PET无菌验证.doc

PET线无菌验证方案1、 目的及要求1.1本方案规定了PET设备无菌验证的必备程序。1.2本方案用于以下几种情况： 1.2.1新安装PET线无菌验证时； 1.2.2PET线大修后无菌验证时； 1.2.3PET线与无菌环境相关联部位进行改造，更换时； 1.2.4PET线出现严重质量问题需要重新验证时。1.3本方案包括S1S7过程，只有在新PET线安装后无菌验证时需要全部完成，其余情况适用时可根据设备维修情况减少过程。1.4所有过程及结果必须记录。报告品控经理，并存档备查。2、实验前准备 2.1无菌验证执行之前，需制定验证流程及时间进度表，并告知所有相关方，必要时需与外方工程师确认合同中规定的验证内容。验证前需对以下情况进行确认： 2.1.1了解机器安装进度 a.确认微生物方面内容 b.微生物实验室内部确认 c.微生物仪器确认（液体取样器，气体取样器，超净台移液枪，振荡器等） 2.1.2确认水处理参数，保证供水质量稳定（主要为硬度，微生物，电导率，pH等） 2.1.3设备安装。大修完毕后，关注CIP/SIP/COP/SOP的运作，主要为化学品浓度（CIP、COP实验，连续三次化学品浓度稳定在范围之内），SIP温度参数确认，取样时间，顺序以及取样要与生产、设备部门、外方共同确认。实验程序S1 着色测试检验灌装机内部清洗是否有死角。进行着色测试前，运行Cop/SOP,记录下喷头类型及位置。通过图纸对比来确认可能喷不到的点以及染色液准备：52g可溶性淀粉（可用其他增稠剂代替），2g胭脂红（可用其他食品级色素代替，数量可调整，以清洗着色为准），2L纯净水溶解煮沸后待用。对微生物实验中的杀菌锅、灌注系统、UHT系统的SIP温度及UHT保持管末端温度使用温度测试条进行验证。观察残留，调整喷头位置到最佳状态，再次着色，调整到无着色残留为止。S2 贴片测试：检验灌装机SOP效果准备材料：移液枪（1ml，0.1ml，0.01ml，推荐准备19ml移液枪一把）以及枪头各100个，细菌悬浮液（枯草芽孢杆菌），钢片50片，可购买或自制，自制规格为长x宽x厚=50x20x(12)mm，一端带孔，孔径6mm，100ml带盖玻璃瓶（作洗脱液盒）50个，不锈钢托盘3个，铝箔纸5卷、平皿、TSA培养基（胰酪胨大豆琼脂、枯草芽孢杆菌专用琼脂），3M胶带、扎带、针筒（1ml、10ml各一个）、振荡器、摇床、三角瓶以制备培养基及无菌水，以及其他微生物实验仪器耗材等。接种环境：确认一间远离生产区域盒实验室的房间作为接种室，内部有恒温设施、温度计、湿度计，生石灰（作为干燥剂），桌椅各一张。出入此房间的人员必须严格控制。钢片接种、空瓶、空盖接种全部要求在接种室进行。污染控制：凡是使接触或可能接触过菌种的地方都要进行消毒，尤其是生产车间内的灌装间，凡是接触过菌种的设备、工具、仪器表面必须进行高温灭菌或者相对应的处理。验证衣着：S2-S5验证都应当穿着无菌服，手套，进行全身杀菌的条件下进行。转移：移入生产车间前，样品需要事先用消毒过的铝箔或塑料袋密封保存，不能污染其它生产区域。试验相关要求： 将样品按照验证程序要求，进行相应的处理，完毕后采用无菌取样的方式移出，进行微生物检验，操作前，按照要求进行洗手、更衣、消毒等人员卫生程序。不相关的人员严禁进入净化间，避免人为污染的存在。所有工具事先完成消毒处理。操作过程中产生的废气包装物，废弃样品和防护用品等物品即使销毁，并对相关操作区域和接触过的区域进行彻底消毒处理。材料处理：钢片用锡纸包裹，与培养基，无菌瓶一起杀菌，待用。接种前，先用振荡器，把菌种的悬浊液混匀。用无菌水制成桂东浓度的细菌溶液备用。接种完毕后，用不锈钢托盘，垫一层锡箔纸，把钢片接种面向上，整齐排列在锡箔纸覆盖的托盘之上，放置完毕之后，再用一层锡箔纸覆盖在托盘之上。钢片接种：将军中原液西施进行梯度稀释（假设菌种浓度已给定，为1109菌悬液），首先用无菌针筒，取1ml菌液，至9ml无菌水试管中，用振荡器混匀，成为稀释液A，然后取稀释液A0.1ml至灭菌钢片上（此时菌种浓度为1107）具体数量参照验证协议，室温干燥610小时（可以事先准备好生石灰做干燥剂），（此时钢片上的菌种估计为1106，干燥期间数量可能减少一个数量级，请依照预实验情况，以及接种环境条件进行接种）。接种钢片50个，预留10片作为对照，不放入灌装机，用于初始接菌量的检验。干燥后，用不锈钢托盘，用铝箔纸托底，将钢片接种面向上放置。钢片安置：菌液干燥后，就可进行S2。接种后钢片使用塑料扎带或者双面胶，悬挂或黏粘贴在之前通过着色实验确认的点上，贴片点3040个。安置钢片时，可由三人进行操作人在无菌环境内安置，其余两人则协助钢片安置，比如为其酒精消毒，穿戴鞋套，递送工具。钢片安置完毕之后，关闭灌装机各个密封门，并且。之后进行SOP，期间由相关人员对灌装间SOP的实际时间进行确认。关于SOP参数，需事先取得，依照此数据试验。S2实验无菌流体取样点：从S2开始至结束，工厂品控人员需依据取样频率。进行无菌水微生物取样，要求现场微生物QC取样，取样后进行膜过滤，以细菌总数以及霉菌/酵母温度培养，S2过程中还要进行百级区尘埃粒子检测，百级区浮游菌检测。对照钢片处理方法：S2中，SOP结束后，先处理对照的钢片，把钢片放入灭菌后的洗脱液中。（注： 洗脱液的制备：8.5gNaCl、0.1g吐温80溶解于1L纯净水中经121、30灭菌后备用。）摇晃20分钟后，置于超净工作台上取出，进行梯度稀释，如按照0.50.9106个/ml的初始接种量来算。首先将钢片放入100ml洗脱液时，此时浓度菌液为0.51104个/ml)，再对菌液进行两次梯度稀释（每次稀释需要对放置稀释液的试管进行振荡，使菌液混匀），制成稀释液B（此时浓度菌液为0.51102个/ml），此时取1ml稀释液B进行膜过滤（使用0.45白色无菌膜，使用TSA培养基，90mm大平板），如产生泡沫，使用9ml无菌水加入滤杯助滤。取1ml稀释液B进行一次梯度稀释，制成稀释液C（此时浓度菌液为0.51101个/ml)），取1ml稀释液C进行膜过滤，（使用0.45白色无菌膜，使用TSA培养基，90mm大平板），如产生泡沫，使用9ml无菌水加入滤杯助滤。用0.1ml移液枪，取稀释液B（此时浓度菌液为0.51102个/ml）0.1ml加入9ml无菌水中，对其进行膜过滤，（使用0.45白色无菌膜，使用TSA培养基，90mm大平板），如产生泡沫，使用9ml无菌水加入滤杯助滤。 每个对照做10-4稀释，10-5稀释，0.110-4稀释各一次。对照钢片建议一共10组。通过试验得出钢片原始菌数量。钢片卸载：卸载钢片时，可由三人进行操作，人在无菌环境内卸载，其余两人则协助钢片卸载，比如为其用酒精消毒，穿戴鞋套，递送工具等。钢片背部以及边缘，需使用酒精或PAA稀释液等消毒液进行消毒，但是消毒液绝对不允许接触钢片正面，消毒完毕后，用9ml无菌水冲洗，并立即放入80ml洗脱液的塑料盒中，上下摇晃20分钟待用。实验方法：取下钢片后，把钢片放入已灭菌的洗脱液中，摇晃20分钟后，置于超净工作台上取出钢片，直接对洗脱液进行膜过滤，如产生泡沫使用100ml无菌水加入滤杯助滤，取下滤膜放入事先准备好的培养基平板（90mm或者更大平皿，事先倾倒好无菌培养基）。实验后，平皿放入302培养箱，72小时候计数。S3瓶内接种试验目的：检验灌装机对PET瓶的杀菌效率事先准备材料：移液枪（1ml，0.1ml,0.01ml,推荐另一把1-9ml）以及枪头，细菌悬浊液，塑料圆盒（洗脱液盒）150个，不锈钢托盘，锡纸，平皿（塑料/玻璃均可），TSA培养基（胰酪胨大豆琼脂，枯草芽孢杆菌检测专用琼脂），3M胶带，扎带，针筒（1ml,10ml各一个），振荡器（可选），摇床（可选），三角瓶制备培养基以及无菌水，一家其他微生物实验室仪器耗材等。接种：10 接种：从2*10吸1ml到9ml试管，稀释成2*10的菌悬液，然后从2*10吸2ml到8ml无菌水中，稀释成5%10的菌悬液，用移液枪取1ml至刚吹好的PET空瓶内，拍打空瓶，使菌悬液呈小水珠附着于瓶内壁/分布于空盖底部，共接种200个空瓶，其中40个备用。空瓶室温干燥12-24小时（可事先准备好生石灰做干燥剂）。接种PET瓶安置：菌液干燥后，就可进行S3。接种后PET瓶（注：不能旋盖），使用塑料袋（或纸箱），将200个已接种的PET瓶，从接种室转移到注入间，挂上风道，按照规定最大灌装速度，进行验证。杀菌后PET瓶中注入100ml无菌水后封盖，从注入机出口运输带取出，转移至制定区域，剧烈晃动20分钟，然后做膜过滤试验，滤膜放入事先准备好的培养基平板（90mm或者更大平皿，事先倾倒好无菌培养基）。实验后，平皿放入302培养箱，72小时候计数。S3实验无菌流体取样点：从S3开始至结束，工厂品控人员需依据取样频率，进行微生物取样，包括冲瓶/冲盖无菌水，冲瓶口无菌水的取样，要求现场微生物QC取样，取样后进行膜过滤，分别选用PCA（plate count agar 平板计数琼脂，GB/4789.2-2008中菌落总数检测专用琼脂）/虎红培养基，以总菌以及霉菌/酵母温度培养。S4盖子接种试验目的：检验盖杀菌机的杀菌效率事先准备材料：移液枪（1ml，0.1ml,0.01ml,推荐另一把1-9ml）以及枪头，细菌悬浊液，塑料圆盒（洗脱液盒）150个，不锈钢托盘，锡纸，平皿（塑料/玻璃均可），TSA培养基（胰酪胨大豆琼脂，枯草芽孢杆菌检测专用琼脂），3M胶带，扎带，针筒（1ml,10ml各一个），振荡器（可选），摇床（可选），三角瓶制备培养基以及无菌水，一家其他微生物实验室仪器耗材等。接种：10 接种：将稀释至10 菌悬液，用移液枪取1ml至空盖内，使菌悬液呈小水珠附着分布于空盖底部，水珠越小越好。 盖子接种数量为80个，其中20个备用，空盖室温干燥24小时（可事先备好生石灰做干燥剂）水珠完全挥发后使用。空盖安置：使用托盘铝箔纸，将接种好空盖覆盖好，转移至注入间。从下盖槽整齐排列。建议接种盖与洗盖槽中其他盖，以颜色区别或做标记。按照规定最大灌装速度进行验证。杀菌后瓶盖，旋盖于灌装100ml无菌水的瓶子上，从注入机出口运输带取出，转移至指定区域，剧烈晃动20分钟，然后做膜过滤试验，滤膜放入事先准备好的培养基平板（90mm或者更大平皿，事先倾倒好无菌培养基）。试验后，平皿放入302培养箱，72小时候计数。S4实验无菌流体取样点：从S4开始至结束，工厂品控人员需依据取样频率，进行微生物取样，包括冲瓶/冲盖无菌水，冲瓶口无菌水的取样，要求现场微生物QC取样，取样后进行膜过滤，分别选用PCA（plate count agar 平板计数琼脂，GB/4789.2-2008中菌落总数检测专用琼脂）/虎红培养基，以总菌以及霉菌/酵母温度培养，与此同时做涂抹试验、空暴实验。S5 涂抹、空暴实验及浮游菌、尘埃粒子检测目的：检验洁净室的洁净程度事先准备材料：已倒入虎红/ PCA（ plate count agar 平板计数琼脂，GB/4789.2-2008中菌落总数检测专用琼脂）无菌平皿（塑料/玻璃均可）各9个（2对备用），无菌棉签，三角瓶以制备培养基以及无菌水，以及其他微生物实验室仪器耗材等。实验方法：在灌装机进行COP后将无菌平皿，无菌棉签，以及空气采样器放入洁净室内，空气采样器外部需喷洒酒精后用锡箔纸包扎，然后开始SOP,SOP结束后，将无菌平皿在指定位置打开放置30min，无菌棉签涂抹灌装机指定部位，检测无菌区和洁净室的空气质量，在1立方米的空气里取35个样品分析总菌数，再取35个样品分析酵母菌和霉菌的总数。选用虎红培养基培养酵母菌和霉菌：PCA培养基培养总菌。根据标准进行涂抹取样分析。取样位置如下表。其中的一半用于分析总菌，另一半用于分析霉菌和酵母菌。记录取样点及各取样点选取的原因。在系统不运行时，用粒子计数器记录无菌区/洁净室大于0.5um粒子的数量。操作时必须身着无菌服，口罩手套等。不同生产线的涂抹、空暴点不同，请依据相关设备供应商提供的位置进行试验。注意：S1-S5所有实验结果合格后，才能进行S6实验。实例：涂抹试验点（PROCOMAC）序号位置编号代码1灌装机出口星轮下部平台FS2A2灌装机入口星轮FS3A5灌装机出口星轮FS9A4取盖器FS12A3灌装阀（取相同的五个）FS5C6假瓶系统支架FS7C7旋盖头（取相同的五个）FS13D8冲瓶机入口区域RS2F9冲瓶机星轮支架RS3F10冲瓶机出口星轮RS4F11冲瓶机至灌装机转换星轮RS5F12盖杀菌旋转盘CS5H13盖冲洗区CS6H空暴实验点（PROCOMAC）序号位置编号代码1旋盖机下部平台FA1D2灌装机进口星轮下部平台FA2A3冲瓶机至灌装机转换星轮下部平台RA1F4冲瓶机进口星轮下部平台RA2F5盖杀菌冲洗去CA1H6盖杀菌旋转盘区CA2HS6 LG培养基验证目的：验证整线无菌达到规定的要求UHT和大无菌罐的验证：灌装机培养基验证前，设备应先将扭力、气密性调整至标准规定范围，并完成UHT与大无菌罐的验证状况，此验证过程可与培养基验证同时进行，也可单独在之前进行。培养基制备要求与培养基验证相同，但要求培养基在大无菌罐中保持7天后采用膜过滤法检测微生物，取样数不少于20份，没份数量不少于100ml。大修验证时此步骤额省略。事先准备：原料：培养基的原料准备（详情请见附表），对应的瓶胚，盖子等原辅料的准备。建议原辅料按照计划量的120%准备。以防止意外发生造成培养基数量不足并且再根据UHT排料性能考虑。其他：必要对可能影响验证的因素进行确认以及改善，比如对吹瓶风道过滤器的维护，对风道内部的擦洗及酒精消毒，对整个空间进行喷雾消毒，链条及凡是能接触到产品的设备进行酒精擦洗，下水道（特别是灌装间内下水道）清理完毕后要进行消毒，对即将用于测试的包装材料，比如空瓶、瓶盖进行测试，对包装设备进行测试，确保实验过程顺利。并且阿奶设备清洗消毒，供应商对其产品进行自查，比如灌装机查漏，杀菌剂原液浓度等。如果刚完成枯草芽孢杆菌的挑战性实验就要进行培养基实验，灯光亮度是否足够，以及确定保温室有温湿度计，来确认保温库温度湿度能否达标，保温期间每天安排专人负责记录温湿度。培养基调配：LG培养基（LINDEN GRAIN）配置方法用途：用于真菌培养及食品无菌检查用。原理：大豆蛋白胨提供碳源和氮源：酵母浸出粉提供B族微生物：葡萄糖提供能源：碳酸氢二钾为缓冲液：硫酸铵，硫酸镁提供必须的微量元素。配方（每升）：大豆蛋白胨2.0g：酵母浸出粉3.5g：葡萄糖20.0g：磷酸氢二钾1.0g：硫酸镁1.0g：硫酸铵2.0g：使用方法：以（10000L）计1、 调配罐注入8000L、60度的水；2、 然后将培养基倒入调配罐，注意加入时应多次少量缓慢加入，同时调配罐应持续搅拌（放置过于粘稠使培养基结块出现混合不均匀或黏在罐体表面）3、 检查罐内溶液，确保所有培养基都已经完全溶解。4、 结果如下：菌名菌号生长状况黑曲霉 CMCC(B)98003絮状菌丝，液面可由黑色孢子大肠杆菌 CMCC(B)44103肉汤浑浊注意：需要事先检测培养基是否能够被污染。如能将这些组分分别使用小料缸预溶解后通过5u滤网加入混合缸中更好。搅拌直至所各组分彻底溶解。目测检查。用20度的处理水将混合缸定容。至少30分钟搅拌，取样测试pH（pH无需调节），浊度和白利度。5、 若为中性/低酸测试,则将LG培养基pH值调至6.5-6.8（参考添加量：110-130g化学纯NaOH加入一吨LG培养基）；如果为高酸测试则将培养基pH值调至4.3-4.4（参考添加量：250-330ml 12N HCl 加入1吨LG培养基或加柠檬酸调整亦可），谨慎起见，酸碱第一步添加量参考添加量下限的80%，然后按照实际情况，逐渐加入余下量直至pH达标为止。在2小时内将培养基（不论高酸/低酸，中性培养基）在137度，30秒或相当的温度和时间灭菌。储存于无菌缸中，否则可能会引起微生物过度繁殖，造成培养基内部浑