4.细菌的简单染色及革兰氏染色.doc

细菌的简单染色和革兰氏染色 一、实验目的 1、学习微生物涂片染色的操作方式 2、掌握微生物的单染色和革兰氏染色 3、学习无菌操作 4、学习油镜的使用二、实验原理 简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法，简单染色一般难以辨别细菌的构造 革兰氏染色法是1884年丹麦病理学家G.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类，是细菌学上常用的鉴别方法。三、实验材料 1、活材料：培养好的菌种 2、染色液和试剂：美蓝染液，结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、番红（又名沙黄）、二甲苯、香柏油 3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种环、酒精灯、擦镜纸、显微镜四、实验步骤 1、单染色 （1）涂片：取干净载玻片一块，并做记号滴加生理盐水无菌操作调菌涂片 （2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方用文火烘干 （3）固定：手执玻璃片一端，让涂片朝上，通过火焰23次固定 （4）染色：滴加美蓝（或石碳酸品红）染液12滴，染色23min （5）水洗：用水洗去涂片上的染色液至流水变清为止，注意水流不能直接冲洗涂菌处，以免将菌体冲掉 （6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或者用滤纸轻轻洗去玻片上的水分 （7）镜检：先低倍后高倍，再向涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油中仔细观察调焦观察 2、革兰氏染色 （1）涂片：与简单染色法相同 （2）晾干：与简单染色法相同 （3）固定：与简单染色法相同 （4）结晶紫染色：滴加结晶紫染色液（革兰氏（一），染色约1min后洗去染色剂 （5）媒染：滴加卢哥氏碘液（革兰氏（二），媒染1min，后用水洗去碘液，将载玻片上的水用滤纸擦干 （6）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%的乙醇（革兰氏（三）脱色约2025s，立即用水冲净乙醇 （7）复染：滴加沙黄（革兰氏（四）复染12分钟，使已脱色的细胞重新染色，便于鉴别观察，用水洗去玻片上的沙黄染色液 （8）晾干：将染好的玻片放在空气中晾干或者用滤纸擦干（9）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断革兰氏染色的染色反应性3、油镜的使用 （1）先用粗调节旋钮将载物台下降（或将镜筒提升）约2mm，并将高倍镜转出 （2）在玻片标本的镜检部位上滴一滴香柏油 （3）从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓慢上升，（或镜筒下降），使油镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触 （4）从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈（带视场光阑油镜开大视场光阑），上调聚光镜至顶部，使光线充分照明，用粗调节旋钮将载物台缓缓放下（或镜筒上升），当出现物像一闪后改用细调节旋钮至最清晰为止。如油镜离开了油面仍看不到物像，必须从侧面观察，重复上述操作 （5）观察完毕，下降载物台，将油镜转出，先用擦镜纸擦去油镜上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚乙醇混合物（乙醚2份，无水乙醇三份）或二甲苯，擦去镜头上的残余的油迹，最后用擦镜纸擦拭23下即可）（注意朝一个方向擦） （6）将各部分还原，转动物镜转换器，使低倍物镜与载物台通光筒相对，再将载物台下降至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，最后用柔软纱布清洁载物台等机械部 分，然后将显微镜放入柜台或镜箱中，或外加盖罩4、无菌操作 （1）先将接种环在酒精灯火焰上彻底灼烧灭菌 （2）在火焰旁拔出试管或三角瓶塞并将其口部通过火焰23次，去除可能附在管口或瓶口的微生物，开塞后的管口或瓶口应尽量接近火焰，尽量放平，切忌口部向上及长时间暴露与空气中，以免污染 （3）将灭菌好的接种环在管外冷却后伸入管内挑取少量菌体，注意勿使接种环碰到管壁及其外面的物品，也不要使接种环再通过火焰 （4）将试管或三角瓶口在火焰上通过23次后塞好管塞或瓶塞，并且保持接种环在火焰的周围，以免污染五、思考题 1、要得到正确的革兰氏染色的结果，必须注意哪些操作？哪一步是关键的步