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流感的相关知识及实验室检测 陈宪楷 2018 5 24 C 流感病毒 流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病 人类的流行性感冒病毒 influenza 简称流感 属正粘液病毒科 分A 甲 B 乙 C 丙 三型 呈球形或丝状 是一种造成人类及动物患流行性感冒的负链RNA病毒 流感病毒的基因组 RNA与NP构成RNP 基因组由8个短的单链RNA构成 包含11个基因 编码11个蛋白 血凝素 HA 神经氨酸酶 NA 核蛋白 NP M1 M2 NS1 NS2 NEP 核输出蛋白 PA PB1 聚合酶基团1 PB1 F2和PB2 NP 核蛋白 和MP基质蛋白 M1 抗原性稳定 具有型特异性 将流感分A 甲 B 乙 c 丙 三型 甲乙型流感主要亚型 血凝素 HA 和神经氨酸酶 NA 抗原结构极易发生变异 有亚型的特异性 是甲型流感病毒分亚型的主要依据 甲型流感命名通常会遵照HN的规则命名 H代表血凝素 可分为16个亚型 N代表神经氨酸酶 有9个亚型 会季节性在人群中出现的亚型通常为H1 2和3 以及N1和2 根据乙型流感病毒表面血凝素蛋白的抗原特征主要分为B型 Yamagata 和B型 Victoria 根据国家流感中心报道 今年监测到的流感病毒以甲型H1N1亚型和乙型 Yamagata 系为主 并且总体上甲型H1N1亚型的比例超过B Yamagata 系 甲型H3N2亚型和B Victoria 系以低水平共同流行 我国流感流行现状及亚型 不仅在中国 在欧洲一些国家和地区 今冬流行的流感病毒优势毒株是B型 Yamagata 这一毒株沉寂已久 普通人群对它的免疫基本缺失 图 中国流感病毒检出率及其亚型分布 流感的季节性流行 长江以南 长江以北 流感病毒在我国的活动规律南北存在明显的差异 高峰期 1 流感患者2 隐性感染者 1 近距离飞沫传播2 接触传播 流感的流行病学 传染源 传播途径 病毒变异快 65岁以上老年人 婴幼儿 慢性病患者 反复感染 并发症 感染流感的一般临床表现 流感一般急性起病 主要表现为发热 可达39 40 伴畏寒 寒战 头痛 肌肉关节酸痛 极度乏力 食欲减退等全身症状 常有咽痛 咳嗽 可有鼻塞 流涕 也可有呕吐 腹泻等症状 一般来讲 流感全身症状比普通感冒重 流感为自限性疾病 发病3 4天后体温逐渐消退 全身症状好转 重症病例可导致慢性基础病加重 也可出现病毒性肺炎 心脏和神经系统损伤等并发症 流感病毒的实验室检测 采集标本类型 常规特殊咽拭子鼻咽 呼吸道吸取物鼻拭子鼻洗液 含漱液血清呼吸道灌洗液 实验前处理 流感标本采集采集时间 病人发病的头3天内采集 最好是24h内 咽拭子采集 咽拭子用灭菌棉签 最好用聚丙烯纤维头的塑料杆拭子 擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁 将棉签头部浸入含3 4ml采集液的管中 尾部弃去 旋紧管盖 注意 采样前1h内不要进食和饮水 采样液中严禁加入抗生素 标本的处理和保存 标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存 常用的采样液有 PH7 4 7 6的Hank s液或MEM 标本应在4 保存24小时内送至实验室 实验室对收到的标本最好24 48小时内进行检测或接种 如不能在48h内检测或接种 标本应置于 70 保存 实验室生物安全要求 季节性流感病毒分离鉴定在生物安全 级实验室进行 用灭活的抗原进行血清学检测时可以在生物安全 级实验室进行 流感病毒分离鉴定及其它检测过程中所有能够产生感染性气溶胶的过程必须在生物安全 级实验室的生物安全柜里操作 常见的流感病毒实验室检测方法 季节性流感检测流程 临床标本采集 接种MDCK细胞 接种鸡胚 红细胞凝集抑制试验 鉴定病毒 红细胞凝集试验 流感病毒核酸检测阳性 PCR鉴定 流感病毒亚型的鉴定 流感病毒亚型的鉴定流程 红细胞凝集试验 4个凝集单位配制 回滴 红细胞凝集抑制试验 判定流感病毒型别 红细胞凝集试验 HA MDCK细胞或鸡胚收获的标本分离物首先用鸡 豚鼠或人红细胞进行红细胞凝集试验 HA 确定病毒滴度 原理 流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白 HA 含有能结合并识别红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白结构 许多哺乳动物和禽的红细胞表面均含有这两种成分 因此流感病毒能与其结合并识别 产生凝集现象 当血清中有特异性抗体与病毒血凝素结合后 可以抑制凝集现象出现 A H B C D E F G 100ul病毒液 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 稀释完病毒液后加入50ul红细胞悬液 50ulPBS 稀释病毒加入配制好的红细胞悬液充分混匀 置室温孵育30 60分钟观察记录结果 操作简图 病毒原液 1 2 1 128 HA 32 HA 128 HA 4 红细胞凝集试验 HA 结果判读 HA滴度 8 进行红细胞凝集抑制 HI 试验 若传1 2代后 HA滴度仍 8者 可应用核酸检测方法进行鉴定 HA滴度 8者 继续在敏感的MDCK细胞系或鸡胚上进行传代培养 使其HA滴度 8后 再进行HI测定 红细胞凝集抑制 HI 试验 HA试验完成后 用国家流感中心每年提供的抗A H1N1 抗A H3N2 抗B Victoria系 和抗B Yamagata系 4种标准参照血清 进行红细胞凝集抑制 HI 试验 确定病毒的型别和亚型 进行HI试验时 需同时进行4种标准抗原对照 红细胞凝集抑制试验步骤 每孔加入50ul红细胞悬液 充分摇匀 室温孵育30 60分钟 加入25ul4个血凝单位抗原 室温孵育15 30分钟 稀释血清 4个凝集单位的配制和检测 观察记录结果 红细胞凝集抑制试验稀释血清 1 2 7 6 5 3 4 9 8 10 H1血清50ul H3血清50ul 50ulPBS B血清50ul 25ulPBS 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul B血清50ul H3血清50ul H1血清50ul 急性期 恢复期 病毒液 操作简图 流感病毒的型别判定 标准参照血清对待鉴定病毒的抑制效价 20才可以算为阳性 待鉴定病毒与标准参照血清有交叉抑制 但与一种标准参照血清抑制效价大于其他参照血清4倍以上时 可以判定为此型别的流感病毒 一个待鉴定病毒不能同时被两种或两种以上的标准血清抑制 约60 70 不准确的检验结果产生于分析前阶段 做好分析前的质量控制是保证检测结果准确可靠的先决条件 影响流感病毒检测的因素也大多出现在分析前 影响流感检出率的因素 采样部位的选择 就不同采样部位而言 国内外关于采样部位的研究主要集中在鼻拭子 咽拭子和下呼吸道吸取物 一般认为鼻拭子因含有较多呼吸道上皮细胞导致流感病毒检出率高于咽拭子 参考文献李珺 刘亚楠 田国保等 临床实验室流感病毒检测的相关影响因素分析 J 国际病毒学杂志 2017 24 5 331 335ISTIC 标本采集后获取的呼吸道上皮细胞含量决定着采样质量 而有研究提示 不同型别的流感病毒对于定居部位有着一定的嗜性 虽然都是入侵呼吸道上皮细胞 但是选择的部位可能有所不同 导致不同型别的流感病毒在不同的采样部位检出率不同 从标本采集时间上分析 有文献报道 发病后2d就诊的流感样病例 流感病毒阳性检出率明显高于其他各组 发热4天后就诊患者流感病毒阳性检出率最低 随着病程的延长 咽拭子病毒核酸的检出率呈下降趋势 因此对于高危人群 应在发病后尽早采样 必要时可采用多部位 多次取样检测 以提高流感病毒阳性检出率 标本采集时间的选择 参考文献李珺 刘亚楠 田国保等 临床实验室流感病毒检测的相关影响因素分析 J 国际病毒学杂志 2017 24 5 331 335ISTIC 检测方法的选择 有研究对流感病毒胶体金抗原快速检测法与核酸PCR法比较 两者之间一致性较差 以咽拭子流感病毒核酸检测为标准 流感病毒抗原快速检测法 胶体金法 的敏感性和特异性分别为27 6 和86 9 其敏感性明显低于国内外文献报道的水平 40 85 参考文献李珺 刘亚楠 田国保等 临床实验室流感病毒检测的相关影响因素分析 J 国际病毒学杂志 2017 24 5 331 335ISTIC 流感病毒胶体金抗原快速检测阳性检出率17 6 核酸检测阳性检出率为31 0 我科2017年和2018年1 4月流感阳性率统计 导致我科流感核酸检测检出率与文献报道不符的原因分析 文献报道筛选的病人是高度怀疑流感病人 用于进行方法学比对试验 与我们的统计人群无可比性 我院进行流感核酸检测的病人大多是儿科具有呼吸系统疾病的儿童 医生主要用于排除诊断 核酸检测的检测样本例数远远小于金标法 2 体温 年龄 标本储存温度 其他因素 3 1 有研究发现 年龄 60岁 体温在38 0 38 9 之间 流感病毒阳性检出率高于其他组 参