食品微生物的检测、分离纯化和初步鉴定.doc

广 州 大 学综合设计性实验报告学 院 生命科学学院課 程 微生物学实验实验项目 实验八 食品微生物的检测、分离纯化和初步鉴定实验题目 北亭村饭店饮用水中微生物的检测、分离纯化和初步鉴定专 业 生物科学年级、班别 姓 名 学 号 任课教师 完成日期 2012-12-10实验八 食品微生物的检测、分离纯化和初步鉴定北亭村饭店饮用水中微生物的检测、分离纯化和初步鉴定【摘要】目的 通过对北亭饭店饮用水中微生物的检测来提高人们对饮食健康的进一步的认识，加强人们的卫生意识，为了更好地分析饮用水中微生物的含量。方法 本实验应用平板菌落记数技术测定饮用水中细菌总数和进行生理生化鉴定。由于北亭饭店饮用水中细菌种类繁多，他们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，是饮料中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以某种培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的细菌总数仅是近似值。本实验采用普通营养琼脂培养基，该培养基营养丰富，能使大多数细菌生长。所谓细菌总数，指1毫升检样中所含的细菌菌落的总数。还有就是通过V-P反应、糖发酵试验、革兰氏染色以及芽孢染色等初步的鉴定试验来进行检测。结果 通过观测得到如下结果：在显微镜下可观察到众多的菌落且种类繁多，取其平均值得到，菌落数为每毫升饮用水中4600个细菌菌落。结论 饭店饮用水虽然符合国家卫生标准，但其中细菌含量还是较多，我们应当慎重饮用，或使用前进行加热处理。【关键词】： 饮用水 微生物 检测 分离 鉴定随着环境污染问题的日益严重，饮用水的生物污染也日益严重，公众对影响健康的病原微生物更加关注。据统计，在不发达国家，有400多万儿童死于水传播性疾病，约有15%的儿童5岁前死于腹泻。在饮用水中不断发现新的对人类造成重大危害的病原微生物，随着环境污染的加剧，还会产生一些新的病原微生物。1 材料、原理和方法1.1 采样为了更清楚地了解我们经常饮用的水的微生物的含量，该实验我们选用了大家经常聚餐的地点北亭村饭店的饮用水。1.2 实验用品1.2.1器材普通光学显微镜，电子秤，手提式高压灭菌锅,超净工作台，无菌培养箱，4冰箱，恒温箱，250mL锥形瓶，无菌培养皿，无菌大小试管，无菌1mL移液管，载玻片，胶头滴管，试剂瓶，烧杯，擦镜纸，酒精灯 ,接种环，试管架，酒精棉球，吸水纸，无菌平板，三角玻棒，玻璃棒,无菌棉塞，药匙等。1.2.2试剂培养基 牛肉膏蛋白胨培养基，乳糖发酵培养基，葡萄糖糖发酵培养基试液 无菌（生理盐）水，无菌培养皿，无菌移液管， 95%乙醇，香柏油，二甲苯，卢戈氏碘液，5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液，草酸铵结晶紫染液。1.3实验原理1.3.1 培养基的配制与灭菌。培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。配制培养基是不仅需要考虑满足这些营养成分的需求，而且应该注意各营养成分之间的协调。此外不同微生物对 pH 要求不一样，酵母的培养基的 pH 一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的 pH 一般为中性或微碱性 ( 嗜碱细菌和嗜酸细菌例外 ) 。所以配制培养基时都要根据不同微生物的要求将培养基的 pH 调到合适的范围。配制培养基的流程如下：原料称量、溶解、加琼脂熔化、调节pH值、分装、塞棉塞和包装、灭菌由于配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。实验室最常用的灭菌方法是利用高温处理达到杀菌效果。高温的致死作用，主要是使微生物的蛋白质和核酸等重要大分子发生变性。高压蒸汽灭菌是微生物研究和教学中应用最广、效果最好的灭菌方法，本实验同样采用高压蒸汽灭菌。1.3.2 微生物的分离与纯化。自然界中各种微生物混杂生活在一起，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。从混杂的微生物群体中获得只含有某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。一般是根据微生物对营养、pH、氧气等要求的不同，供给它们适宜的生活条件，或加入某些抑制剂造成只利于该菌种生长，不利于其他菌种生长的环境，从而淘汰不需要的菌种。分离微生物常用的方法有稀释平板分离法和划线分离法。本次是从中菌悬液中分离多种菌株，实验将采用稀释平板分离法利用选择性培养基分离菌种。1.3.3 分离菌株的鉴定。微生物的分类鉴定是微生物的重要内容，一般从菌落特征、形态、细菌特点及生理生化等方面进行鉴定。各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。不同的细菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和过氧化氢的能力不同。这些都反映了它们是有不同的酶系统。细菌的这种生化反应的多样性在自然界产生了两种结果：第一、使自然界所有的有机分子都有可能得到分解；第二、使不同细菌之间有了互相作用和互相依赖的基础。另一方面，微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一，细菌的生化反应的多样性也被人们作为细菌的鉴定和分类方法来利用，可以鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。*细菌总数，霉菌和酵母菌总数是反映样品的卫生质量的微生物学指标，是指食品经过处理，在一定条件下培养后（37培养24h），所得1g或1ml检样中所含的菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。 实际上，菌落总数并不完全反映样品中实际存在的所有细菌的数量，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。*大肠菌群：一类好氧和兼性厌氧、在乳糖培养基中经37、24h-48 h培养产酸产气、G-、无芽孢杆菌, 是常用的粪便污染指示菌，可反映样品污染的可能性和程度。*检测大肠菌群的方法: 多管发酵法、微孔滤膜法和纸片法。本实验采用快速大肠菌群检测试法。*大肠菌群检测纸片的原理：（1）滤纸片含营养物质、指示剂以及G+抑制剂；（乳糖，蛋白胨、胆盐、TTC（氯化三苯基四氮唑）、NaCl、K2HPO4、溴甲酚紫）大肠菌群:琥珀酸脱氢酶（2）TTC（无色）-非水溶性的红色三苯甲脂酸性条件下（3）溴甲酚紫：-黄色（4）查表：大肠杆菌MPN(Most Probable Numver, 最大机率数) 表,得到数据乘稀释倍数，以此为结果，报告100ml检样内大肠菌群的MPN值。结果判断说明: 纸片上出现红色斑点, 外周黄晕或纸片产生黄色背景, 并在黄色背景上出现红色斑点或片状黄晕者为阳性; 纸片上呈均匀紫蓝色者为阴性; 纸片呈紫蓝色, 有红点周围无黄晕或酸性样品接种后纸片变黄, 经培养无红点者为阴性。检测纸片为一次性使用,使用后焚烧处理。*霉菌和真酵母菌的检测虎红培养基（孟加拉红培养基，虎红琼脂，Rose Bengal Agar，检测霉菌及酵母总数。该培养基中的孟加拉红和抗菌素具有抑制细菌的作用。孟加拉红还可抑制霉菌菌落的蔓延生长。在菌落背面由孟加拉红产生的红色有助于霉菌和酵母菌落的计数。28恒温箱中, 5天后取出计数。1.4试验方法1.4.1技术路线 培养基的配制清洗玻璃仪器玻璃仪器、培养基灭菌倒平板微生物的分离与纯化分离菌株的鉴定观察和记录1.4.2 实验步骤 培养基的制备与分装。1 称量：按培养基配方比例依次准确地称取药品。见附表1.2 溶化：在沸水浴锅中加热熔化。3 调pH ：用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调pH至培养基所需pH。4 分装：将溶化的固体培养基趁热加至漏斗上，装大试管时，注意管口不要沾上培养基。大试管固体分装装量不超过试管的1/5，灭菌后倾斜放置。分装三角瓶的量不超过三角瓶容积的一半，灭菌后垂直待凝。5 加棉塞：培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能，然后包扎一层报纸。试管应先捆成一捆后再于棉塞外包扎报纸，贴上标签，注明培养基名称、日期、组别。 无菌水的制备。用移液管取9mL蒸馏水于6支小试管中，塞上棉塞，包扎报纸。 器皿的准备。1 玻璃仪器初步清洗2 培养皿的包装：每10套一包，用旧报纸包扎。3 移液管的包装：首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用长纸条包扎、打结。4 玻璃涂布棒的包装：方法同移液管的包装。 高压灭菌。将所要灭菌物品放入高压蒸汽灭菌锅内，根据需要设定灭菌温度和时间121，20min灭菌（MRS培养基中含有葡萄糖等成分，灭菌温度和时间分别为113 ，30min）。 倒平板：在超净工作台将培养基冷至50左右，点燃酒精灯，在火焰旁倒平板。 微生物的分离与纯化。1 稀释平板分离法：将5支4ml的无菌水试管排列好，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6依次编号。在无菌操作条件下，用1ml的无菌移液管吸取1ml菌悬液置于第一支试管中，持移液管吹洗三次，用手摇1分钟将颗粒状样品打散。即为1/10浓度的菌液。用l毫升无菌移液管吸取lml 1/10浓度的菌液于第二支试管，将移液管吹洗三次，摇匀即为10-2浓度菌液。同样方法，依次稀释到10-3。稀释过程如图2 平板的制作取6套无菌培养皿编号1、2、3、4、5、6，吸取0.5mL菌液于相应编号的培养皿内加热融化培养基，当培养基冷至45左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和反时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于30培养2448h，然后观察结果。3 稀释平板涂布法：由于实验的目的、所研究的微生物种类、所用的培养基及容器的不同，因此，接种方法也有多种，如斜面接种技术 、液体培养基中的菌种被接入液体培养基、液体接种 、穿刺接种、稀释平板涂布法等 。本实验中采用稀释平板涂布法。稀释平板涂布法与稀释平板法、平板划线法的作用一样，都是把聚集在一起的群体分散成能在培养基上长成单个菌落的分离方法（此法接种量不宜太多，只能在0.5ml以下）。培养时起初不能倒置，先正摆一段时间等水分蒸发后倒置。分别将培养好的细菌、真菌进行平板分离。分别在适宜温度培养，本实验所用的培养箱的温度是35。4 菌种保藏（老师视频示范）： 分离菌株的鉴定。1 观察菌种A、B、C、D、E的培养特征。2 细菌的革兰氏染色，记录菌体特征与染色特性。I 制片：制片方法与简单染色相同。II 初染：加适量（以刚好覆盖菌为宜）的结晶紫染色液染色1.5min， 水洗。III 媒染：碘液媒染1min，水洗。IV 脱色：连续滴加95%乙醇脱色2030s至流出液无色，立即水洗。V 复染：滴加番红复染1.5min，水洗。VI 晾干：将染色好的涂片放空气中晾干，用吸水纸吸干载 玻片上的水。VII 镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。VIII 实验完毕后的处理： 将浸过油的镜头按下述方法擦干净，A先用擦净纸将油精头上的油擦去。B用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦23次。C再用干净的擦镜纸将镜头擦23次。注意擦镜头是向一个方向擦拭。 看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。3 细菌的芽孢染色。I 制片：按常规方法涂片、干燥及固定。II 加热染色：向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热染液冒蒸气计时并维持5min，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸。III 脱色：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。IV 复染：用0.5%番红水溶液复染2min。V 水洗：用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。VI 镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察芽孢和菌体的形态。结果：芽孢呈绿色，菌体呈红色。4 进行以下细菌的生理生化试验：I 淀粉水解试验 将固体淀粉培养基溶化后冷却至50左右，无菌操作制成平板。 用记号笔在平板底部划成4个部分。 将选取的各菌分别在不同的部分点一下，在平板的反面分别在4个部分标明所接种细菌。 将平板倒置在37温箱中培养24h。 观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，为阳性。根据透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。II 糖发酵试验 葡萄糖发酵；淀粉发酵。取葡萄糖发酵管与乳糖发酵管各3支，标记，接种，37培养24-48h。III IMVIC试验接种于2支葡萄糖蛋白胨培养基，37培养48h； MR试验：取一种细菌的24h培养物，接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37培养4872h，取出后加甲基红试剂35滴，观察结果。 VP试验：取一种细菌的24h纯培养物，接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37培养4872h取出后在培养液中先加40%KOH溶液0.4ml，再加5%-萘酚溶液0.4ml，充分混匀。静置在试管架上，15min后观察结果。2实验原始记录实验原始数据表一 水被稀释培养后的菌数稀释倍数10-110-210-310-410-510-6菌落数300461711-表二 淀粉水解试验结果样品：水菌种实验现象A-B-C-D+E-符号说明：在平板上滴加卢戈氏碘液呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，记为“+”，称为试验阳性；否则，记为“-”，称为试验阴性。表三 糖发酵试验结果样品：水菌种实验现象葡萄糖发酵乳糖发酵A+-B+-C+-D+-E+符号说明：“”表示产酸产气； “+”表示产酸不产气，称试验阳性；否则记为“-”，称试验阴性，表示不产酸和不产气。表四 MR试验和VP试验结果样品:水菌种实验现象MR试验VP试验A+B-+C-+D-+E+符号说明： 置于冰箱30min,取出后立即倾斜试管，观察试管培养基的状态， 若部分或全部呈液化状态，记为“+”，称为试验阳性，培养基变红色；否则，记为“-”，称为试验阴性，培养基变黄色。表五 芽孢试验结果样品：水菌种实验现象A-B-C-D+E+符号说明：试验菌有芽孢记为“+”；否则记为“-”。表六 显微镜观察和革兰氏染色试验结果样品：水菌种观察A小，杆状，G-B极小，圆形，G-C小，杆状，G-D大，杆状，G-E中，杆状，G-3结果及讨论3.1实验结果：表七 1ml样品含菌落总数样品饮用水1ml含菌落数（个）4600由表一可知在10-2浓度下，菌落数为46，所以1ml样品中为4600个。根据参考文献中附表（二）中华人民共和国相关食品安全卫生标准，被测饮用水1ml含菌落总数为460010000，属于二级水源，符合国家卫生标准。3.2 结果分析及讨论3.2.1 虽然北亭饭店的饮用水符合国家的卫生标准，但饮用水源必须经过严格的杀菌消毒处理和微生物指标检测才能送至终端用户。但由于自然界中绝大多数细菌是无法培养的，实验中使用的方法会在很大程度上低估饮用水中的实际微生物数量，当饮用水中微生物浓度过高时，检测中还容易出现菌落蔓延现象而影响对结果的观察，尽管我们利用梯度稀释避免菌落蔓延，但这反映的并不是饮水中真实的微生物数量，所以其结果的准确性和真实性仍值得商榷。还有就是，有些微生物在条件适宜的时候会恢复活性，他们的自我保护机制使得它们有可能逃过我们的检测，同时也增加了我们所面临的风险。3.2.2 微生物学指标是评价食品污染的重要指标，是食品安全的保证。特别是水，水质的好坏对人们生活起着至关重要的作用，而判断水质的标准，微生物在水中的数量、种类是必不可少的。自来水厂生产的自来水是符合饮用标准的，但并不代表它是标准的饮用水，原因有二：（1）自来水在生产过程中用氯净化水虽可杀死病原微生物等有害物质，但加入氯本身又可造成新的化学污染。氯可于水中的有机物生成三氯甲烷，它是一种致癌物质。同时，氯还破坏营养，易导致心脏病。（2）在自来水的管网中，长距离管道运输，管道陈旧生锈，城市高楼水箱和楼群蓄水池不清洁或长年使用不消毒，都可造成二次污染。二次污染使细菌、病毒和藻类繁殖，再加上原有的氯及氯化物、铁锈、重金属、放射性物质、使水体混浊、有异味，其伤害无穷。所以说，自来水并不是标准的饮用水。3.2.3 目前，我国饮用水中致病微生物的检测技术不发达，制定的饮用水标准比发达国家较低。在现有的净水技术条件下，为了提高生活品质和确保身体健康，我们迫切需要提高饮用水中致病微生物的检测手段和技术，制定更加严格的饮用水标准。4参考文献【1】黄秀梨、辛明秀. 微生物学实验指导.（第二版）.北京：高等教育出版社.2008：1-27、48【2】罗雪云等，食品卫生微生物检验标准手册 北京：中国标准出版社，1995【3】李伟.北京市饮用水细菌学检测及其变化规律研究/kns/default.htm【4】何晓青，程莉，