内蒙古大学基因工程大实验思考题.doc

本科生基因工程实验(记录及课后思考题)姓名:学号:专业:完成日期:2012年9月9日指导老师:一、质粒DNA的小量制备1. 影响最终质粒产量的主要因素有哪些？ 与菌的生长状况有关 和提取时的温度有关，需要低温 加溶液、时操作要温和 要用酚和氯仿的混合液多次抽提去除蛋白质 要用冰乙醇沉淀2.提取到的质粒纯度将直接影响到以后的酶切效果，如何操作才能尽可能的避免蛋白质的污染？加入酚：氯仿：异戊醇去除蛋白质，氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。二、质粒DNA电泳鉴定1. 泳道的质粒DNA有几条带？为什么？ 质粒可能会有超螺旋构型，环状构型和线性构型。这三种构型中，迁移率最快的应该是超螺旋的，其次是线性和环状。通常观察到的是超螺旋和环状质粒。2. 溴酚蓝的迁移率相当于多少bp的DNA？在0.7%、1%、1.4%、2%的琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝的迁移率分别与1000bp、600bp、200bp、150bp的双链线性DNA片段大致相同3. 影响本实验结果的因素有哪些？DNA的长度，结构，胶的浓度，电压等会对实验结果造成影响。三、质粒DNA的酶切1. 酶切反应混合物的体积是否对酶切效果有影响？为什么？有影响加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。大多数限制酶贮存在50甘油溶液中，以避免在-20条件下结冰。2. 如何估计DNA用量和酶的用量？DNA样品的浓度（g / l）:OD260稀释倍数50/10001U酶切割1ug的质粒，酶的量不要超过酶切体系的1/10。3. 在吸取内切酶的时候如何操作才能避免浪费？将枪头不要插入液体很深部位，刚过液面且可以吸取所需的体积的液体。四、PCR扩增制备目的基因1. 复性温度是根据什么确定的？可以根据公式：2（A + T）+ 4（C + G），再减5-10度,一般为55-60当50的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55到70。退火温度一般设定比引物的Tm低5。双链DNA中的G+C的比率越高，则双链DNA分离变性的温度也就越高。变性所需的时间与DNA分子的长度 相关，DNA分子越长，在特定的变性温度下使双链DNA分子完全分离所需的时间就越长。 若变性温度太低或变性时间太短，则只能使DNA模板中富含 AT 的区域产生变性，当PCR循环中的反应温度降低时，部分变性的 DNA 模板又重新结合成双链 DNA，从而导致PCR的失败。非特异性条带数增多。2. 引物序列是根据什么设计的？为什么要加上酶切位点序列？ 根据cDNA设计引物，为了更好地与载体连接。3. 为什么要在最后延伸10min？一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物。4. 实验中是否有非特异性扩增产物或引物二聚体带？如何才能消除？有.重新设计引物加大模板用量或减少引物用量扩大反应体系提高退火温度或Mg离子浓度五、从琼脂糖凝胶中回收DNA片段1.为何避免用EB染色及用紫外灯照射欲回收的目的DNA？紫外照射对DNA有损伤，为了保证DNA的完整性，尽量不用EB染色或紫外照射。六、目的基因片段与载体连接1 连接酶的最适活性温度是多少？372 为什么要采用14下连接？由于热稳定性较差，因此长时间反应时通常需在14C下进行3 如何确定插入片段的用量与质粒载体的用量？一般参考T4连接酶的说明书，大多数人做的是插入片段：载体=3：1至5：1，是分子数的比值。可以先测出两者的质量浓度（分光光度计或者跑电泳），然后根据分子量大小可以算出。七、感受态大肠杆菌的制备1. 制作感受态菌的过程中，应注意哪些关键步骤？操作是防止污染，这个最容易影响感受态制作的因素。悬浮沉淀的过程，一定要轻轻悬浮，最好轻摇悬浮。2. CaCl2溶液的作用是什么？为什么要冰冷的？作用：悬浮菌体在04，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球状，转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基钙磷酸复合物黏附于细胞表面，较低的温度也降低了相关酶的活性较好的保存了DNA，冰浴过程中，原来加在溶液中的钙离子和细菌细胞膜结合，在低温下形成液晶结构，这样，在42度热激下，这种液晶结构收缩，将细胞膜扯开孔道，使DNA进入细菌细胞中。八、感受态细菌的转化1.影响转化效率的因素有哪些？细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细 胞 （一般通过检测 OD600 来控制。 DH5菌株 OD600 为 0.5 时细胞密度是 5107/ml）； 所有操作均应在无菌条件和冰上进行； 经 CaCl2 处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加,24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的） ；化合物及无机离子的影响：Ca2+的基础上联合其他二价金属离子 在（如 Mn2+或 Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000 倍）；所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA ;一定范围内，转化效率与外源 DNA 的浓度呈正比；2.白色菌落出现的原理是什么？由-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。九、转化克隆的筛选与鉴定1.PCR法筛选的优点和缺点是什么？酶切法与PCR法PCR可以直接以菌落做模板，比较方便，但有时候有假阳性；酶切鉴定需要提取质粒才能酶切，比较费时，且插入片段里不能有所选酶的酶切位点，在片段序列未知时不宜判定，但在序列已知时相对可靠筛选方案哪个更可靠？2.酶切法与PCR法筛选方案哪个更靠谱一些？ 酶切法，但是比较费时间3.最终确认克隆的方法有哪些？直接筛选：有些载体带有可辨认的遗传标记，能有效地将重组分子与本底区分。 间接筛选：有引起载体分子带有一个或多个抗药性标记基因，当外源DNA插入到抗药基因区后，基因失活，抗性消失。如一质粒有A和B两个抗药性基因，当外源基因插入到B基因区后，便只抗A药而不抗B药。因此能在A药培养基上正常生长而不能在B药培养上生长的便是重组分子。 核酸杂交：广泛用于筛选含有特异DNA顺序的克隆。方法是将菌落或噬菌斑“印迹”到硝酸纤维膜等支持物上，变性后固定在原位，然后与标记的核酸探针进行杂交。阳性点的位置就是所需要的克隆。 免疫学方法：如果重组克隆能在宿主菌中表达，就可以用特异的蛋白质抗体为探针，进行原位杂交，选择特异的克隆。十、外源基因的诱导表达1.IPTG的作用原理是什么？ E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节 基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激 活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表 达2.为什么要增加抗菌素的用量？携带载体的菌体在正常情况下，由于自身保护作用，会丢失载体，含有载体的菌体由于代谢负担过重，比生长速率小于空载菌体！含有载体的菌体在表达外源基因的同时，也能表达AMP分解酶类。此类酶可以分解青霉素，降低危害。不含质粒的菌体则无此功能。当菌体接种量很小的时候，不带质粒的菌体生长迅速，很快成为优势菌株，当加入足够量AMP时，就具有选择压力，抑制不带质粒的菌体生长，使得含质粒菌体在种群中占有优势。十一、SDS-PAGE检测表达蛋白1， 影响表达的因素都有哪些？（1）外源基因的拷贝数（2）外源基因的表达效率 启动子的强弱 核糖体接合位点的有效性 SD序列和起始密码ATG的间距 密码子组成（3）表达产物的稳定性（4）细胞代谢负荷（5）工程菌的培养条件2， 如何确定凝胶上的某条蛋白质带就是所要表达的外源基因产物？电泳检测时，加个空白的大肠杆菌蛋白做对照，根据已知的目的蛋白的大小，再加个蛋白，进行对比，一般来说诱导出来的蛋白浓度明显会高于其他蛋白的.3， pET-his载体为什么必须在BL21(DE3)菌，而不能在DH5中表达？大肠杆菌DH5一般做克隆或保存质粒用，BL21用来做原核表达用。BL21(DE3) 菌株用于高效表达含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因，表达效率高。T7噬菌体RNA聚合酶位于 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。DH5可以表达抗性基因，应该也能表达外源基因，但是我们一般不用该菌作为表达菌，可能与表达量、表达产物活性有关。4， 表达产物的形式是包涵体还是可溶性蛋白？