研究室 主要研究方向为水稻功能基因组、基因工程、植物转基因、酶的定向分子进化和产业化。近五年承担包括国家 863 项目、国家植物转基因专项、国家科技部中小企业创新基金、 *市科委 重大、*市农委重点攻关等 10多项科研项目。 近两年来在基因改组及体外定向分子进化研究方面取得了显著成绩， 包括 比活提高 5 倍以上的 -葡萄糖苷酸酶 (GUS)突变基因；耐 85 高温的 -葡萄糖苷酸酶突变基因；比活提高10 倍左右的 XylE 基因；超级阻遏的 CI 和 LacI 阻遏蛋白突变基因（可用于构建无泄漏的原核高效表达系统）；比活提高 60 倍以上的大肠杆菌 lacZ 基因；不依赖于乙酰丁香酮- - 诱导的根癌农杆菌 VirG 突变基因；比活提高 30 倍以上，且耐 90 高温的新型 3-植酸酶基因等。同时在酸性、耐高温植酸酶的产业化方面取得了 突出成绩。该项目的主要研究内容包括：植酸酶基因的 DNA shuffling 突变及体外定向分子进化；突变植酸酶基因高效分泌表达系统研究；植酸酶工程菌株的发酵优化；发酵后的膜分离技术研究；植酸酶的超滤浓缩技术研究；植酸酶的制剂技术研究；基因工程植酸酶的动物饲养试验、毒性试验及我国农业部转基因生物安全性评价。 与目前国内外同类研究或技术成果综合比较，本项目在植 酸酶基因定向分子进化和发酵工程技术方面都处于国际领先 水平。该项目研发的耐高温植酸酶开拓了植酸酶应用的新领域，首次使植酸酶可以用作市场十分广阔的颗粒饲料添加剂， 植酸酶用于颗粒饲料添加剂每年全球的市场潜力在 27亿人民币左右。该项目发表了 4 篇 SCI 论文， 申报了四项基因发明专利及一项发酵工程有关的发明专利，通过评审被认定为 *市高新技术项目。 最近两年中还和华东理工大学合作开展了不同枯草杆菌菌株核苷合成中关键酶基因核苷酸序列比较、 pur操纵子和阻遏蛋白相互作用及代谢工程研究，并取得了显著成绩。研究得出肌、鸟苷生产菌株高产核苷可能机理包括：腺苷合成关键酶 purA基因的移码突变造成了腺苷合成的缺陷；肌、鸟苷生产菌株 pur 操纵子控制的 12个编码酶的基因发生了突变，从而造成其中 4 个酶的氨基酸序列发生了改变，可能提高了酶的活性或部分解除了产物对酶- - 活的抑制作用；肌、鸟苷生产菌株中的 purR 阻遏蛋白基因和 pur操纵子序列都发生了改变，从而使 purR阻遏蛋白对相应 pur操纵子的阻遏作用显著降低，从而加大了 HMP 途径的代谢通量。目前已通过对 pur 操纵子 12 关键酶基因的改造、 GuaB 和 purR 基因的缺失，构成了肌、鸟苷产量比生产菌株提高 30%左右的基因工程菌株，该研究成果可给企业产生巨大的经济效益。 此外 在 水稻转录因子功能基因组的研究中也取得了阶段性的研究结果，已通过“酵母单杂交体系”从水稻 中分离克隆了 140 多个与生长、发育、胁迫调控等有关的重要转录因子基因，并都已在Genbank 登陆（其中最近两年分离了 80 多个），目前正重点开展10多个转录因子基因的功能研究。 在植物转基因研究方面，已通过根癌农杆菌 virG结合域的突变及和 VP16强基因激活功能域的串联构建了高活性的 virG基因，并经根癌农杆菌染色体整合构建了超毒力的根癌农杆菌菌株；此外还构建了“根癌农杆菌自杀体系”、适合于多基因同时表达的植物双元载体、经 Cre/loxP 系统消除 Marker 的植物转基因体系、可用于高效克隆植物顺式元件的植物双 元载体等。已获得了 10多种植物的转基因植株。包括：抗虫、抗冻、增加钾吸收效率的转基因烟草、矮化的苹果砧木 巴拉海棠、转铁载体及铁蛋白基因的苹果、转人乙肝表面抗原大蛋白 S1S2S 基因的番茄及苹果、耐贮的转基因番茄、抗虫的转基因甘蓝、表达“耐高温植酸酶”及“人表皮生长因子”的转基因油菜、转分解硫甙基因的油菜、转抗逆转录因子及昆虫抗冻肽基因的小白菜、转多基因的水稻、转- - 抗虫基因的毛白杨等。已在国内外学术期刊发表学报级论文 120多篇，其中 SCI 论文 30 多篇。目前 4 项转基因生物 (一项转基因油菜、一项转基因番茄、两项工程 微生物 ) 申报了我国农业部转基因生物安全性评审，其中一项进入中间试验阶段，一项进入环境释放阶段。两项完成生产试验阶段，并获得了我国农业部颁发的中华人民共和国农业转基因生物安全证书（生产应用）。认定并通过了 2 项 *市高新技术项目。已获得三项国家基因发明专利，另外二项国家发明专利已进入实审阶段。已经具备的实验条件 。共有 600 万左右的仪器设备，包括：冷冻高速离心机、超速离心机、 HPLC、质谱仪、核酸成像系统、 PCR仪、核酸杂交炉、 DNA合成仪、 PE公司 377 型全自动 DNA 测序仪、中试蛋白纯化系统、瑞士植物细胞培 养罐、 B.Braun 中、小试微生物发酵罐、 NBS进口摇床、超低温冰箱、自动化光照培养箱、基因枪、电击仪、超声粉碎仪、 Beckman 双波长分光光度仪、荧光光度仪、液体闪烁测定仪、 Olympus倒置显微镜、荧光显微镜、全波长酶标仪等设备。此外，拥有良好的植物组织培养房间、设备、用于转基因植物种植的 500m2的温室。另外 *植物生理、生态研究所的人工气候室可保障水稻的周年种植，有利于全年水稻转基因工作及抗病性鉴定的进行。 *，男，汉族， *年 5月出生，江苏省武进县人，博士， *市农业科学院研究员， *市农业 科学院生物技术研究所副所长，*市农业遗传育种重点实验室副主任， *交通大学兼职研究员，南京农业大学兼职博导。主攻水稻非生物胁迫抗性有关转录因子- - 调控网络及基因体外定向分子进化和产业化。 1986 年毕业于南京农业大学，获学士学位。 1989年毕业于中科院 *植物生理研究所，获硕士学位。 1998 年毕业于中科院 *植物生理研究所国家植物分子遗传重点实验室，获博士学位。自 1991年以来，主要从事水稻功能基因组、基因工程、植物转基因、酶的定向分子进化和产业化有关的研究工作。期间主持和主研了包括国家 863 项目、国家植物转基 因专项、国家科技部中小企业创新基金、 *市科委重大、*市农委重点攻关等 15 项科研项目，目前已完成了 11 项。取得鉴定科技成果 8 项，获得市级以上成果 5 项，其中 *市科技进步一等奖 3 项，分别为第一完成人（ 2003 年），第 6 完成人（ 1993年）和第 13完成人（ 2003年）。作为第一主持完成的科研项目高比活植酸酶基因的获得及耐高温植酸酶的生产获得 2003年度 *市科技进步一等奖，并实现成果转让，转化收益 1200 万元。此外，还作为第一主持人分别获得 *市科技进步二等奖（ 2006 年）和三等奖（ 2005年）各一项，作为第一主持的“耐高温 -葡萄糖苷酸酶基因及其获得方法”项目 获 2005年度“ *市优秀发明选拔赛一等奖”。 1994 年，被共青团中央、国家科委、中国科协评为“全国青年科技标兵”； 1995 年，被共青团 *市委评为“ *市新长征突击手”。 2004年，被 *市科协评为第二届“ *市青年科技英才”。 2005年，获第八届“明治乳业生命科学奖”优秀奖。 2006 年，被 *市发明家协会评为“ *市第二届优秀发明人”，同年被 *市科学技术委员会评为“优秀学科带头人” ； 2004-2006 年度，被 *市总工会评为“ *市劳动模范”； 2007年度，被 *市科学技术委员会评为“ *- - 市科技领军人才”，同年中国发明协会开展了“第三届发明创业奖”评选活动，获“发明创业奖”。 2008 年被国家人事部、科技部、教育部等 7 个部委评选为“新世纪百千万人才”。目前已在国际Genbank 登陆新基因 200 多个；申报了 15 项发明专利，目前授权发明专利 4 项，其它处于专利实审阶段； 4 项转基因生物 (一项转基因油菜、一项转基因番茄、两项工程微生物 )申报了我国农业部转基因生物安全性评审，其中一项通过中间试验， 一项进入环境释放，两项完成生产试验，并获得了生产应用的安全证书。已发表论文 130余篇，其中在 Nature Protocols， FEMS Microbiol Rev， Nucleic Acids Research， Plant J， Biotechnology Advances， Anal Biochem , Eur J Biochem , Critical Reviews in Plant sciences等刊物发表 SCI 论文 30 多篇，累计 SCI 影响因子 80左右，文章引用约 500次。培养硕、 博士研究生、科技骨干及技术人员 60多名，以上人员正在生物工程研发领域发挥重要作用。 （三） *省农业科学院 *省农业科学院是 *省多学科、综合性农业科研机构。下属15 个研究所，分布在全省的七个地、州、市。现有在职职工 1600多人，专业技术人员 960 人，其中高级专业技术人员 220 多人，在职和在读博士 20人，在职在读硕士 160多人。“七五”以来，承担国家和省的各类科研项目 520多项；收集保存农作物种质资源 2.4万份，育成审定农作物新品种 155 个，占全省省级审定品种的 45%- - 以上；获国家和省级科技成果奖 260 项； 发表论文 1000 余篇。累积组织实施科技成果示范推广项目 200多项，累积面积 1.5亿多亩，新增产值 60 多亿元。 *省农业科学院与第一项目申请单位在辣椒育种方面已开展了三年合作，在辣椒育种方面取得一定进展。 （四） *县科学技术局 *县科学技术局是 *县人民政府专设科技管理工作的综合管理部门，现有干部职工 11人，其中：大专以上文化程度 6 人，取得初中级专业技术职称的 5人。在科技管理工作中大胆创新，全县的科技事业有较快发展。近年来，先后组织实施了省科技厅立项支持的“依靠科技推动农业产业结构调整示范”等四个省级项目 ，取得了良好的经济效益和社会效益。积极组织县级有关部门开展试验、示范工作，并组织协调全县各相关专业技术部门，开展科技培训等工作，组织推荐了多项农副产品生产加工新技术运用成果，为加快科技创新体系建设，促进 *农业化发展服务，对县域经济的发展起到了积极的促进作用。 （五） *县农业局 现有干部职工 300 多人，其中：高级职称 3 人，中级职称77 人，初级职称 213 人，有土肥、植保、经作、种子、农机等专业推广队伍，全县 12 个乡（镇）有健全的农业技术推广机构和熟炼的技术人员。 全局具有从事农作物新品种引进示范推广工作 40多 年之久经验，技术人员具有丰富的示范推广经验， 其 *辣椒早 春地膜覆盖 栽培和 间套种植栽培有一整套成熟技术经验 ，从事辣椒新- - 品种、新技术引进示范推广工作 经验丰富 。 三、 项目现有工作基础和支撑条件 *县位于 *省东南部， *州中西部，东与本州的 *、西畴县接壤，南与 *县毗邻，北与 *县相连，西界与 *州 *市和蒙 *县相交，东西长 107公里，南北宽 70 公里，全县总面积 3826.57 平方公里，山地面积占 56%，丘陵面积占 29%，盆地面积占 15%。县城所在地 *镇距州府 *开化镇 35 公里，距省会昆明 320 公里。国道323线由西向东横贯全境，是 *通往广西、广东省的主要通道。新建的锁龙寺 罗村口高速公路与国道 323线平行贯穿全境，已建成投入使用的 *州民用机场距县城仅有 5 公里，为 *的经济社会发展构建了较好的交通网络。 辣椒是 *县的主要特色经济作物之一，“八五”以来被列为支柱产业， 2007 年种植面积达到 20.2 万亩，总产量 2315 万公斤，覆盖农户 5.3 万户、 20 多万人。辣椒高产栽培技术推广效果显著，通过实施“ *县依靠科技推动辣椒产业示范”项目以来，全县粮经比例由 2000年的 79.3： 20.7 调整到 2007年的 56： 44，经济作物种植比例提高了 4个百分点，进一步优化了农业产业结构。市场体系日趋完善，“九五”期间相继建成了岔路口、 *、 *等具有一定规模的专业交易市场，稼依辣椒城是西南地区最大的辣椒交易市场和集散地。全县以辣椒为原料进行生产、加工、贸易的企业、营销大户共 157 户，年交易量在 10万吨以上。 *天然辣素有限公司，于 2005年 10月建成投入生产，建- - 设规模设计为日产 5%的辣椒素 1吨、 100个色价的辣椒红色素 1.5吨的生产能力，年消耗干辣椒 8000 吨以上，产值 1 亿元。同时引进青岛大学开发的辣椒素发明专利技术（ 名称：辣椒色素和辣素的提取方法，专利号： ZL891052712）进行应用，获得了成功。公司为进一步拓展市场空间，提高产品市场竞争力，于 2005 年 5 月通过了 ISO9001体系认证，并在此基础上，精心筹备、组织申报， 2006年 9 月取得国际食品安全管理体系（ HACCH）认证，为该公司产品打入国际市场奠定良好基础。截止 2007年 11月底，公司已生产销售辣椒辣素和红色素 148 吨 ,产品符合 GB10783-1996 标准、实现产值 6000 余万元、税利 151.2 万元。该公司拥有较为先进的辣椒素和辣椒红色素提取技术，目前属国内 领先水平。 四、项目预期目标、考核指标，预期提交的成果 （一）预期目标 1、新品种培育。 引进 印度 高辣素辣椒品种魔鬼辣椒、 *德宏象鼻涮涮辣为辣椒素基因为基因导入材料，以 *辣椒和美国高色素品种铁皮椒为基本材料，培育高辣椒素、辣椒红色素含量辣椒加工型专用新品种 2 个； 2、示范推广。采用育成辣椒新品种示范推广 10万亩，其中示范 1000亩，单位产量 100 公斤； 3、产品加工。年生产辣椒素 600吨、辣椒红色素 500吨。 （二）考核指标和预期成效 1、完成 2个新品种培育，辣椒素 3%以上 ，辣椒红色素含量达- - 到 15个色价以 上， 色调 0.997以上，种子含量 30以下，产量不低于对照 *辣椒，单位亩产量目标 100公斤 以上 ； 2、制定 标准化栽培技术， 新品种示范推广 10万亩，生产高辣椒素、辣椒红色素含量辣椒 1万吨； 3、 辣椒产品 考核指标 为 产品质量符合 GB10783-1996标准，溶剂损耗降低到 20公斤 /吨， 生产辣椒素 2500吨，辣椒红色素 500吨，产值 7亿元， 税 利 3亿元。 五、项目主要研究开发内容、技术路线和保障措施 （一）项目主要研究开发内容 通过项目实施，应用基因工程技术 培育高辣椒素和高辣椒红色素含量的辣椒新品种， 制定标准化栽培 技术标准，完善辣椒素和辣椒红色素生产工艺等的辣椒产业化开发关键技术方面，实现技术的集成示范推广，实现辣椒产业化，提高科技进步对辣椒产业的支撑作用，提升我省辣椒产业的整体水平和产品在国内外市场的竞争力，使辣椒产业实现优质高效目标，综合效益显著。 1、辣椒素转基因技术研究 （ 1） 辣椒中辣椒素合成关键酶（ PAL、 4CL、 HCT、 Ca4H、 C3H、BCAT、 KAS、 COMT、 ACS 和 CS）基因的克隆 ； 克隆辣椒果实特异启动子 CaPG。 （ 2） 分别构建由 CaPG控制辣椒素合成关键酶基因的表达的单元，并插入植物双元载体。 （ 3） 分别通过电击转化技术将双元载体导入根癌农杆菌 LBA4404。 - - （ 4） 通过根癌农杆菌遗传转化方法，分别将以上植物双元载体导入辣椒，分别获得 10株以上独立转化植株。 （ 5） 对转基因辣椒进行 GUS染色、 PCR扩增及分子杂交鉴定。 （ 6） 转基因辣椒果实中辣椒素含量测定。 （ 7） 对转基因辣椒的农艺性状、产量、抗逆性和品质的综合分析。 （ 8） 转基因材料的自交繁殖及后代遗传稳定性研究 ，同时对后代植株进行综合农艺形状和果实中辣椒素含量进行分析测定； 最终获得遗传稳定的转基因辣椒株系。 2、标准化栽培技术研究 （ 1） 开 展 *省辣椒主产区适应性研究， 确定适应的密度、播种期、施肥、病虫害防治等高产栽培技术，稳定和提高辣椒素、辣椒红色素含量栽培措施研究。 （ 2）开展种植环境研究，划定加工专用型辣椒栽培适宜区域。 3、辣椒产品 生产 工艺研究 （ 1）完善三种溶剂同时萃取辣素及辣椒红色素的技术， 改进工艺流程， 主要研究溶剂的类型和配比、压力、温度等，减少溶剂损耗，降低生产成本。 （ 2）开展辣椒素脱糖、辣椒红色素脱胶等精制技术研究，提高产品质量。 （二）技术路线 通过 专用型辣椒新品种培育、制定标准化栽培技术、生产工艺提高研究实现技术集成， 将熟化的研究成果产业化应用，生产优质辣椒- - 素和辣椒红色素产品。 （三）保障措施 1、建立项目责任制。本项目由 *天然辣素有限公司 承担，项目承担单位为项目主持人，对项目负总责， 负责项目总体目标和研究内容的制定 ，组织项目的实施、检查， 制定课题合同和制定经费预算，划拨研究经费。 2、实行项目课题合同制。 *农业科学研究院、 *省 农业科学院、 *县科学技术局、 *县农业局为项目参与单位。项目参与单位组织 项目课题组与项目主持人签订课题合同，实行合同制管理， 参与单位向项目主持人负责，完成课题攻关目标、组织实施课题任务 。 *市农业科学院生物技术研究所植物基因研究室 负责加工专用型辣椒优良新 品种培育 课题； *省 农业科学院负责标准化栽培技术研究课题； *县科学技术局项目组织、检查、协调和初步验收； *县农业局负责新品种试验种植、示范和推广 ； *天然辣素有限公司负责 辣椒产品 生产 工艺研究；研究成果的集成示范与应用。 3、组织项目专家组。聘请有关专家组成项目专家组，主要帮助项目决策、课题目标任务确定，项目管理指导等问题。 4、经费管理。项目经费专款专用，课题合同签订后 10天内，拨给合同规定经费的 1/3，其 2/3的经费与课题考核 挂钩，按进度和完成任务情况拨付，完成全部课题目标和任务的全额拨付并对课题完成人给予项目经费 10%的奖励。 5、目标任务考核。考核组由项目主持人组织，专家组和科技- - 局负责人组成。实行季度定期检查和年终检查，按完成目标任务的进度和工作量确定考核分值，对未能按计划完成课题合同目标任务的，主持单位有权延迟直至停止对该课题的经费拨款，并追究其相应的责任。若因不可抗拒的自然灾害原因造成无法完成合同任务的，由项目课题组提出书面申请并说明情况，须有当地权威机构证明，并报省科技厅申请延期，酌情考虑下一年度的经费拨付。 6、项目 成果管理。项目研究成果由项目主持人统一组织向有关部门申报，课题完成人为第一人，协作单位按贡献大小排名。项目实施形成的自主知识产权由项目主持人享有 60%，其余 40%为课题完成单位享有。 六、项目进度计划 本项目计划 5年时间 完成。 2008年 1月 2008 年 12月完成基因导入材料引入和收集，测定辣椒素、辣椒红色素含量。 2009年 1月 2009 年 12月开展转基因技术研究 。 2010年 1月 2010 年 12月开展试验种植， 进行转基因辣椒果实中辣椒素、辣椒红色素不含量测定； 在热区进行加代繁殖； 完善同时萃取辣素及辣椒红 色素的技术。 2011年 1月 2011 年 12月开展示范种植， 对转基因辣椒的农艺性状、产量、抗逆性和品质的综合分析， 拟订辣椒高产栽培技术方案 ；转基因材料的自交繁殖及后代遗传稳定性研究，同时对后代植株进行综合农艺形状和果实中辣椒素含量进行分析测定；继续 在热区进- - 行加代繁殖。 2012年 1月 2012 年 12月 开展标准化栽培技术研究 ； 开展辣椒素脱糖、辣椒红色素脱胶等精制技术研究；进行 项目总结，申请项目验收。 七、 项目经费筹措方案 （一）经费预算 本项目经费预算 总额 2100万元。其中辣椒基因素材引进 100万元，培育高辣 椒素、辣椒红色素新品种 400万元，试验、示范推广 1000万元，产品加工技术研究 500万元。 （二）资金筹措方案 经费筹措 2100万元。其中企业自筹 700万元，银行贷款 800万元，申请 *省科学技术厅支持 600万元。其中国际合作计划 100万元；省院省校合作计划 400万元；农村科技创新 工程 100 万元。 八、 项目经济社会效益分析 1经济效益分析 （ 1）种植效益分析 本项目新品种和新技术累计示范推广 10 万亩，产量与对照 *辣椒相等，按单位产量 100公斤 /亩计算，每公斤价格较 *辣椒 10元 /公斤上浮 50%， 10万亩 总产量为 100 万公斤，总产值为 15000 万元。由于种植加工专用型辣椒，亩产值较对照 *辣椒增值 500 元，新增产值 5000万元，即种植环节农民因科技进步多获取效益 5000万元。 （ 2）加工效益分析 - - 原材料、动力价格以及消耗指标为辣椒干 /吨生产辣椒粉 0.6 吨，辣椒粉计 2.5 万元 /吨；每吨辣椒粉生产产品消耗指标为溶剂（正己烷） 25公斤，酒精 25公斤，煤 800公斤，水 1m3，电 600kWH。 制造成本中的制造费用主要包括折旧费、修理费、低值易耗品等。固定资产折旧采用平均年限法计算（按 10年期限）。经计算项目年折旧费 为 286.7万元。 确定的经计算每生产 1吨辣椒素和 480公斤 辣椒红色素的直接成本为 12.92 万元；根据以上两项，加上其他成本费用，每生产一吨辣椒素（ 10%含量）和 480kg 辣椒红色素（ 150色价）的成本为 16.48万元。 本项目的建设规模为年产 10%以上辣素