重组乙肝疫苗汉逊酵母的介绍ppt课件.pptx

重组乙肝疫苗 汉逊酵母 制备 1 目录 1 背景介绍2 重组酵母构建3 菌种制备和发酵4 分离纯化5 纯度测定工艺6 疫苗的保存 2 背景介绍 1 乙肝病毒的感染可导致慢性肝脏疾病甚至肝癌的发生 我国乙肝感染率为60 乙肝表面抗原携带率约为10 有约1 2亿人携带乙肝病毒 乙肝病毒中决定乙肝病毒抗原性的蛋白是乙型肝炎病毒 HBV薄膜蛋白 主要包括 乙肝病毒表面抗原 HBsAg 前S1抗原和前S2抗原2 乙肝疫苗的发展 3 汉逊酵母为甲基营养型酵母 基因组易操作 培养基廉价 有分泌型表达模式 正确的折叠和修饰 产量理想 发酵液产出杂蛋白少 产物易于纯化 无热源和其他病原体 安全性好 3 重组酵母的构建 1 根据已经测定的编码乙肝病毒表面抗原决定簇基因序列 用化学合成法直接合成目的基因2 用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段连接到质粒分子上 构成DNA重组分子 3 借组细胞转化手段将DNA重组分子导入酵母细胞内 4 短时间培养转化酵母细胞 以扩增DNA重组分子 5 筛选和鉴定经转化处理的酵母细胞 获得外源基因高效表达的基因工程菌 获取目的基因 构建重组质粒 导入宿主细胞 培养酵母细胞 检测正确表达目的产物的酵母 4 菌种的制备及发酵 用成功构造的基因工程菌进行扩大培养 经过逐级放大至发酵罐 原料以碳水化合物为主 不含有毒物质 并加入少量有机和无机氮源 能容易进行大量有效的乙肝病毒表面抗原的生产 生产过程中 通常常温进行 操作温和 不考虑防爆问题 生产过程中考虑防止杂菌的污染 发酵过程中 可采用分批补料或连续流加补料以保证最优生长和维持细胞浓度 生长速度和营养供应之间的适当平衡 可添加诱导剂如乳糖到发酵液中去以诱导可调节启动子的表达 发现在碳源中降低葡萄糖浓度 补充甘油和蔗糖能较明显地改善比活值和HBsAg的相对浓度 将发酵前期 中期和后期温度分别控制在27 33 25 发酵从pH4 5开始 逐步上升到pH6 以及维持溶氧浓度在最适水平 70 饱和度 都可以提高重组质粒的稳定性和HBsAg在发酵液中的积累 重组酵母细胞 小三角瓶 大三角瓶 种子发酵罐 生产发酵罐 5 分离纯化 1 发酵结束后 通过过滤或离心 使酵母与发酵液分离 2 加入蛋白酶抑制剂以防抗原在细胞破碎时被分解 3 然后细胞通过高压匀浆机破碎释放出抗原 酵母细胞较厚 比大肠杆菌难破碎 可在高压匀浆机内施加几千个大气压 通过针型阀突然降压到零使细胞破碎 4 细胞破碎后加入表面活性剂使抗原溶解 5 粗细胞裂解物用0 2微米中空纤维柱进行微滤 抗原和大部分低分子量宿主细胞内含物通过滤膜 细胞碎片被膜拦截 6 滤液再进行超滤 此时抗原被膜拦截而低分子浪宿主细胞内含物通过滤膜除去7 残留的表面活性剂通过吸附在聚苯乙烯小珠上除去8 再用硅胶吸附抗原 用热硼酸缓冲液洗脱9 用丁基琼脂糖进行疏水层析 纯化后的抗原用硫氰酸盐处理以完成二硫键的交联10 再与氢氧化铝共沉淀 此时抗原吸附在氢氧化铝上 蛋白酶抑制剂 表面活性剂 滤液 硅胶吸附 疏水层析 热硼酸 硫氰酸盐处理 氢氧化铝共沉淀 6 纯度测定 乙肝疫苗是通过肌肉注射的方式进入人体系统 为了降低疫苗内杂质含量对人体产生的不良影响 必须进行疫苗的纯度检测 乙肝疫苗表面抗原的纯度检定是疫苗质量控制的关键手段之一 目前分析测定重组乙型肝炎疫苗纯度的HPLC常用方法是应用TSK G5000PW分子筛 中国药品生物制品检定所疫苗二室曾报道应用该系统对Merck酿酒酵母重组乙肝疫苗和CHO细胞重组乙肝疫苗进行纯度分析 可获得良好的分离效果 对重组汉逊酵母乙肝疫苗 现有的HPLC检测系统应用0 1mol LDTT与1 50吐温80等量混合处理后能有效地检测不同类型重组乙肝疫苗表面抗原的纯度 7 疫苗保存 疫苗的稳定性较差 一般在2 8 下能保存12个月 但当温度升高后 效力很快降低 在37 下 许多疫苗只能稳定几天或者几个小时 非常不利于在室温下运输 为了使疫苗的稳定性提高 可用冻干的方法使之干燥 这样 疫苗的有效期往往可延长1倍或以上 在室温下其效价的损失亦较慢 冻干要点是 1 冷冻 即将疫苗冷冻至共熔点以下 2 真空升华 即在真空状态下降水分直接由固态升华为