斑马鱼胚胎发育时期.doc

斑马鱼胚胎发育的分期斑马鱼胚胎发育的分期CHARLES B. KIMMEL, WILLIAM W. BALLARD, SETH R. KIMMEL等 原著俄勒冈大学神经生物学学院；达特茅斯学院生物系黄万旭 译浙江大学生命科学学院摘要：我们对斑马鱼（zebranfish, Danio rerio）胚胎发育的分期作了一系列的阐述。我们定义了胚胎发育的七段时期（period）合子（zygote）、卵裂（cleavage）、囊胚（blastula）、原肠（gastrula）、分节（segmentation）、咽囊（pharyngula），以及孵化期（hatching period）。这一划分强调了发生于受精后头3天的主要发育过程中的变化情况，同时我们也回顾了发生于每一时期的诸如形态发生及其他主要事件。时期的下一划分单位是分期（stage）。各分期都有名称，而非标号，反映了分期序列的灵活性和持续演变过程，因为我们从这一物种中还能得到更多。各分期的命名是基于用解剖立体显微镜（dissecting stereomicroscope）观察活体胚胎所容易观察到的形态学特征为依据的，同时也充分利用了活体胚胎的透明性，这一性质使我们可以用组合显微镜（compound microscope）和Nomarski干涉相差照明（Nomarski interference contrast illumination）观察到即使很深层的结构。显微照相（photomicro-graphs）和组合显微描图（composite camera lucida line drawings）则以图片刻画了每一分期。此外还有一些图像则显示了发育过程中一些可用作分期辅助标志的显著特征。关键词：斑马鱼，形态发生，胚胎发生，合子，卵裂，囊胚，原肠，分节，咽囊，孵化目 录概 述1全文组织结构1步 骤3温度与标准发育时间8合子期（0-0.75h）9卵裂期（0.75-2.25h）9囊胚期（2.25-5.25h）12原肠期 (5.25-10h)16体节期（10-24h）21咽囊期（24-48h）33孵化期（48-72h）42早幼期48谢 辞4853概 述分期为发育研究提供了准确度。这是因为不同的胚胎即使在同一群体中一起生长，其发育亦有不同程度的差异，我们已看到在斑马鱼发育过程中出现的不同步性。体外同时受精产生的胚胎，孵育于温度合适的稀疏环境（28.5，5-10个胚胎/ml），最早期即出现不同步性，并随时间延续愈加显著。通过对比显示，不同群体中的差异比同一群体中的更大。基因差异能部分说明而不能完全解决这一问题，因为即使来自同一斑马鱼克隆系的胚胎其发育亦有不同步性。就不同胚胎而言，通过形态学标准分期可部分解决这一问题。例如，头部的原始三叉神经感受神经元（primary trigeminal sensory neurons）和躯干的原始运动神经元（primary motoneurons）都是在体节连续沿体轴出现这段时期内开始轴突发生的。通过体节数目分期比通过受精后逝去的时间分期能更准确地预测这些神经元在发育过程中的位置。参照分期序列来记录实验能提供很好的方式确保实验的再现性，并允许随后加入新的观察结果和数据。一系列基于形态学的划分同时也有利于交流，“18-体节胚胎”比“受精后18小时胚胎”这一称谓含有更丰富的意义，尤其在交叉物种比对中。以往的斑马鱼发育分期尽管不如目前的完善，也相当准确地反映了头一天的胚胎发育，并提供了多组有用的图片（Hisaokaand Battle, 1958; Hisaoka and Firlit, 1960）。Warga 和 Kimmel （1990）简要地描述了囊胚期和原肠期。本系列分期的先前版本见于已出版和发行的斑马鱼手册（The Zebrafish Book，Westerfield,1994）一书。新版做了细微的修正和补充，更新版本可以电子版形式在http:/zfish. 获得。表1. 早期发育的各时期时期h描述合子0新受精的卵子完成首个合子细胞周期卵裂0.75细胞周期2至7快速同步发生囊胚2.25快速间时同步（metasynchronous）细胞周期（8，9）在原肠中期转变中变为延长的异步（asynchronous）周期；随后外包（epiboly）开始原肠5.25内卷（involution）、聚合(convergence)和延伸（extension）等形态学运动形成上、下胚层和胚轴；持续到外包运动结束分节10体节、原始咽弓和神经原节（neuromeres）发育；原始器官发生；开始运动；尾部出现咽囊24种系期（phylotypic-stage）胚胎；体轴由先前绕卵黄囊的弯曲状态开始伸直；循环系统、色素沉着和鳍开始发育孵化48原始器官系统完成快速形态发生；软骨在头和鳍中发育；陆续开始孵化早幼72鳔膨胀；觅食及积极的躲避行为全文组织结构我们命名了每一分期，而不是像其他序列那样使用数字编码，因为命名的分期更为灵活且易于记忆和识别。分期的定义不是一个瞬间的时刻点，而只是一个用以近似定位连续发育过程中一小段时间的手段。有了分期命名，我们就可以很容易地加入所知细节，或是为了某一特定的研究在序列中插入一个新的分期，而无需求助于诸如小数、负数、正数这类令人生厌的工具。例如：我们现在描述了一个5-，随后又描述了一个14-，但一项特定的研究可能要用到其间的8个分期（6-体节，7-体节等等），此时我们可以立刻明白其含义（而不必再行描述）。我们强调的是，这里不作描述并不意味将其排斥于分期之外。表2. 胚胎发育的分期a分期hHB描述合子期1-细胞01，2胞质流向动物极，形成胚盘卵裂期2-细胞0.753部分卵裂4-细胞1422排列的卵裂球8-细胞1.25524排列的卵裂球16-细胞1.5644排列的卵裂球32-细胞1.757规则的2层卵裂球，有时48排列64-细胞28规则的3层卵裂球囊胚期128-细胞2.2595层卵裂球；卵裂面不规则256-细胞2.57层卵裂球512-细胞2.759层卵裂球；NO：YSL形成1k-细胞31011层卵裂球；NO：单排YSL核；卵裂细胞周期轻度不同步高囊胚3.3311层卵裂球；胚盘开始变平；NO：2排YSL核；分裂不同步椭形3.6611胚盘变平产生椭球形；NO：多排YSL核球形412球形；胚盘与卵黄之间为水平边界穹顶4.3313仍为球形；当外包开始时，卵黄细胞向动物极顶起30%-外包4.6614胚层如倒置杯状不均一增厚；边缘达动植物极距离30%原肠期50%-外包5.25胚层厚度仍不均一胚环5.66胚环在动物极可见；50%-外包胚盾615胚盾在动物极可见；50%-外包75%-外包816背侧明显增厚；可见上下胚层和排泄（evacuation）区90%-外包9脑原基增厚；脊索原基从节板分离尾芽1017尾芽显著；脊索原基从神经突（neural keel）分离；早期小膨出（polster）；神经突前侧出现中间矢状沟；100%-外包体节期1-体节10.33第一体节沟5-体节11.6618小膨出显著；视囊，Kuperffer囊14-体节1619EL=0.9mm；眼基板；脑神经元，V形躯干体节；NO：前肾导管20-体节1920EL=1.4mm；0.5YE/YB1；YB/HD=2;早期触碰反射和简单的应激运动；视网膜色素沉着；背侧条带达12体节；弱循环；主动脉至尾端一半；主静脉编织；浅胸鳍芽；直尾；NO：尾端细胞退化；第1大动脉弓血液循环原基-2536EL=2.7mm；HTA=75；OVL=1；PF(H/W)=3/4；早期运动；尾部色素沉着，背部条纹加深；强循环；单一大动脉弓对；主静脉达尾部3/4； NO：PF顶端上胚层缘高胸鳍42EL=2.9mm；HTA=55；1/2OVL1；YE/YB=1.5;YB/HD1.3;PF(H/W)=1；去绒膜胚胎游动后背上位静息；YE仍为锥形；PF顶端上胚层缘显著；早期侧带；完整的背侧带；黄素细胞仅见头部；虹膜色素细胞仅见视网膜；心包显著；NO：心腔；血管段；颚弓和舌弓；前肠发育；嗅觉纤毛；耳囊壁增厚孵化期长胸鳍48EL=3.1mm；HTA=45；OVL=1/2；PF(H/W)=2；背上位静息；YE开始变细，PF突出；背腹侧条纹汇于尾部；侧带约6个黑素细胞；视网膜上虹膜色素细胞丰富；头部显著黄色；NO：循环见于2-4大动脉弓及血管段；嗅觉纤毛摆动；半规管（semicircular canal）；神经丘（neuromast）胸鳍60EL=3.3mm；HTA=35；运动迅速难以分辨；YR变细融入YB；侧带约10个黑素细胞；PF变平成鳍形，有明显的循环；视网膜虹膜色素细胞环加深；虹膜色素细胞出现于背侧；NO：PF软骨和角质鳍条（actinotrichia）；肠道；耳囊分2腔；早期颌软骨；循环于5-6大动脉弓；口仍小，开于腹侧眼中线突口72EL=3.5mm；HTA=25；宽口突出于眼前方；虹膜色素细胞出现于卵黄带；虹膜色素细胞覆盖眼部一半；背部黄色与头部色调同；NO：腮裂和腮丝芽基；腮弓1-5软骨；鳃盖覆住1-2腮弓；匙骨（cleithrum）a EL：胚体长度；PF：胸鳍；HB：Hisaoka 和 Battle (1958)斑马鱼分期大致序列（一直到HB分期20大致准确）；HD：背侧观头部直径；NO：Nomarski optics；H/W：高/宽；YB：卵黄球；YE：卵黄延伸部；YSL：卵黄合胞体层；HTA：头-肢角；OVL：耳囊长度为从更广的视角观察发育过程，我们将数个分期归为一组，形成更长的时间段称为时期（表1），并在文中总结了发生在这些时期内的主要事件。术语表中定义了一些特定的术语，文中黑体字强调的术语在分期中是重要的。表2对各个分期作了简要的描述，而图1则展示了相应的草图。我们可以利用这些资料大致定位我们所感兴趣的一个分期，然后尽可能在文中和其他图中找到更多细节。步 骤分期我们可以通过使用立体显微镜观察活体胚胎来大致确定发育分期，通常用透射光（而非反射或入射光）以及高放大倍数（约50）。在体节期尾部伸长，如果胚胎仍处于绒膜（chorion）内，尾部最终将环绕驱干和头部，以致不易观察。此时，我们必须将胚胎移出绒膜，可以使用5号镊子（forceps）手工移去，也可用蛋白溶解酶（proteolytic enzyme）处理。咽囊晚期，一旦受到触碰，胚胎（如已去除绒膜）会反射性游走，这种情况下，可用0.003%三卡因（tricaine）以麻醉之。反复麻醉和冲洗会严重阻滞随后的发育，虽然看起来似乎轻微。Nomarski光学系统装有Nomarski微分干涉相差光学系统和倍率15至40的物镜的组合显微镜能揭示活体标本更多的细节，利于精确分期。例如，Nomarski光学系统可在囊胚期和体节期实现最精确的细胞和体节计数。此外，“原基”期（”prim” stages）指后侧线原基（primordium of the posterior lateral line）这一结构的位置，我们必须利用Nomarski光学系统以准确确定大部分咽囊期的一些分期。将胚胎麻醉、去除绒膜，并置于桥接盖玻片之间以利于观察和随后的恢复。 图 1. 斑马鱼胚胎发育各分期显微扫描图。早期动物极位于顶端，后来前缘成为顶端，例外的是原肠胚的胚环和胚盾期在其侧面观的图片下显示了相应的动物极（AP）观图片。卵裂期和囊胚期图片为正面观。胚盾期后为胚胎左侧观，但在胚盾出现前并不能确切地分辨哪一面是左侧。 这里忽略色素沉着。 箭头指示了以下分期判定的一些关键特征：1k-细胞期：YSL细胞核；穹顶期：隆起的卵黄合胞体；胚环期：胚环；胚盾期：胚盾； 75%外包期：Brachet裂缝；90%外包期：胚层外围包裹卵黄；尾芽期：小膨出；3-：第3体节；6-：眼原基（上方箭头）、Kuperffer囊（下方箭头）；10-：耳基板；21-：晶状体原基；原基-6期：后侧线原基（背侧观）、孵化腺（卵黄球上）；原基-16期：心脏；高胸鳍期：胸鳍芽。比例尺=250m 对活体胚胎进行分期总是比将其致死和固定后再分期要好。例如在伸直和孵化期间的分期需要对头部大小和卵黄质量进行对比，而固定期间会造成不同程度的收缩而破坏了正常的关系。然而，如果保存良好，我们可以利用其他标准相对可靠地对固定或完全包埋的胚胎进行分期，但切割后则不易分期。成像所附图片均为活体胚胎，后期为麻醉处理。原始图片被制作为彩色幻灯片（柯达 Ektachrome 160T DX），而黑白插图由中间底片复制而成。彩色幻灯片可付费向作者索取。显示整个胚胎的低倍图像由Zeiss STEMI立体显微镜获得：将胚胎置于凹槽载片的标准介质中，而不需要盖玻片，介质中含有1.5-3%甲基纤维素（methyl cellulose）以利于预期定位。显示部分胚胎的高倍图像由Nomarski光学系统（通常配合Zeiss 40浸水物镜）摄得，使用Zeiss UEM组合显微镜。将胚胎包埋于盖玻片之间，有时加1%琼脂以固定。 温度与标准发育时间我们将分期信息转换为“标准发育时间”，用字母h表示，定义为在28.5这一适宜温度孵育下受精后的小时数。孵育在其它温度下会改变发育速度，而这在特定研究中可能会有用。例如，使两个胚胎在某一时间达到不同的分期以作异时移植。对孵育于不同温度下的胚胎进行对比须谨慎进行，因为不能保证当温度变化时胚胎所有特性均随发育速度作同步变化。然而，若是将胚胎保存在25-33范围内，其发育似乎正常，超出这一范围温度作长时间孵育将出现异常。图2显示了在极值点的发育速率，图右侧的说明提供了一个简单的公式可用以估算出这一范围内的任一温度下胚胎发育所能达到的某一分期。图 2 . 孵育于25和33的胚胎孵育速度。A：尾芽期，B：突口期。纵轴为28.5标准温度下孵育的分期。可以想象，28.5下的发育曲线为通过原点的直线，斜率1.0。注意到25和33下的发育曲线均为直线，且斜率在两图中几乎相同。因此发育速度随孵育温度而变化，可用以下公式估算任一温度下达到某分期所需发育时间：HT =h/(0.055T-0.57). HT为T温度下的发育时间，h是在28.5下达到某分期所需时间（见表1）。分期缩写：c: cell, d: dome, s: shield, b: bud; s: somite, p: prim, hp: high-pec, lp: long-pec, pf: pec-fin, pm: protruding-mouth. 方法：对自然产卵形成的胚胎进行观察，分3组，每组20-30个胚胎，孵育于150ml大烧杯。用多项指标确定分期，并确保取出观察的胚胎与保留在烧瓶中的无发育差异。因为吹打、去绒膜、麻醉等处理会显著阻滞发育，如此处理的胚胎比长胸鳍期的对照组晚2-6小时。合子期（0-0.75h）新受精的卵子直至其第一次卵裂发生，称合子期（图3），约受精后40分钟。受精时形成的合子直径约0.7mm。合子期只含有一个分期，但其间也发生很多变化，可以很容易划分这一时期（见Hisaoka and Battle,1958）。合子期的分期1-细胞期（0 h）.绒膜膨胀并脱离新受精的卵子（图3A）。受精同时也活化胞质运动，约10分钟内很容易看到。非卵黄胞质开始向动物极流动，促使胚盘和卵黄颗粒丰富的植物极胞质分离（图3B）。这一分离在卵裂早期仍在继续。 图 3 . 合子期。A：受精后数分钟，绒膜膨胀。B：受精后约10分钟，动物极朝上的去绒膜合子。非卵黄胞质开始分离进入动物极。比例尺=250m卵裂期（0.75-2.25h）首次卵裂形成的两个细胞，或称卵裂球在间隔15分钟后分开（图4，5）。胞质分裂为部分分裂，只是在胚盘底部不完全切开，卵裂球仍通过胞质桥结构相连。这一时期的6次卵裂通常按规则的方向方向发生，因而我们可以通过卵裂球的排列知道其数目，而不必一一计数。这一时期和下一时期的早期都可用Nomarski光镜划分每细胞周期以实现精确分期。胚盘中所有细胞都同时或近似同时地完成细胞周期。约在细胞周期的前半部分，即细胞间期，细胞核存在且可见，核形态也发生系统性变化（见下，图10）。每个早间期细胞核都是球形的，晚间期为类球体，其后随细胞进入有丝分裂，核逐渐变为椭球体，直至有丝分裂前期消失。椭球体的长轴指示了随后卵裂的取向。有丝分裂期的染色体很难看到。近有丝分裂晚期，在胞质分裂之前，卵裂球形状变得更圆。卵裂期的分期2-细胞期（3/4 h）.结束第一个合子细胞周期的首次卵裂形成的卵裂沟是垂直的，一直到32-细胞期都是如此。卵裂沟在近动物极形成，迅速向植物极伸长，只经过胚盘区域而不经过卵黄区域（图4A）。在近于胚盘底部，卵裂沟变为水平方向，以Wilson（1889）最早描述的黑鲈（sea bass）那种方式切割胚盘，但仍只是部分与底下的卵黄区域分开。形成的两个卵裂球体积相同，似乎不易相互区分。随后的几次分裂严格按第一次分裂的方向进行，然而最终的身体对称轴（即背腹轴和前后轴）似乎并不能完全由卵裂方向决定（Kimmel and Warga, 1987; Abdelilah等, 1994; Helde 等, 1994），而有些报道则认为可以（Strehlow and Gilbert, 1993; Strehlow等, 1994）。4-细胞期（1 h）.两个卵裂球不完全裂开（图4B），裂平面以合适角度穿过动物极和第一次卵裂面。因而第三细胞周期开始于22排列的4个卵裂球。从动物极看（见图6）胚盘呈椭球体，而第二次卵裂面是沿长轴方向的。图 4 . 卵裂期胚胎。除B外均为正面观，B显示的是胚胎在动-植物极的扭曲，约偏离正面45。 A :2-细胞期（0.75 h）；B：4-细胞期（1 h）；C：8-细胞期（1.25 h）；D：16-细胞期(1.5 h)；E：32-细胞期（1.75 h）；F：64-细胞期（2 h）。比例尺=250m图 6. 动物极观，前5次卵裂平面示意图。外圈为卵黄，A内部椭圆为未分裂的胚盘。B-F为连续的卵裂，奇数次卵裂沿短轴切割胚盘，偶数次卵裂沿长轴切割胚盘。引自Kimmel 等 (1991)，经Wiley & Sons子公司Wiley-Liss John Inc惠允。图 5 . 受精后（在28.5），卵裂球数目随时间变化的理想曲线，此段时间卵裂发生较为同步，在第10细胞周期的囊胚中期转变之前。8-细胞期（1.25 h）.卵裂发生于第3细胞周期结束，仍为不完全卵裂。两个独立的卵裂面与第1次卵裂面平行，将胚盘切割为24排列的卵裂球。由于去绒膜胚胎通常侧躺于培养皿，其4-细胞面（而非2-细胞面）正对观察者。此“正面”观（Kimmel and Law, 1985a）沿奇数卵裂面（卵裂沟1和3可见，图7）。一直到囊胚晚期去绒膜胚胎总倾向于以此方向平展开，图1第一部分（到高囊胚期）、图4（4B除外）和图7均为此“正面”观所得。16-细胞期（1.5 h）.第4组卵裂同样沿两个面进行，均与第2次卵裂面平行，产生44排列的细胞，须小心与8-细胞期鉴别，因为其正面观很相似（图4C,D）。第一次出现部分细胞完全与其他细胞分离，这些细胞是位于最中心处的4个卵裂球。此四分体在图6E中完全被其他细胞包绕。全分裂发生于近16-细胞期末，因为此次卵裂沟先从胚盘中心底部切开，再向外围延伸。实际上，作底部切开的卵裂沟并未到达外围，包围此四细胞的12个细胞（称外围卵裂球）仍与卵黄细胞通过胞质桥相连（Kimmel and Law, 1985a）。此分期之后直到囊胚中期，每次卵裂均能完全或大部分分离非外围卵裂细胞，仍不能完全分离外围卵裂细胞。图 7. 卵裂期正面观显微扫描示意图，显示从4-细胞期一直到64-细胞期卵裂球的世系关系。各卵裂球根据期世系标号，同时也指出其位置。每一标号代表胚胎中的两个细胞，其中一个在图中可见，而另一个须将胚胎沿动-植物极轴旋转180才可看到（比如，此处在4-细胞期只显示2个细胞）。在4-细胞期，细胞L处于第1次卵裂面左侧，细胞R处于右侧（因此，这里的标号L和R并非指未来胚体的左右侧；见正文）。细胞L分裂产生L1（更靠近动物极）和L2。L1分裂产生L11（更靠近动物极）和L12，如此等等。对于64-细胞期，深层细胞没有绘出。引自Kimmel and Law (1985a)，经由Academic Press惠允。32-细胞期（1.75 h）.第5细胞周期结束时的卵裂通常发生于四个平行面，而不是位于第1和3卵裂面之间两个平面。然而此时，斜向卵裂沟很明显。通常32细胞呈48排列，但除规则排列之外，不规则排列也很常见。侧面观，在外围和动物极之间常可见双层细胞。这是因为胚盘平面弯曲，外围细胞更近于植物极，其中的部分细胞排到了靠近动物极的非外围细胞之前。64-细胞期（2 h）.第6次细胞周期结束时的卵裂是水平的，所以从动物极看细胞排列和32-细胞期很相似，只是正进入第7次细胞周期的卵裂球体积较小。侧面观，细胞堆叠明显变高（图1，4F，7）。第一次出现部分细胞完全覆盖其他细胞。被覆盖的细胞（或称深层细胞）都是由32-细胞期的4个中心细胞中每个分裂产生的两个子细胞中的一个构成；而另一个则仍处于表面，形成胚盘的最上层此时称包被层（the enveloping layer , EVL）。与此同时，每个外围细胞的水平卵裂也产生两个EVL细胞，所以64-细胞期正面观似有三层EVL细胞（图7）。囊胚期（2.25-5.25h）囊胚期指从128-细胞期或第8次合子细胞分裂开始形成球形胚盘直到第14次卵裂开始原肠期为止这一段时期。此期有很多重要事件发生：胚胎进入囊胚中期转变（midblastula transition, MBT）、卵黄合胞体层（the yolk syncytial layer, YSL）形成、外包（epiboly）开始。外包将一直持续到原肠期。此期用“实囊胚”（ “stereoblastula”）称之可能更准确，因为这一术语意味着胚胎还没有形成囊胚腔（blastocoele），而事实正是如此（图8），仅在胚盘深层细胞之间存在不规则的间隙。卵裂取向不确定，比卵裂期亦更不规则。此后卵裂产生的子细胞从整齐的细胞面伸出，不论从侧面还是从顶面观都是如此，因而确定此期分期用细胞大小判断比用细胞位置判断更为有效。从动物极观，胚盘呈轻度椭球形（尤在早期）。图 8 . 囊胚期胚胎正面观。A：256-细胞期（2.5h）；B：高囊胚期（3.3h）；C：高囊胚期和椭形期之间的转变（3.5h）；D：椭形期和球形期之间的转变（3.8h）；E：穹顶期（4.3h）；F：30%-外包期（4.7h）。比例尺=250m囊胚早期细胞继续同步分裂，和之前节奏相同（图5，9）。更准确的说，囊胚早期的分裂为间时同步，因为有丝分裂并不完全同时发生，相反，在每个细胞周期末期，一条波线穿过胚盘，近动物极细胞最先进入波线，外围细胞最后进入。波线一般斜穿胚盘，以致从正面观可见波线沿胚盘长轴穿过细胞野。图 9. 囊胚中期转变过程中细胞周期的延长和同步性的减弱，开始于第10合子周期（512-细胞期）。A中不同的标点表示从三种不同的胚胎中收集的数据；B中的分布表示一种胚胎中单个细胞周期的延长。引自Kane and Kimmel (1993)，经Company of biologists Ltd. 惠允。细胞周期延长标志着囊胚中期转变（MBT）的开始（图9A）。并非所有细胞周期都同时延长或延长相同程度（图9B）。MBT开始后的任意时刻，一些细胞处于间期，可用Nomarski光镜很容易看到细胞核（图10A,D），而另一些细胞处于有丝分裂期（无核，图10C,E），因而形态学上可明显看到不同步性。MBT开始于第10次细胞周期（512-细胞期），比爪蟾（Newport and Kirshner, 1982a,b）早两个细胞周期，然而MBT的一些性质以及如何控制开始，在两物种间相同（Kane and Kimmel, 1993）。随间期延长，细胞可以移动，RNA合成增加。时滞分析（time-lapse analysis）显示MBT开始后深部细胞在其长的间期内可动，其运动似无方向性，至少表面上如此。囊胚早期的外围细胞层则有所不同。它们紧挨着卵黄细胞排列并在整个卵裂期都与之通过胞质相连。从第10细胞间期开始（Kimmel and Law,1985b），外围细胞经历了一次塌陷，其细胞质和细胞核均留在与其紧密相连的卵黄细胞质中。因此形成卵黄合胞体层（yolk syncytial layer , YSL），这一结构用Nomarski光镜可明显看到，对分期也很重要（图10）。YSL形成后，原先在胚盘第二层的EVL细胞成为最外层。它们看起来和先前的最外层相似，但有一个重要的不同点在于此时的外围细胞是非合胞体的：这也是第一次出现所有卵裂球均不与其它细胞通过胞质桥相连，除了那些新分裂仍短时间相连的子细胞对之外。虽然YSL正好在MBT期间形成，但二者的调节机制似相互独立。MBT独自依赖于核-质比（nuclear-cytoplasmic ratio , Kane, 1991）。YSL的核在囊胚中期继续进行有丝分裂，但核分裂并不伴随胞质分裂，卵黄细胞仍不分裂并仍保持合胞体。由于在胚盘，囊胚中期YSL分裂周期延长，但又并非延长同样多，YSL核继续进行间时同步分裂，并非不同步。约3个细胞周期之后，在外包开始同时，YSL分裂突然中止(Kane et al., 1992; 另见 Trinkaus, 1992)。YSL核开始增大，可能表示其正在活跃地转录RNA。YSL是硬骨鱼（teleosts）特有的结构，可能为胚外器官，对胚体无直接贡献。起先YSL以窄环包绕胚盘边缘（图10），但很快（两个细胞周期内）其延伸到胚盘底部，形成完全的“内在”合胞体（“internal syncytium, the I-YSL）并一直持续到整个胚胎发生。I-YSL在胚胎细胞及其卵黄储备之间的位置上，推测其可能发挥滋养作用。相应的另一部分，E-YSL，在外包期间暂时性位于胚盘边缘的“外部”。实际上，对硬骨鱼类的克鲤鱼（Fundulus）的研究显示，E-YSL这一区域在外包过程中有重要促进作用（Trinkaus, 1984）。外包（epiboly）始于囊胚晚期（Solnica-Krezel and Driever, 1994），是YSL和胚盘变薄延伸覆盖卵黄细胞的过程。就正如向头上戴一顶滑雪帽一般，最终在原肠期结束时将卵黄完全吞入。在这一形态发生运动的早期，胚盘高度变薄，从高高隆起的细胞堆叠（图8B）变为几乎同一厚度的杯状多层细胞（图8F）。最内部的细胞向外移动达到表层，标志外包运动完成，内部细胞逐步运动过程中随机与表层细胞混合（Wilson et a1.,1993）。这些所谓的激进插入者（Keller, 1980）引起积极的细胞重组也是早期外包运动的驱动力之一。插入细胞并未驱动深层细胞进入包被层（EVL），EVL仍是独立的单层（Kimmel et al., 1990b）。此外，外围深层细胞其融合程度远比中心细胞轻（Helde et al., 1994），如图8所示，外包开始前，细胞堆积很厚。外围细胞融合的相对不足对相应的早期发育建立意义重大，这是因为中胚层将从这些非融合的外围深层细胞开始（参见下文命运图，图14）。假定标示中胚层的事件如同爪蟾中似乎出现的那样始于外包之前，那么外围深层细胞群在外包期间相对融合不足可能在维持不同细胞“规格”（Kimmel et al., 1991）或特征中有重要作用。图 10 . 卵黄合胞体层（YSL）的形成，由Nomarski光镜观察所得。A：第10细胞周期间期的外围卵裂球（512-细胞期，箭头指示其细胞核）。B：当细胞进入有丝分裂期，核消失，特殊的是无胞质分裂，核分裂产生的一对子细胞核在第11细胞周期间期再次出现于胞质中。在每一间期早期核均为球形（C），随后，在再一次进入有丝分裂期之前，核变大呈橄榄球形（D）。YSL核在有丝分裂期再次消失（E：第11次有丝分裂，注意到间期细胞核只在胚层细胞中出现，而不是在YSL中，意味着胚层和YSL已不再同步），间期又再次出现（F：第12细胞周期间期），如此经过数个有丝分裂周期，总是位于公共的合胞体内。引自Kimmel and Law (1985b)，经Academic Press惠允。比例尺=50m在激进插入发生的同时卵黄细胞也发生明显的形态变化，I-YSL表面向动物极膨出或是“隆起”，这一变化是外包开始最明显的标志（图8E），同时也大大增加了I-YSL与胚盘内表面的接触面积。卵黄细胞由于隆起而占据了深层细胞因激进插入而空出的区域，同时也对深层细胞的外移施加了驱动力。不论外包运动的结果如何，它都很明显同时包括了胚盘和卵黄细胞的运动，并且迅速发生。在随后的数小时内，随外包的继续，E-YSL也继续前行，穿过卵黄直达依附其上的细胞前方。至少在克鲤鱼，桥粒（desmosome）有助于将E-YSL和EVL边缘连接起来（Betchaku and Trinkaus, 1978），而不断伸展的YSL似乎将EVL丢在了后边。外包似乎有赖于功能微管（Strahle and Jesuthasan, 1993）并可能受控于早期作用的合子基因（Kane, 1991）。目前已知最早表达的基因编码位于局部的推定转录因子（putative transcription factors）并在囊胚晚期表达（如notail基因，Schulte-Merker et al., 1992；goosecoid基因，Stachel et al., 1993；snaill基因，Thisse et al., 1993）。在囊胚期EVL也发生变化。在卵裂期结束时EVL细胞数比深层细胞数多，但随着连续分裂EVL细胞数目大增，EVL变平、变薄，明显延伸最终形成密封的更难看到的上皮单层。囊胚晚期，EVL细胞周期比深层细胞周期更长，并表现出更少的同步性。同时EVL细胞也有了世系限制，其细胞分裂产生的子细胞总在EVL内。但其发育潜能在囊胚晚期似并未受到限制，如将其逐个移至深层细胞，其子代将获得新的分化方向。囊胚期的分期128-细胞期（2.25 h）.第8细胞周期始于128个细胞排列成高的细胞堆叠，位于卵黄细胞之上，呈紧密半球形。与早先卵裂不同，这一结束64-细胞期的卵裂沟很不规则，以至于此后几无例外无法从细胞位置推断其祖系。然而我们仍然可以判定某侧面观是对应于先前的奇数次卵裂面（正面观，见前文）还是偶数次卵裂面，因为胚体仍和4-细胞期描述的那样为椭球形。从正面观，EVL细胞在动物极和外围之间排列成约5个不规则的层。256-细胞期（2. 5 h）.第8组卵裂结束时的正面观（图8A）显示EVL细胞形成7个不规则的层。在第细胞间期，EVL细胞高度变薄，深层细胞数目大大超过了EVL细胞数目。第9次卵裂也是最后一次高度同步或间时同步的分裂。512-细胞期（2. 75 h）.此期开始囊胚中期转变；细胞周期在后几次分裂中不断延长（图9A）。正面观，在动物极和外围之间有9个不规则的层。在此期的后半部尤其在正准备进入第10次有丝分裂时，外围细胞（第一层EVL细胞）失去其连接卵黄细胞的底部边界（图10A,B）。这一形态学变化预示着YSL形成的开始；外围细胞在第10次有丝分裂后特异性地不进行胞质分裂。第10次卵裂相当同步，以致我们在1分钟左右的时间里仍能看到所有细胞（包括卵黄细胞）都处于有丝分裂期（即无间期细胞核，图10C），512-细胞期是可能发生此类情况的最后一个细胞周期。1 k-细胞期（3 h）.我们常可看到YSL形状不规则并将共约20细胞核包含在围绕胚盘边缘的单一环中（图10D）。第10次卵裂后的细胞数少于1024，因为在前一分期第一层（最外层）EVL细胞被并入了YSL。此外，还因为YSL的形成方式，此期组成第一层YSL的细胞是前一分期第二层YSL细胞的子细胞。在某些胚胎，YSL经由两个细胞周期才形成，其开始时间可能早于也可能晚于1 k-细胞期。YSL约有11层细胞。第11组有丝分裂的发生犹如波线穿过胚盘，这也是最后一次发生此种情况。在此期间，第一次可以看到许多细胞与其它细胞不同步，一些由间期细胞核，一些则没有。高囊胚期（3.25 h）.此期标志着胚盘“高耸”于卵黄细胞之上的终结（图8B,C）。在外围细胞和YSL相遇处仍有一紧缩的环，或称缢痕。可以通过胚盘细胞和YSL细胞核的外形和数目来区别高囊胚期与其前面的分期。侧面观可见在外围和动物极之间有至少11层EVL细胞。在整个高囊胚期胚盘的任一区域总有一些细胞处于间期，而另一些细胞则处于有丝分裂期。大部分胚盘细胞已完成第12次合子细胞周期，而有一些在此期已完成第13个合子细胞周期。YSL仍是薄的环形，但其外周轮廓更为平滑。YSL细胞核在其第2次分裂（第11次卵裂）时再次出现，通常仍都处于胚盘边缘之外，并相互包裹得更紧密（图10F）。椭形期（3.66 h）.随着胚盘向卵黄的压缩，动-植物极轴变短。可以想象，这是由于表面持续增加的张力引起的。自从1-细胞期非卵黄细胞质升高开始形成的胚盘外围缢痕在此期减弱（图8C）直至消失。最终从侧面观胚盘变为轮廓平滑的椭球形，因而此期被称为椭形期。此时，卵裂高度不同步，其中许多处于第12或13次细胞周期。EVL此时极薄，须用Nomarski光镜仔细观察才能看到。YSL在胚盘底部伸展开，同时也与胚盘分离。在此期间，YSL核形成数排，其中一些细胞核永久地留在了I-YSL。球形期（4 h）.动-植物极轴的持续缩短使得囊胚晚期变为平滑的近球体。其整体形状在此后数小时内略有变化，很好地进入了原肠期，而细胞重排比以往任何发育阶段都要快。可通过对胚盘下部和卵黄细胞上部的I-YSL深层平面聚焦，根据其形状区分球形期与其后的穹顶期，在前者该平面是平的或近于平的（图8D）。此期大部分胚盘细胞处在第13次细胞周期，在EVL,此期尤其长，以至于EVL中很少发生有丝分裂。E-YSL通常比前期明显变薄，大部分YSL细胞核是内在的。YSL发生最后一次核分裂。通常，去绒膜胚胎动物极开始竖起，而不是像先前那样倒在一边。穹顶期（4.33 h）.I-YSL表面深入胚盘，开始向动物极隆起（图8E）。这一发生于卵黄细胞和胚盘界面的显著而快速的变化是外包运动开始的确切信号。EVL细胞处在较长的第13细胞周期，而许多深层细胞已进入第14细胞周期。E-YSL开始变窄（Solnica-Krezel and Driever, 1994）。YSL细胞核处于有丝分裂后期，也就是说，与穹顶期前的有丝分裂期相比，此时的细胞核总是可见的，它们开始变大，很容易看到。30%-外包期（4.66 h）.外包运动，包括卵黄细胞的隆起，产生所谓的胚层（blastoderm），厚度几乎一致（图8F）。此时的胚层包括高度平坦的EVL单层（须用Nomarski光镜严格聚焦于胚层表面，否则不易见）和约4层细胞厚的深层细胞多层（deep cell multilayer , DEL）。胚层包被卵黄的程度提供了极有用的分期指标。我们定义外包百分率（percent-epiboly）指从此期开始直至外包结束胚层所包被卵黄的程度。覆盖百分率（percent-coverage）可能会更准确地表达这一意思，但外包百分率着重于过程，且使用更为广泛。因此，30%-外包时，是指沿动-植物极轴估计，胚层边缘达动-植物极距离的30%。此期许多胚胎的胚层厚度并不严格一致。由于囊胚绕动-植物极旋转，从侧面观察将会看到其边缘某一区域明显比其它地方薄而平。这一区域将发育为胚胎背侧（Schmitz and Campos-Ortega, 1994）。用低倍Nomarski光镜最容易观察到这一不对称性。然而要完全确定背侧尚需等到胚盾期（6 h）。原肠期 (5.25-10h)外包运动的继续，以及形态发生细胞的内卷（involution）、集合（convergence）和延伸（extension）运动的发生，产生了原始胚层和胚轴。内卷运动的开始意味着原肠期的开始，目前可以说是发生于50%-外包时（图11A）。结果在达到50%-外包后的数分钟内出现了一个增厚的外围区域，称作胚环（germ ring），几乎与此同时完全包围了囊胚边缘（图11B，及C箭头所指）。随后集合运动几乎同样快速地沿胚环产生一个局部的堆积，称胚盾（embryonic shield , 图11D，及E箭头所指）。在发生这些事件期间，外包暂时中止，但胚盾形成后外包又继续。胚层边缘沿卵黄细胞延伸直至将其完全包绕（图11F-L）。其延伸近乎恒定速度进行，约每小时包绕卵黄细胞的15%，这也提供了大部分原肠期分期的有用指标（图12）。正因为囊胚期没有囊胚腔，原肠期既没有消化道（archenteron），也没有胚孔（blastopore）。DEL细胞在胚层边缘进行内卷，因而发挥了胚孔的作用。内卷通过将胚层向后折叠形成胚环。因此，胚环内由两个胚层：位于上方的称上胚层（epiblast），在整个原肠期继续给位于下方的下胚层（hypoblast）提供细胞。注意到上、下胚层这些术语可同样描述鸟类胚层结构，但所命名的胚层在这两种脊椎动物中似乎完全不同。图 11 . 原肠期发育。除特别标注外均为左侧观，前侧朝上，背侧朝左。A：50%-外包期（5.25h）；B：胚环期（5.7h）；C：动物极观胚环期，箭头指示胚环，胚盾将发育于胚环右下方的平坦区域；D：胚盾期（6h），胚盾标志背侧，是胚环左侧增厚区域；E：动物极观胚盾期，箭头指示胚盾；F：70%-外包期（7.7h），左边的胚层背侧比右侧的胚层腹侧厚，前轴下胚层或脊索前板（prechordal plate，箭头所示）延伸近动物极；G：70%-外包期腹侧观，但微向前侧倾斜以显示此时很明晰的轴下胚层（箭头所示）的脊索前板；H：75%-外包期（8h），箭头示腹侧薄的排泄区；I：80%-外包期（8.4h）背侧观，箭头示轴中胚层与中线边界，近轴中胚层在其一侧；J：90%-外包期（9h），在一些胚胎中可见尾芽（箭头所示）；K：90%-外包期腹侧观，前侧脊索前板（对比G）增大为小膨出；L：尾芽期（10h），箭头示小膨出，短箭头示尾芽，尾芽腹侧（即此图左侧）的显著区域显示外包结束时卵黄消失处。比例尺=250m发育时间（h）外包百分率图 12. 外包期间胚层边缘覆盖卵黄前行的速率理想曲线（在28.5）。外包百分率指的是被胚层覆盖的胚胎（胚层加卵黄细胞）占整体的份额。在6.66h之后，其速率相对恒定，约为每小时外包15%。我们观察了一起发育的多组胚胎（每组约12个）而获得这些数据，此处忽略了胚胎中可能的变异。 作为形态发生运动，胚层边缘的内卷似乎很好地证明了一种硬骨鱼玫瑰无须鲃（rosy barb）的发育在很多方面与斑马鱼极为相似（Wood and Timmermans, 1988）。然而J.P Trinkaus 最近获得了一些资料（尚未发表）证明克鲤鱼的胚胎根本不发生内卷，相反，近于表面的细胞独自由表面向深部迁移，而不是以整个细胞层进行卷动。这一运动称内移运动（ingression），也可能在斑马鱼中发生（J. Shih and S.E. Fraser，尚未发表），这是用高分辨率的时滞分析对Wood和Timmermans曾观察过的整个细胞野做进一步研究所得。随着细胞向内运动，一条裂沟称Brachet裂缝在Nomarski光镜下开始变得可见（图13），在横断面位于上下胚层之间。我们在75%-外包期的图1中指出了这一裂缝的所在，但用立体显微镜常不易定位（对比图11和13）。正常情况下，胚层的细胞不会跨过Brachet裂缝进行融合（不过实验条件下可能，见下文）。两胚层内的细胞以各自不同的方向进行流动。除背侧区域（见下文），上胚层通常向外侧流动，而达到外围后又向内运动进入下胚层。然后，作为下胚层细胞游离外围（Warga and Kimmel, 1990）。原肠期结束时仍留在上胚层的细胞相当于最后的外胚层（ectoderm），将产生诸如表皮、中枢神经系统、神经嵴以及感受基板等组织。而下胚层将产生中胚层（mesoderm）和内胚层（endoderm），Thisse等（1993）称之为“内中胚层”（“mesendoderm”）。两个名称都强调了在原肠期的任一分期都不存在三个独立的胚层，只有两个。环绕大部分胚胎周围的下胚层此时只有一两层细胞厚（图13），目前尚不知其何以分化成内胚层和中胚层。图 13 . 原肠中期胚胎的背侧胚层，75%-外包期，Nomarski光镜。我们将胚胎植物极朝上，轻轻平放于两盖玻片之间，再聚焦，大致在动植物极中线处获得此光学剖面图。因而，此图是沿胚轴观察而得，中心为中线结构。上面的细胞中胚层覆盖下面的卵黄细胞。EVL在此期极薄，不可见（但在表面观可见）。箭头示上下胚层的显著边界Brachet裂缝。上胚层似为厚度几乎均一的多层细胞，但实际上此时它可能正在形成单细胞层的假层上皮（pseudostratified epithelium，Papan and Campos-Ortega, 1994）。下胚层夹在上胚层和YSL之间。远离背中线（例如箭头附近区域）近轴中胚层似为单层立方细胞。特别在中线区域Brachet裂缝较不明显，轴下胚层增厚，可能包含不止一层细胞。随后，轴下胚层将同时贡献于中胚层（如脊索）和内胚层。比例尺