资料：微生物学教案：第五章 微生物代谢.doc

第一节 代谢概论代谢（metalsolism）是细胞内发生的各种化学反应的总称，它主要由分解代谢(catabolism)和合成代谢(anabolism)两个过程组成。分解代谢是指细胞将大分子物质降解成小分子物质，并在这个过程中产生能量。一般可将分解代谢分为三个阶段（图5-1）：第一阶段是将蛋白质、多糖及脂类等大分子营养物质降解成氨基酸、单糖及脂肪酸等小分子物质；第二阶段是将第一阶段产物进一步降解成更为简单的乙酰辅酶A、丙酮酸以及能进入三羧酸循环的某些中间产物，在这个阶段会产生一些ATP、NADH及FADH2；第三阶段是通过三羧酸循环将第二阶段产物完全降解生成CO2,并产生ATP、NADH及FADH2。第二和第三阶段产生的ATP、NADH及FADH2通过电子传递链被氧化，产生大量的ATP。图5-1 分解代谢的三个阶段 合成代谢是指细胞利用简单的小分子物质合成复杂大分子的过程，在这个过程中要消耗能量。合成代谢所利用的小分子物质来源于分解代谢过程中产生的中间产物（图5-2）或环境中的小分子营养物质。在代谢过程中，微生物通过分解代谢产生化学能，光合微生物还可将光能转换成化学能，这些能量除用于合成代谢外，还可用于微生物的运动和运输，另有部分能量以热或光的形式释放到环境中去。微生物产生和利用能量及其与代谢的关系见图5-3。无论是分解代谢还是合成代谢，代谢途径都是由一系列连续的酶促反应构成的，前一步反应的产物是后续反应的底物。细胞通过各种方式有效地调节相关的酶促反应，来保证整个代谢途径的协调性与完整性，从而使细胞 的生命活动得以正常进行。图5-2 合成代谢示意图图5-3 能量与代谢关系示意图 某些微生物在代谢过程中除了产生其生命活动所必需的初级代谢产物和能量外，还会产生一些次级代谢产物，这些次级代谢产物除了有利于这些微生物的生存外，还与人类的生产与生活密切相关，也是微生物学的一个重要研究领域。第二节 微生物产能代谢一 生物氧化 分解代谢实际上是物质在生物体内经过一系列连续的氧化还原反应，逐步分解并释放能量的过程，这个过程也称为生物氧化，是一个产能代谢过程。在生物氧化过程中释放的能量可被微生物直接利用，也可通过能量转换储存在高能化合物（如ATP）中，以便逐步被利用，还有部分能量以热的形式被释放到环境中。不同类型微生物进行生物氧化所利用的物质是不同的，异养微生物利用有机物，自养微生物则利用无机物，通过生物氧化来进行产能代谢。二异养微生物的生物氧化异养微生物将有机物氧化，根据氧化还原反应中电子受体的不同，可将微生物细胞内发生的生物氧化反应分成发酵和呼吸两种类型，而呼吸又可分为有氧呼吸和厌氧呼吸两种方式。1. 发酵发酵(fermentation)是指微生物细胞将有机物氧化释放的电子直接交给底物本身未完全氧化的某种中间产物，同时释放能量并产生各种不同的代谢产物。在发酵条件下有机化合物只是部分地被氧化，因此，只释放出一小部分的能量。发酵过程的氧化是与有机物的还原偶联在一起的。被还原的有机物来自于初始发酵的分解代谢，即不需要外界提供电子受体。肠内酵母感染导致醉酒据报道，一些日本人因酵母感染而导致酒精中毒。这些人其实根本没有饮用任何酒精饮料，却经常呈醉酒状态。检查结果表明，生长在这些人肠道内的酵母菌能进行酒精发酵，所制造出来的酒精足以让人大醉。经过抗生素治疗，这些人很快恢复了健康。发酵的种类有很多，可发酵的底物有碳水化合物、有机酸、氨基酸等，其中以微生物发酵葡萄糖最为重要。生物体内葡萄糖被降解成丙酮酸的过程称为糖酵解（glycolysis），主要分为四种途径：EMP途径、HMP途径、ED途径、磷酸解酮酶途径。(1)EMP途径（Embden-Meyerhof pathway）整个EMP途径大致可分为两个阶段（如图5-4）。第一阶段可认为是不涉及氧化还原反应及能量释放的准备阶段，只是生成两分子的主要中间代谢产物：3-磷酸-甘油醛。第二阶段发生氧化还原反应，合成ATP并形成两分子的丙酮酸。在EMP途径的第一阶段，葡萄糖在消耗ATP的情况下被磷酸化，形成葡萄糖-6-磷酸。初始的磷酸化能增加分子的反应活性。葡萄糖-6-磷酸再转化为果糖-6-磷酸，然后再次被磷酸化，形成一个重要的中间产物：果糖-1，6-二磷酸。醛缩酶催化果糖-1，6-二磷酸裂解成两个三碳化合物：3-磷酸甘油醛及磷酸二羟丙酮。至此，还未发生氧化还原反应，所有的反应均不涉及电子转移。在第二阶段，3-磷酸甘油醛转化为1，3-二磷酸甘油醛的过程是氧化反应，辅酶NAD+接受氢原子，形成NADH。同时，每个3-磷酸甘油醛都接受无机磷酸被磷酸化。与己糖磷酸的有机磷酸键不同，二磷酸甘油醛中的两个磷酸键，属于高能磷酸键，在1，3二磷酸甘油酸转变成3-磷酸甘油酸及后续的磷酸烯醇式丙酮酸转变成丙酮酸的反应过程中，发生ATP的合成反应。在糖酵解过程中，有两分子的ATP用于糖的磷酸化，但合成出四个分子的ATP，因此，每氧化一个分子的葡萄糖净得两分子ATP。在两分子的1，3-二磷酸甘油醛的合成过程中，两分子NAD+被还原为NADH。然而，细胞中的NAD+供应是有限的，假如所有的NAD+都转变成NADH，葡萄糖的氧化就得停止。因为三磷酸甘油醛的氧化反应只有在NAD+存在时才能进行。这一路障可以通过将丙酮酸进一步还原，使NADH氧化重新成为NAD+而得以克服。例如在酵母细胞中，丙酮酸被还原成为乙醇，并伴有CO2的释放；而在乳酸菌细胞中，丙酮酸被还原成乳酸。对于原核生物细胞，丙酮酸的还原途径是多种多样的，但有一点是一致的：NADH必须重新被氧化成NAD+，使得酵解过程中的产能反应得以进行。在任何产能过程中，氧化必须与还原相平衡。每除去一个电子都必须有一个电子受体。在此情况下，NAD+在一个酶促反应中的还原与它在另一反应中的氧化相偶联，反应终产物也是处于氧化还原平衡中。EMP途径可为微生物的生理活动提供ATP和NADH，其中间产物又可为微生物的合成代谢提供碳骨架，并在一定条件下可逆转合成多糖。图5-4 EMP途径（2）HMP途径 HMP途径（图5-5）是从6-磷酸葡萄糖酸开始的，即在单磷酸己糖基础上开始降解的，故称为单磷酸己糖途径。HMP途径与EMP途径有着密切的关系，因为HMP途径中的3-磷酸甘油醛可以进入EMP，因此该途径又可称为磷酸戊糖支路。HMP途径的一个循环的最终结果是一分子6-磷酸葡萄糖转变成一分子3-磷酸甘油醛，三分子CO2和六分子NADPH。一般认为HMP途径不是产能途径，而是为生物合成提供大量的还原力（NADPH）和中间代谢产物。如5-磷酸核酮糖是合成核酸，某些辅酶及组氨酸的原料；NADPH是合成脂肪酸、类固醇和谷氨酸的供氢体。另外，HMP途径中产生的5-磷酸核酮糖，还可以转化为1，5-二磷酸核酮糖，在羧化酶作用下固定CO2，对于光能自养菌，化能自养菌具有重要意义。虽然这条途径中产生的NADPH可经呼吸链氧化产能，一摩尔葡萄糖经HMP途径最终可得到35摩尔ATP，但这不是代谢中的主要方式。因此不能把HMP途径看作是产生ATP的有效机制。大多数好氧和兼性厌氧微生物中都有HMP途径，而且在同一微生物中往往同时存在EMP和HMP途径，单独具有EMP或HMP途径的微生物较少见。图5-5 HMP途径（3）ED途径ED途径是在研究嗜糖假单胞菌（Pseudomonas saccharophila）时发现的。在ED途径中，6-磷酸葡萄糖首先脱氢产生6-磷酸葡萄糖酸，接着在脱水酶和醛缩酶的作用下，产生一分子3-磷酸甘油醛和一分子丙酮酸。然后3-磷酸甘油醛进入EMP途径转变成丙酮酸。一分子葡萄糖经ED途径最后生成两分子丙酮酸，一分子ATP，一分子NADPH和NADH（如图5-6）。ED途径在细菌中，尤其是在革兰氏阴性菌中分布较广，特别是假单胞菌和固氮菌的某些菌株较多存在。ED途径可不依赖于EMP和HMP途径而单独存在，但对于靠底物水平磷酸化获得ATP的厌氧菌而言，ED途径不如EMP途径经济图5-6 ED途径（4）磷酸解酮酶途径磷酸解酮酶途径是明串珠菌在进行异型乳酸发酵过程中分解己糖和戊糖的途径。该途径的特征性酶是磷酸解酮酶，根据解酮酶的不同。把具有磷酸戊糖解酮酶的称为PK途径（如图5-7），把具有磷酸己糖解酮酶的叫HK途径（如图5-8）。在糖酵解过程中生成的丙酮酸可被进一步代谢。在无氧条件下，不同的微生物分解丙酮酸后会积累不同的代谢产物。目前发现多种微生物可以发酵葡萄糖产生乙醇，能进行乙醇发酵的微生物包括酵母菌、根霉、曲霉和某些细菌。根据在不同条件下代谢产物的不同，可将酵母菌利用葡萄糖进行的发酵分为三种类型：在酵母菌的乙醇发酵中，酵母菌可将葡萄糖经EMP途径降解为两分子丙酮酸，然后丙酮酸脱羧生成乙醛，乙醛作为氢受体使NAD+再生，发酵终产物为乙醇，这种发酵类型称为酵母的一型发酵；但当环境中存在亚硫酸氢钠时，它可与乙醛反应生成难溶的磺化羟基乙醛。由于乙醛和亚硫酸盐结合而不能作为NADH2的受氢体，所以不能形成乙醇，迫使磷酸二羟丙酮代替乙醛作为受氢体，生成-磷酸甘油。-磷酸甘油进一步水解脱磷酸而生成甘油，称为酵母的二型发酵；在弱碱性条件下（pH 7.6），乙醛因得不到足够的氢而积累，两个乙醛分子间会发生歧化反应，一分子乙醛作为氧化剂被还原成乙醇，另一个则作为还原剂被氧化为乙酸。氢受体则由磷酸二羟丙酮担任。发酵终产物为甘油、乙醇和乙酸，称为酵母的三型发酵。这种发酵方式不能产生能量，只能在非生长的情况下才进行。 图5-7 磷酸戊糖解酮酶（PK）途径图5-8 磷酸己糖解酮酶（HK）途径不同的细菌进行乙醇发酵时，其发酵途径也各不相同。如运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）和厌氧发酵单胞菌（Zymomonas anaerobia）是利用ED途径分解葡萄糖为丙酮酸，最后得到乙醇，对于某些生长在极端酸性条件下的严格厌氧菌，如胃八叠球菌（Sarcina ventriculi）和肠杆菌（Enterobacteriaceae）则是利用EMP途径进行乙醇发酵。许多细菌能利用葡萄糖产生乳酸，这类细菌称为乳酸细菌。根据产物的不同，乳酸发酵有三种类型：同型乳酸发酵、异型乳酸发酵和双歧发酵。同型乳酸发酵的过程是：葡萄糖经EMP途径降解为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的作用下被NADH还原为乳酸。由于终产物只有乳酸一种，故称为同型乳酸发酵。在异型乳酸发酵中，葡萄糖首先经PK途径分解，发酵终产物除乳酸以外还有一部分乙醇或乙酸。在肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）中，利用HK途径分解葡萄糖，产生3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸，其中3-磷酸甘油醛进一步转化为乳酸，乙酰磷酸经两次还原变为乙醇，当发酵戊糖时，则是利用PK途径，磷酸解酮糖酶催化5-P木酮糖裂解生成乙酰磷酸和3-P-甘油醛。双歧发酵是两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）发酵葡萄糖产生乳酸的一条途径。此反应中有两种磷酸酮糖酶参加反应，即6-磷酸果糖磷酸酮糖酶和5-磷酸木酮糖磷酸酮糖酶分别催化6-磷酸果糖和5-磷酸木酮糖裂解产生乙酰磷酸和4-磷酸丁糖，及3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸。许多厌氧菌可进行丙酸发酵。葡萄糖经EMP途径分解为两个丙酮酸后，再被转化为丙酸。少数丙酸细菌还能将乳酸（或利用葡萄糖分解而产生的乳酸）转变为丙酸。某些专性厌氧菌，如梭菌属（Clostridium）、丁酸弧菌属（Butyrivibrio）、真杆菌属（Eubacterium）和梭杆菌属（Fusobacterium），能进行丁酸与丙酮-丁醇发酵。在发酵过程中，葡萄糖经EMP途径降解为丙酮酸，接着在丙酮酸-铁氧还蛋白酶的参与下，将丙酮酸转化为乙酰辅酶A。乙酰辅酶A再经一系列反应生成丁酸或丁醇和丙酮。某些肠杆菌，如埃希氏菌属（Escherichia）、沙门氏菌属（Salmonella）和志贺氏菌属（Shigella）中的一些菌，能够利用葡萄糖进行混合酸发酵。先通过EMP途径先将葡萄糖分解为丙酮酸，然后由不同的酶系将丙酮酸转化成不同的产物，如乳酸、乙酸、甲酸、乙醇、CO2和氢气，还有一部分磷酸烯醇式丙酮酸用于生成琥珀酸；而肠杆菌、欧文氏菌属（Erwinia）中的一些细菌，能将丙酮酸转变成乙酰乳酸，乙酰乳酸经一系列反应生成丁二醇。由于这类肠道菌还具有丙酮酸-甲酸裂解酶，乳酸脱氢酶等，所以其终产物还有甲酸、乳酸、乙醇等。2. 呼吸作用我们已经在上面讨论了葡萄糖分子在没有外源电子受体时的代谢过程。在这个过程中，底物中所具有的能量只有一小部分被释放出来，并合成少量ATP。造成这种现象的原因有两个，一是底物的碳原子只被部分氧化，二是初始电子供体和最终电子受体的还原电势相差不大。然而，如果有氧或其它外源电子受体存在时，底物分子可被完全氧化为CO2，且在此过程中可合成的ATP的量大大多于发酵过程。微生物在降解底物的过程中，将释放出的电子交给NAD（P）+、FAD或FMN等电子载体，再经电子传递系统传给外源电子受体，从而生成水或其它还原型产物并释放出能量的过程，称为呼吸作用。其中，以分子氧作为最终电子受体的称为有氧呼吸（aerobic respiration），以氧化型化合物作为最终电子受体的称为无氧呼吸（anaerobic respiration）。呼吸作用与发酵作用的根本区别在于：电子载体不是将电子直接传递给底物降解的中间产物，而是交给电子传递系统，逐步释放出能量后再交给最终电子受体。许多不能被发酵的有机化合物能够通过呼吸作用而被分解，这是因为在营呼吸作用的生物的电子传递系统中发生了NADH的再氧化和ATP的生成，因此只要生物体内有一种能将电子从该化合物转移给NAD+的酶存在，而且该化合物的氧化水平低于CO2即可。能通过呼吸作用分解的有机物包括某些碳氢化合物、脂肪酸和许多醇类。但某些人造化合物对于微生物的呼吸作用具显著抗性，可在环境中积累，造成有害的生态影响。(1) 有氧呼吸葡萄糖经过糖酵解作用形成丙酮酸，在发酵过程中，丙酮酸在厌氧条件下转变成不同的发酵产物；而在有氧呼吸过程中，丙酮酸进入三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，简称TCA循环），被彻底氧化生成CO2和水，同时释放大量能量（图5-9）。对于每个经TCA循环而被氧化的丙酮酸分子来讲，在整个氧化过程中共释放出三个分子的CO2。一个是在乙酰辅酶A形成过程中，一个是在异柠檬酸的脱羧时产生的，另一个是在a-酮戊二酸的脱羧过程中。与发酵过程相一致，TCA循环中间产物氧化时所释放出的电子通常先传递给含辅酶NAD+的酶分子。然而，NADH的氧化方式在发酵及呼吸作用中是不同的。在呼吸过程中，NADH中的电子不是传递给中间产物，如丙酮酸，而是通过电子传递系统传递给氧分子或其它最终电子受体，因此，在呼吸过程中，因有外源电子受体的存在，葡萄糖可以被完全氧化成CO2，从而可产生比发酵过程更多的能量。在三羧酸循环过程中，丙酮酸完全氧化为三个分子的CO2，同时生成四分子的NADH和一分子的FADH2。NADH和FADH2可经电子传递系统重新被氧化，由此每氧化一分子NADH可生成三分子ATP，每氧化一分子FADH2可生成两分子ATP。另外，琥珀酰辅酶A在氧化成延胡索酸时，包含着底物水平磷酸化作用，由此产生一分子GTP，随后GTP可转化成ATP。因此每一次三羧酸循环可生成15分子ATP。此外，在糖酵解过程中产生的两分子NADH可经电子传递系统重新被氧化，产生6分子ATP。在葡萄糖转变为两分子丙酮酸时还可借底物水平磷酸化生成两分子的ATP。因此，需氧微生物在完全氧化葡萄糖的过程中总共可得到38分子的ATP。如果我们假设ATP中的高能磷酸键有31.8KJ/M的能量，那么每摩尔葡萄糖完全氧化成CO2和H2O时，就有1208KJ的能量转变为ATP中高能磷酸键的键能。因为完全氧化1摩尔葡萄糖可得到的总能量大约是2822KJ，因此呼吸作用的效率大约是43%，其余的能量以热的形式散失。图 5-9 三羧酸循环在糖酵解和三羧酸循环过程中形成的NADH和FADH2通过电子传递系统被氧化，最终形成ATP为微生物的生命活动提供能量。电子传递系统是由一系列氢和电子传递体组成的多酶氧化还原体系。NADH、FADH2以及其它还原型载体上的氢原子，以质子和电子的形式在其上进行定向传递；其组成酶系是定向有序的，又是不对称地排列在原核微生物的细胞质膜上或是在真核微生物的线粒体内膜上。这些系统具两种基本功能：一是从电子供体接受电子并将电子传递给电子受体；二是通过合成ATP把在电子传递过程中释放的一部分能量保存起来。电子传递系统中的氧化还原酶包括：NADH脱氢酶、黄素蛋白、铁硫蛋白、细胞色素、醌及其化合物。 NADH脱氢酶 位于细胞膜的内侧，从NADH接受电子，并传递两个氢原子给黄素蛋白。 黄素蛋白 黄素蛋白是一类由黄素单核苷酸（FMN）或黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）及分子量不同的蛋白质结合而成。位于呼吸链起始位点的酶蛋白黄素的三环异咯嗪中，最多可接受两个电子，还原时黄素失去黄素的特征成为无色。自由状态的FMN/FMNH2和FAD/FADH2的E0 值分别为-205mV和-219mV。当黄素同酶蛋白结合时，E0发生变化。通常FAD与酶蛋白的组氨酸残基共价键结合，在氧化还原电位较高时（0mV）起作用，FMN则通过本身带负电荷的磷酸基团与酶蛋白的正电荷以离子键方式结合，在氧化还原电位较低时（等于或高于0mV）起作用。 铁硫蛋白 铁硫蛋白的分子量相对较小（通常等于或低于30000），以Fe2S2和Fe4S4复合体最为常见。铁硫蛋白的还原能力随硫、铁原子的数量及铁原子中心与蛋白结合方式的不同而有很大的变化。因此不同的铁硫蛋白可在电子传递过程中的不同位点发挥作用。与细胞色素一样，铁硫蛋白只能携带电子，不能携带氢原子。 细胞色素 细胞色素是含有铁卟啉基团的电子传递蛋白，通过位于细胞色素中心的铁原子失去或获得一个电子而经受氧化和还原。已知有好几种具有不同氧化还原电位的细胞色素。一种细胞色素能将电子转移给另一种比它的氧化还原电位更高的细胞色素，同时也可从比它的氧化还原电位低的细胞色素接受电子。在某些时候，几种细胞色素或细胞色素与铁硫蛋白可形成稳定的复合体。例如由两种不同的细胞色素b和细胞色素c形成的细胞色素bc1复合体。这种复合体在能量代谢过程中起着关键性的作用。 醌及其衍生物 这是一类分子量较小的非蛋白质的脂溶性物质。与黄素蛋白一样，这类物质可作为氢的受体和电子供体。微生物体内一般有三种类型，即泛醌、甲基萘醌和脱甲基萘醌。（2）无氧呼吸某些厌氧和兼性厌氧微生物在无氧条件下进行无氧呼吸。无氧呼吸的最终电子受体不是氧，而是像NO3-、NO2-、SO42-、S2O32-、CO2等这类外源受体。无氧呼吸也需要细胞色素等电子传递体，并在能量分级释放过程中伴随有磷酸化作用，也能产生较多的能量用于生命活动。但由于部分能量随电子转移传给最终电子受体，所以生成的能量不如有氧呼吸产生的多。“鬼火”的生物学解释在无氧条件下，某些微生物在没有氧、氮或硫作为呼吸作用的最终电子受体时，可以磷酸盐代替，其结果是生成磷化氢（PH3），一种易燃气体。当有机物腐败变质时，经常会发生这种情况。若埋葬尸体的坟墓封口不严时，这种气体就很易逸出。农村的墓地通常位于山坡上，埋葬着大量尸体。在夜晚，气体燃烧会发出绿幽幽的光。长期以来人们无法正确地解释这种现象，将其称之为“鬼火”。三自养微生物的生物氧化一些微生物可以从氧化无机物获得能量，同化合成细胞物质，这类细菌称为化能自养微生物。它们在无机能源氧化过程中通过氧化磷酸化产生ATP。1. 氨的氧化NH3同亚硝酸（NO2-）是可以用作能源的最普通的无机氮化合物，能被硝化细菌所氧化，硝化细菌可分为两个亚群：亚硝化细菌和硝化细菌。氨氧化为硝酸的过程可分为两个阶段，先由亚硝化细菌将氨氧化为亚硝酸，再由硝化细菌将亚硝氧化为硝酸。由氨氧化为硝酸是通过这两类细菌依次进行的。硝化细菌都是一些专性好氧的革兰氏阳性细菌，以分子氧为最终电子受体，且大多数是专性无机营养型。它们的细胞都具有复杂的膜内褶结构，这有利于增加细胞的代谢能力。硝化细菌无芽孢，多数为二分裂殖，生长缓慢，平均代时在10h以上，分布非常广泛。2. 硫的氧化硫杆菌能够利用一种或多种还原态或部分还原态的硫化合物（包括硫化物、元素硫、硫代硫酸盐、多硫酸盐和亚硫酸盐）作能源。H2S首先被氧化成元素硫，随之被硫氧化酶和细胞色素系统氧化成亚硫酸盐，放出的电子在传递过程中可以偶联产生四个ATP。亚硫酸盐的氧化可分为两条途径，一是直接氧化成SO42-的途径，由亚硫酸盐-细胞色素C还原酶和末端细胞色素系统催化，产生一个ATP；二是经磷酸腺苷硫酸的氧化途径，每-氧化一分子SO42-产生2.5个ATP。3. 铁的氧化从亚铁到高铁状态的铁的氧化，对于少数细菌来说也是一种产能反应，但从这种氧化中只有少量的能量可以被利用。亚铁的氧化仅在嗜酸性的氧化亚铁硫杆菌（Thiobacillus ferrooxidans）中进行了较为详细的研究。在低pH环境中这种菌能利用亚铁放出的能量生长。在该菌的呼吸链中发现了一种含铜蛋白质（rusticyanin），它与几种细胞色素c和一种细胞色素a1氧化酶构成电子传递链。虽然电子传递过程中的放能部位和放出有效能的多少还有待研究，但已知在电子传递到氧的过程中细胞质内有质子消耗，从而驱动ATP的合成。4. 氢的氧化氢细菌都是一些呈革兰氏阴性的兼性化能自氧菌。它们能利用分子氢氧化产生的能量同化CO2，也能利用其它有机物生长。氢细菌的细胞膜上有泛醌、维生素K2及细胞色素等呼吸链组分。在该菌中，电子直接从氢传递给电子传递系统，电子在呼吸链传递过程中产生ATP。在多数氢细菌中有两种与氢的氧化有关的酶。一种是位于壁膜间隙或结合在细胞质膜上的不需NAD+的颗粒状氧化酶，它能够催化以下反应：该酶在氧化氢并通过电子传递系统传递电子的过程中，可驱动质子的跨膜运输，形成跨膜质子梯度为ATP的合成提供动力；另一种是可溶性氢化酶，它能催化氢的氧化，而使NAD+还原的反应。所生成的NADH主要用于CO2的还原。四能量转换在产能代谢过程中，微生物可通过底物水平磷酸化和氧化磷酸化将某种物质氧化而释放的能量储存于ATP等高能分子中，对光合微生物而言，则可通过光合磷酸化将光能转变为化学能储存于ATP中。1底物水平磷酸化（substrate level phosphorylation）物质在生物氧化过程中，常生成一些含有高能键的化合物，而这些化合物可直接偶联ATP或GTP的合成，这种产生ATP等高能分子的方式称为底物水平磷酸化。底物水平磷酸化既存在于发酵过程中，也存在于呼吸作用过程中。例如，在EMP途径中（图5-4），1，3-二磷酸甘油酸转变为3-磷酸甘油酸以及磷酸烯醇式丙酮酸转变为丙酮酸的过程中都分别偶联着一分子ATP的形成；在三羧酸循环过程中（图5-8），琥珀酰辅酶A转变为琥珀酸时偶联着一分子GTP的形成。2氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）物质在生物氧化过程中形成的NADH和FADH2可通过位于线粒体内膜和细菌质膜上的电子传递系统将电子氧或其他氧化型物质，在这个过程中偶联着ATP的合成（图5-10），这种产生ATP的方式称为氧化磷酸化。一分子NADH和FADH2可分别产生3个和2个ATP。图5-10 电子传递与ATP产生示意； 图5-11 化学渗透偶联假说示意图由于ATP在生命活动中所起的重要作用，阐明ATP合成的具体机制长期以来一直是人们的研究热点，并取得丰硕成果。英国学者米切尔(P.Mitchell)1961年提出化学渗透偶联假说(chemiosmotic-coupling hypothesis),该学说的中心思想是电子传递过程中导致建立膜内外质子浓度差,从而将能量蕴藏在质子势中,质子势推动质子由膜外进入胞内,在这个过程中通过存在于膜上的F1-F0ATP酶偶联ATP的形成(图5-11)。米切尔因提出化学渗透偶联假说荣获1978年诺贝尔化学奖,但是F1-F0ATP酶利用质子势推动质子跨膜运输而促进ATP形成的具体机制仍然困扰着人们。在化学渗透偶联假说提住后,美国科学家博耶(P.D.Boyer)提出构象变化偶联假说(conformational-coupling hypothesis), 其中心思想是质子势推动的质子跨膜运输启动并驱使F1-F0ATP酶构象发生变化,这种构象变化导致该酶催化部位对ADP和Pi的亲和力发生改变,并促进ATP的生成和释放(图5-12)。图5-11 化学渗透偶联假说示意图第一步是质子势推动质子由膜外进入膜内,导致F1-F0ATP酶催化部位构象发生变化, 将ADP和Pi转变成与该酶紧密结合的ATP(图5-12a);第二步是质子跨膜运输导致F1-F0ATP酶构象进一步发生变化,使ATP与之结合松散而从该酶上释放(图5-12b);第三步是质子跨膜运输使F1-F0ATP酶再发生变化,成为有利于与ADP和Pi结合的状态(图5-12c)。博耶教授因提出构象变化偶联假说,与解析F1-F0ATP酶F1结构域晶体结构的英国学者沃克(J.E.Walker),以及发现Na+,K+-ATP酶系统的丹麦学者斯克(J.C.Skou)共同荣获1997年诺贝尔化学奖。图5-12 构象变化偶联假说示意图分子马达(molecular motor)*由于以米切尔、博耶、沃克等为代表的众多科学家的杰出工作,人们已经对质子势推动质子跨膜运输,进而促进腺苷三磷酸合成酶(F1-F0ATP酶)催化合成ATP的机制有了一个较为清晰的认识。F1-F0ATP酶是位于线粒体、叶绿体和细菌细胞膜上的一种能量转化的核心酶(图5-13a),由膜外可溶性*球形结构域F1和位于膜中的结构域F0通过长约4.5nm的细长颈部连接而成。F1由335种肽链共9个亚基组成,其催化部位在亚基上,3个和3个亚基象橘子瓣一样围绕着亚基间隔排列, 亚基底部突出成为连接F1和F0的颈部的一部分(和亚基也可能位于颈部),质子在跨膜运输过程中可以驱动和亚基与亚基之间发生相对旋转运动,亚基按顺序与三个不同构象的亚基接触,这三个不同构象的亚基分别是空位点形式亚基、与ADP和Pi结合形式亚基及与ATP结合形式亚基,这三种形式的亚基中的每一个在相对旋转运动过程中也按相同顺序发生三种形式的构象变化,使底物ADP和Pi与空位点结合,并催化它们形成ATP后再释放。上述过程在我们脑海中形成这样一部生动的卡通:质子跨膜运输带动F1-F0ATP酶的类车轮结构和车轴的旋转,就象流水驱使水轮机转动一样,旋转运动使酶上的三个催化部位构象依次发生变化,以结合ADP和Pi、合成ATP并将其释放(图5-13b)。图5-13 质子跨膜运输与F1-F0ATP酶(分子马达)合成ATP关系示意图博耶教授曾以其杰出科学家的渊博知识和丰富想象力将F1-F0ATP酶形容为一个完美的小分子机器(a beautiful little molecular machine)。经过几十年的努力,一个精巧的分子马达已初步在人们脑海中组装完毕,随着人们对质子跨膜运输的具体机制以及F0结构域精细结构与功能的进一步阐明,一个更加清晰的分子马达图象将会展现在我们眼前。* J.Glanz & R.F.Service. Awards for high-energy molecules and cool atoms. Science, 278:578-579,1997 3光合磷酸化（photophosphorylation）光合作用是自然界一个极其重要的生物学过程，其实质是通过光合磷酸化将光能转变成化学能，以用于从CO2合成细胞物质。行光合作用的生物体除了绿色植物外，还包括光合微生物，如藻类、蓝细菌和光合细菌（包括紫色细菌、绿色细菌、嗜盐菌等）。它们利用光能维持生命，同时也为其它生物（如动物和异养微生物）提供了赖以生存的有机物。（1）光合色素光合色素是光合生物所特有的色素，是将光能转化为化学能的关键物质。共分三类：叶绿素(chl)或细菌叶绿素（Bchl），类胡萝卜素和藻胆素。除光合细菌外，叶绿素a普遍存在于光合生物中，叶绿素a、b共同存在于高等植物、绿藻和蓝绿细菌中，叶绿素c存在于褐藻和硅藻中，叶绿素d存在于红藻中，叶绿素e存在于金黄藻中，褐藻和红藻也含有叶绿素a。细菌叶绿素具有和高等植物中的叶绿素相类似的化学结构，二者的区别在于侧链基团的不同，以及由此而导致的光吸收特性的差异。此外，叶绿素和细菌叶绿素的吸收光谱在不同的细胞中也有差异。所有光合生物都有类胡萝卜素。类胡萝卜素虽然不直接参加光合反应，但它们有捕获光能的作用，能把吸收的光能高效地传给细菌叶绿素（或叶绿素）。而且这种光能同叶绿素（或细菌叶绿素）直接捕捉到的光能一样被用来进行光合磷酸化作用。此外胡萝卜素还有两个作用：一是可以作为叶绿素所催化的光氧化反应的猝灭剂，以保护光合机构不受光氧化损伤，二是可能在细胞能量代谢方面起辅助作用。藻胆素因具有类似胆汁的颜色而得名，其化学结构与叶绿素相似，都含有四个吡咯环，但藻胆素没有长链植醇基，也没有镁原子，而且四个吡咯环是直链的。（2）.光合单位以往将在光合作用过程中还原一分子CO2所需的叶绿素分子数称为光合单位（photosynthetic units）。后来通过分析紫色细菌载色体的结构，获得了对光合单位的进一步认识。光合色素分布于两个“系统”，分别称为“光合系统I”和“光合系统II”。每个系统即为一个光合单位。这两个系统中的光合色素的成分和比例不同。一个光合单位由一个光捕获复合体和一个反应中心复合体组成。光捕获复合体含有菌绿素和类胡萝卜素，它们吸收一个光子后，引起波长最长的菌绿素（P870）激活，从而传给反应中心，激发态的P870可释放出一个高能电子。（3）光合磷酸化光合磷酸化是指光能转变为化学能的过程，当一个叶绿素分子吸收光量子时，叶绿素性质上即被激活，导致叶绿素（或细菌叶绿素）释放一个电子而被氧化，释放出的电子在电子传递系统中的传递过程中逐步释放能量，这就是光合磷酸化的基本动力。a 环式光合磷酸化光合细菌主要通过环式光合磷酸化作用产生ATP，这类细菌主要包括紫色硫细菌、绿色硫细菌、紫色非硫细菌和绿色非硫细菌。在光合细菌中，吸收光量子而被激活的细菌叶绿素释放出高能电子，于是这个细菌叶绿素分子即带有正电荷。所释放出来的高能电子顺序通过铁氧还蛋白、辅酶Q、细胞色素b和c，再返回到带正电荷的细菌绿素分子。在辅酶Q将电子传递给细胞色素c的过程中，造成了质子的跨膜移动，为ATP的合成提供了能量（如图5-14）。在这个电子循环传递过程中，光能转变为化学能，故称环式光合磷酸化。环式光合磷酸化可在厌氧条件下进行，产物只有ATP，无NADP（H），也不产生分子氧。通常以下式表示环式光合磷酸化作用：图5-14 紫色细菌的环式电子传递途径b 非环式光合磷酸化高等植物和蓝细菌与光合细菌不同，它们可以裂解水，以提供细胞合成的还原能力。它们含有两种类型的反应中心，连同天线色素、初级电子受体和供体一起构成了光合系统I和光合系统II，这两个系统偶联，进行非环式光合磷酸化（见图5-15）。在光合系统I中，叶绿素分子P700吸收光子后被激活，释放出一个高能电子。这个高能电子传递给铁氧还蛋白（Fd），并使之被还原。还原的铁氧还蛋白在Fd：NADP+还原酶的作用下，将NADP+还原为NADPH。用以还原P700的电子来源于光合系统II。在光合系统II中，叶绿素分子P680吸收光子后，释放出一个高能电子。后者先传递给辅酶Q，再传给光合系统I，使P700还原。失去单电子的P680，靠水的光解产生的电子来补充。高能电子从辅酶Q到光合系统I的过程中，可推动ATP的合成。非环式光合磷酸化的反应式为：图5-15 蓝细菌的非环式电子传递途径有的光合细菌虽然只有一个光合系统，但也以非环式光合磷酸化的方式合成ATP，如绿硫细菌和绿色细菌（见图5-16）。从光反应中心释放出的高能电子经铁硫蛋白、铁氧还蛋白、黄素蛋白，最后用于还原NAD+生成NADH。反应中心的还原依靠外源电子供体，如S2-、S2O32-等。外源电子供体在氧化过程中放出电子，经电子传递系统传给失去了电子的光合色素，使其还原，同时偶联ATP的生成。由于这个电子传递途径也没有形成环式回路，故也称为非环式光合磷酸化，反应式为：图5-16绿色细菌的非环式电子传递途径第三节 耗能代谢在上一节中，我们讨论了微生物如何将光能和化学能转变为生物能的过程。本节将阐明微生物利用这些能量合成细胞物质及其它耗能代谢的过程（如运输、运动、生物发光等生理过程）。一. 细胞物质的合成微生物利用能量代谢所产生的能量、中间产物以及从外界吸收的小分子，合成复杂的细胞物质的过程称为合成代谢。合成代谢所需要的能量由ATP和质子动力提供。糖类、氨基酸、脂肪酸、嘌呤、嘧啶等主要的细胞成分的合成反应的生化途径中，合成代谢和分解代谢虽有共同的中间代谢物参加，例如，由分解代谢而产生的丙酮酸、乙酰辅酶A、草酰乙酸和三磷酸甘油醛等化合物可作为生物合成反应的起始物（图5-17）。 但在生物合成途径中，一个分子的生物合成化学途径与它的分解代谢途径通常是不同的。其中可能有相同的步骤，但导向一个分子合成的途径与从该分子开始的降解途径间至少有一个酶促反应步骤是不同的。另外，需能的生物合成途径与产能的ATP分解反应相偶联，因而生物合成方向是不可逆的。其次，调节生物合成的反应，与相应的分解代谢途径的调节机制无关，因为控制分解代谢途径速率的调节酶，并不参与生物合成途径。生物合成途径主要是被它们的末端产物的浓度所调节。图5-17 分解代谢和合成代谢过程中的重要中间产物1. CO2的固定CO2是自养微生物的唯一碳源，异养微生物也能利用CO2作为辅助的碳源。将空气中的CO2同化成细胞物质的过程，称为CO2的固定作用。微生物有两种同化CO2的方式，一类是自养式，另一类为异养式。在自养式中，CO2加在一个特殊的受体上，经过循环反应，使之合成糖并重新生成该受体。在异养式中，CO2被固定在某种有机酸上。因此异养微生物即使能同化CO2，最终却必须靠吸收有机碳化合物生存。自养微生物同化CO2所需要的能量来自光能或无机物氧化所得的化学能，固定CO2的途径主要有以下三条：（1）卡尔文循环这个途径存在于所有化能自养微生物和大部分光合细菌中。经卡尔文循环同化CO2的途径可划分为三个阶段（见图5-18）：CO2的固定;被固定的CO2的还原；CO2受体的再生。卡尔文循环每循环一次，可将六分子CO2同化成一分子葡萄糖，其总反应式为： 图 5-18 卡尔文循环的三个阶段（2）还原性三羧酸循环固定CO2这个途径（图5-19）是在光合细菌、绿硫细菌中发现的。 还原羧酸环的第一步反应是将乙酰CoA还原羧化为丙酮酸，后者在丙酮酸羧化酶的催化下生成磷酸烯醇式丙酮酸，随即被羧化为草酰乙酸，草酰乙酸经一系列反应转化为琥珀酰CoA，再被还原羧化为酮戊二酸。酮戊二酸转化为柠檬酸后，裂解成乙酸和草酰乙酸。乙酸经乙酰CoA合成酶催化生成乙酰CoA，从而完成循环反应。每循环一次，可固定四分子CO2，合成一分子草酰乙酸，消耗三分子ATP、两分子NAD（P）H和一分子FADH2。图 5-19 绿硫细菌固定CO2的还原羧酸法（3）还原的单羧酸环这个体系与还原羧酸环不同，不需要ATP，只要有Fd(red)就可运转。Fd(red)由H2或NADH2提供电子生成。光合细菌也有可能利用这个体系把CO2转换成乙酸（图5-20）。图 5-20 还原的单羧酸环2. 生物固氮所有的生命都需要氮，氮的最终来源是无机氮。尽管大气中氮气的比例占了79%，但所有的动植物以及大多数微生物都不能利用分子态氮作为氮源。目前仅发现一些特殊类群的原核生物能够将分子态氮还原为氨，然后再由氨转化为各种细胞物质。微生物将氮还原为氨的过程称为生物固氮（图5-21）。图5-21 固氮的生化途径具有固氮作用的微生物近五十个属，包括细菌、放线菌和蓝细菌。目前尚未发现真核微生物具有固氮作用。根据固氮微生物与高等植物以及其它生物的关系，可以把它们分为三大类：自生固氮体系，共生固氮体系和联合固氮体系。好氧自生固氮菌以固氮菌属（Azotobacter）较为重要，固氮能力较强。 厌氧自生固氮菌以巴氏固氮梭菌（Clostridium pasteurianum）较为重要，但固氮能力较弱。共生固氮菌中最为人们所熟知的是根瘤菌（Rhizobium），它与其所共生的豆科植物有严格的种属特异性。此外，弗兰克氏菌（Frankia）能与非豆科树木共生固氮。营联合固氮的固氮菌有雀稗固氮菌（A.paspali）、产脂固氮螺菌（Azospirillum lipoferum）等，它们在某些作物的根系粘质鞘内生长发育，并把所固定的氮供给植物，但并不形成类似根瘤的共生结构。微生物之所以能够在常温常压条件下固氨，关键是靠固氮酶的催化作用。固氮酶的结构比较复杂，由铁蛋白和钼铁蛋白两个组分组成。固氮作用是一个耗能反应，固氮反应必须在有固氮酶和ATP的参与下才能进行。每固定一摩尔氮大约需要21摩尔ATP，这些能量来自于氧化磷酸化或光能磷酸化。在体内进行固氮时，还需要一些特殊的电子传递体，其中主要的是铁氧还蛋白和含有FMN作为辅基的黄素氧还蛋白。铁氧还蛋白和黄素氧还蛋白的电子供体来自NADPH，受体是固氮酶。3. 二碳化合物的同化 三羧酸循环是产能反应和生物合成的重要代谢环节，其中的有机酸可被微生物利用，作为电子的供体和碳源。四碳、五碳、六碳酸均可在有氧环境下被微生物利用，通过氧化磷酸化产生能量。但三羧酸循环只有在受体分子草酰乙酸在每次循环后都能得到再生的情况下才能进行。若将三羧酸循环中的有机酸分子移去用于生物合成将会影响三羧酸循环的进行。微生物可利用回补途径（replenishment pathway）来解决这一矛盾。所谓回补途径就是指能补充兼用代谢途径（如三羧酸循环）中因合成代谢而消耗的中间代谢产物的反应。不同的微生物以及在不同条件下具有不同的回补途径，主要有乙醛酸循环途径和甘油酸途径。（1）乙醛酸循环当乙酸被作为底物时，草酰乙酸将会通过乙醛酸途径再生。这条途径由三羧酸循环中的反应和另外的两种酶组成：异柠檬酸裂解酶（催化异柠檬酸裂解成琥珀酸和乙醛酸）和苹果酸合成酶（将乙醛酸和乙酰辅酶A转化为苹果酸）。乙醛酸循环的生物合成途径如图5-22所示。异柠檬酸被裂解成琥珀酸和乙醛酸，使琥珀酸可以进入生物合成途径，因为乙醛酸可以和乙酰辅酶A结合生成苹果酸。苹果酸又可以被转化为草酰乙酸以维持三羧酸循环的进行。琥珀酸可以直接用于卟啉的合成，或者氧化为草酰乙酸后作为四碳氨基酸的碳骨架，或者用于合成葡萄糖（经由草酰乙酸和磷酸烯醇式丙酮酸）。乙醛酸循环比较普遍地存在于好氧微生物中。细菌中的醋酸杆菌（Acetobacter）、固氮菌、大肠杆菌等，以及真菌中的酵母菌、黑曲霉和青霉菌等，都已证明有乙醛酸循环，它们可以利用乙酸作为唯一碳源和能源生长。图5-22 乙醛酸循环 ； 图2-23 甘油酸途径（2）甘油酸途径当微生物以甘氨酸、乙醇酸和草酸作为底物时，则通过甘油酸途径补充三羧酸循环中的中间产物。二碳化合物，如甘氨酸、乙醇酸等，都要先转化为乙醛酸，然后两分子的乙醛酸缩合成羟基丙酸半醛，随后在还原酶的作用下生成甘油酸。甘油酸经氧化后进入EMP途径，生成磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸。它们可接受CO2，生成四碳二羧酸，进入三羧酸循环。由乙醛酸生成甘油酸的途径，称为甘油酸途径（图5-23）。许多微生物都有这条途径，可以利用乙醇酸、草酸和甘氨酸等二碳化合物作为唯一碳源生长。4糖类的合成微生物在生长过程中，除了有分解糖类的能量代谢外，不断地从简单化合物合成糖类，以构成细胞生长所需要的单糖、多糖等。单糖在微生物中很少以游离形式存在，一般以多糖或多聚体的形式，或是以少量的糖磷酸脂和糖核苷酸形式存在。单糖和多糖的合成对自养和异养微生物的生命活动十分重要。(1)单糖的合成无论自养微生物还是异养微生物，其合成单糖的途径一般都是通过EMP途径逆行合成6-磷酸葡萄糖，然后再转化为其它的糖。因此单糖合成的中心环节是葡萄糖的合成。但自养微生物和异养微生物合成葡萄糖的前体来源不同。自养微生物通过卡尔文循环可产生3-磷酸甘油醛，通过还原的羧酸环可得到草酰乙酸或乙酰辅酶A。异养微生物可利用乙酸为碳源经乙醛酸循环产生草酰乙酸；利用乙醇酸、草酸、甘氨酸为碳源时通过甘油酸途径生成3-磷酸甘油醛；以乳酸为碳源时，可直接氧化成丙酮酸；将生糖氨基酸脱去氨基后也可作为合成葡萄糖的前体。生物合成反应中所需的己糖可从外界环境获得或用非糖前体物来合成。主要的合成途径见图5-24。己糖生物合成中的两个关键中间物是葡萄糖-6-磷酸和UDP-葡萄糖。葡萄糖-6-磷酸作为能量来源是葡萄糖氧化和糖酵解过程的重要中间产物，或者转化为CO2或者转化为发酵产物，葡萄糖-6-磷酸也可逆向进入多糖合成途径。在这种情况下，它转化为UDP-葡萄糖（UDPG）。UDPG含有尿嘧啶核苷，故称为核苷糖。UDPG是葡萄糖的活化形式，它既可作为其它核苷糖合成时的起始物质，也可作为细胞多糖的葡萄糖前体。如果说在葡萄糖分解代谢中葡萄糖-6-磷酸是一个关键中间代谢物的话，UDPG则是葡萄糖合成代谢中的关键中间代谢物。当微生物含有可作为能源和碳源的己糖时，这些己糖同时也可作为生物合成代谢的前体。但也有许多微生物可生长在无己糖的培养基上。在这种情况下，合成细胞壁及其它含己糖的多聚物所需的己糖必须由糖异生途径来合成。糖异生途径是由非碳化合物前体合成新的葡萄糖分子的过程。糖异生作用的起始物质是磷酸烯醇氏丙酮酸（PEP），糖酵解过程中的一种重要的中间代谢物。PEP可在不同于糖酵解途径中的酶作用下，逆向合成葡萄糖-6-磷酸。糖异生过程中所需的PEP主要由草酰乙酸脱羧而得，而草酰乙酸是三羧酸循环中的一个重要的中间产物。在大多数情况下，戊糖是将己糖脱去一个碳原子而得到的。这个反应可由多种途径实现。其中最普遍的是经由葡萄糖-6-磷酸的氧化脱羧途径，产生CO2和一个五碳中间物，核酮糖-5-磷酸。核酮糖-5-磷酸可转化为另外两种戊糖，其中一种即是核糖-5-磷酸，可直接用于RNA的合成。核糖-5-磷酸可经酶还原反应生成脱氧核糖用于DNA合成。图2-24 己糖代谢中的主要反应途径(2) 多糖的合成微生物细胞内所含的多糖是一种多聚物，包括同多糖和杂多糖。同多糖是由相