兽药残留样品前处理技术.ppt

兽药残留前处理技术 Pre treatmentTechnologyofVeterinaryDrugResidue 马勤川威海德生技术检测有限公司 目录 contents 01 PART 概述 Introduction 浓缩 净化 提取 03 02 01 样品前处理是指样品的制备和对样品中的待测组分进行提取 净化和浓缩的过程 样品前处理的目的是消除基质干扰 保护仪器 提高检测方法的灵敏度 选择性 准确度 精密度 基体复杂 各目标化合物性质差异大 残留浓度低 检测限越来越严格 01 02 03 04 SAMPLETYPES 兽药残留分析中 最常用的生物样品是组织样品和禽蛋 其次是奶 血液和尿液样品 肌肉中水分约占75 蛋白质 肌浆蛋白 肌原蛋白 胶原蛋白和弹性蛋白 占19 脂肪 中性脂肪 脂肪酸和磷脂 占2 5 糖类占1 2 以及一些无机盐 维生素和酶类 肌浆蛋白 肌红蛋白 糖解酶 可溶于水 肌原蛋白 肌球蛋白 肌动蛋白 溶于浓盐水 胶原蛋白和弹性蛋白 结缔组织 在上述溶剂中均不溶 禽蛋包括蛋黄和蛋清 蛋黄的含水量约50 蛋白质16 5 脂肪33 糖类0 2 以及一些无机盐 维生素和酶类 淀粉酶 脂肪酶 磷酸酶 肽酶和过氧化氢酶 蛋清含水量达88 蛋白质10 5 和极少量的碳水化合物和脂肪 与蛋清相比较 蛋黄基本上为疏水性环境 低极性药物的残留较多 如果需要分别测定蛋黄和蛋清中的残留 最好将刚产出后的蛋分离蛋黄和蛋清 避免药物由蛋黄向蛋清扩散 奶中还含有大量由酪蛋白或脂蛋白构成的束胶体系 当酸化或加热时 束胶结构解体 蛋白质沉淀析出 非解离性的或极性较低的药物易由血浆向奶中扩散 导致奶中残留 与血浆样品类似 奶中的药物可与蛋白结合 牛奶的含水量约87 蛋白质 以酪蛋白为主 为3 3 脂肪 甘油三酯 为3 7 糖类 乳糖 为4 7 以及一些无机盐 维生素和酶类 过氧化物酶 脂肪酶等 血液由血浆和血清组成 血浆和血清的化学成分与组织液相近 测定血浆或血清中药物浓度 比全血更能反映作用部分药浓的变化 测定方法一般也可互相通用 若血浆中含有抗凝剂对测定有影响 则应使用血清样品 通常药物在血浆中均与血浆蛋白 白蛋白 球蛋白 糖蛋白 脂蛋白 发生一定程度的结合 一些药物的蛋白结合率甚至可达90 以上 因此在萃取之前 必须将结合态的药物分离出来 尿中药物大多呈结合状态 主要以葡萄苷酸和硫酸酯结合物存在 因此无论直接测定或萃取分离之前 都必须将结合态的药物水解 使药物游离处理 尿液的主要成分是水 尿素及盐类 在所有体液样品中 尿样最容易获得 并且样品最多 内含药物 母体药物及代谢物 浓度高 正常尿液中仅含微量蛋白质 不需要去蛋白处理 02 PART 样品预处理 SamplePretreatment 常用的结合物水解的方法有酸水解和酶水解 药物在体内经第二相代谢反应之后 常形成葡萄糖苷酸 硫酸酯及磷酸酯等结合物 以结合状态存在的药物多存在于尿中 但也存在于肝脏 肌肉及血液中 Loremipsumdolorsitametconsecteturadipisicingelit 酸水解 有的药物的结合物则必须采取较剧烈的条件 如加入3mol L盐酸溶液后还必须煮沸1h 水解后的样品呈强酸性 必要时可用碱液调整pH后再进行萃取 酸水解通常使用无机酸 盐酸 至于加入盐酸的浓度 酸化时间以及是否需要加热等 随药物性质而异 但最终应通过实验确定 酶水解 葡糖苷酸酶可专门水解药物的葡萄糖醛酸苷 芳基硫酸酯酶和磷酸酯酶分别水解药物的硫酸酯和磷酸酯 也可用几种酶的混合物 将生物样品中药物的葡萄糖醛酸酐及硫酸酯同时水解 酶水解是专属性很强的水解结合物的方法 通常使用的水解酶是 葡糖苷酸酶 芳基硫酸酯酶 磷酸酯酶等 蛋白质 生物样品如肝脏 肾脏 血浆等含有大量的蛋白质 它们能结合药物 因此对于某些药物检测 必须先将与蛋白质结合的药物游离之后再作进一步处理 除蛋白过程是将蛋白质变性处理后 把与蛋白质结合的药物解离出来 离心分离出去蛋白 通常除蛋白的方法是在含蛋白样品中加入适当的沉淀剂或变性剂 使蛋白质脱水而沉淀 如有机溶剂 中性盐 有的是由于和蛋白质形成不溶性盐而析出 如一些酸类 三氯乙酸 高氯酸 磷酸 苦味酸 去蛋白原理 有机溶剂沉淀剂 甲醇与蛋白形成絮状沉淀易于离心分离 得到澄清的上清液 乙腈与蛋白形成致密沉淀 易离心除去 沉淀效率较甲醇高 使用时应加入足量的沉淀剂 通常加入量为样品体积的1 5 2倍 酸沉淀剂 常用的酸性沉淀剂有三氯乙酸和高氯酸 其它还有钨酸 钼酸 磷钨酸 磷钼酸和苦味酸等 酸性沉淀剂能同蛋白质的阳离子形成不溶性盐而沉淀 必要的条件是溶液的pH要低于蛋白的等电点 LOREMIPSUM 一些无机盐如硫酸铵 硫酸钠和氯化钠等 能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷 使蛋白质失去胶体性而沉淀下来 无机盐中以硫酸铵最常用 盐沉淀剂 03 PART 提取与净化 Extraction Cleanup 提取净化方法 液 液萃取 基质固相分散技术 超临界流体萃取 固相微萃取 免疫亲和色谱 固相萃取 04 01 02 03 通过萃取可将被测组分自大量内源性物质中分离出来 减少杂质对测定的干扰 操作简单快速 经济实用 可一次进行多个样品的萃取 可将萃取液蒸发 使组分富集 经典 溶剂的极性 1 根据相似相溶原理 极性组分易溶于极性溶剂 反之亦然 应根据被测组分的极性选择相似极性的溶剂 2 溶剂的沸点 萃取分离后的有机相通常需要旋蒸至干 因此萃取溶剂的沸点就不应接近或高于水的沸点 否则挥发困难 3 溶剂的毒性 使用对人体有害的萃取溶剂时 应在通风橱内进行 4 与水的互溶性 有的溶剂如乙醚 萃取后可混入大约1 2 的水分 因此伴随带入一些水溶性杂质 液 液萃取常用的有机溶剂有甲醇 乙腈 丙酮 氯仿 二氯甲烷 四氯化碳 乙醚 叔丁基甲醚 乙酸乙酯 苯 甲苯 正己烷 阳离子药物 阴离子药物 阳离子药物配对的离子对试剂则为阴离子 其中以烷基磺酸类 RSO3H 为最常用 实际起配对作用的是其阴离子 RSO3 R为烷基 其碳链越长 生成的离子对络合物脂溶性越高 一些酸性或碱性较强的有机药物在体液中呈离解状态 成为亲水性较强的带电离子 即使控制pH也不能抑制它们的电离 不能用有机溶剂将其自体液中提取出来 阴离子药物配对的离子对试剂主要为烷基季铵类化合物 可用通式R4N X 表示 X 可为酸根或氢氧根 R为烷基 烷基碳链长度常用C4 C12 甚至可选用C20 碳链越长 则生成的离子对络合物的脂溶性越高 固相萃取是一种基于色谱分离的样品前处理方法 固相萃取包括固相 具有一定官能团的固体吸附剂 和液相 样品及溶剂 液体样品在正压 负压或重力的作用下通过装有固体吸附剂的固相萃取装置 由于固体吸附剂具有不同的官能团 能将特定的化合物吸附并保留在SPE柱上 吸附目标物 吸附杂质 基质分散固相萃取 MSPD matrixsolid phasedispersion 其原理是将涂渍有C18等多种聚合物的担体固相萃取材料与样品一起研磨 得到半干状态的混合物并将其作为填料装柱 然后用不同的溶剂淋洗柱子 将各种待测物洗脱下来 其优点是浓缩了传统的样品前处理中的样品匀化 组织细胞裂解 提取 净化等过程 不需要进行组织匀浆 沉淀 离心 pH调节和样品转移等操作步骤 避免了样品的损失 超临界流体具有类似气体的较强穿透力和类似于液体的较大密度和溶解度 具有良好的溶剂特性 可作为溶剂进行萃取 分离单体 固相微萃取 SPME 与固相萃取原理相似 其基本原则也是 相似相溶原理 主要依据分析物质的分子量 挥发性 与极性 纤维头上的薄膜由极性的聚丙烯酸酯 聚乙二醇 或非极性的聚二甲硅氧烷组成 04 PART 实例分析 AnalysisofExample 进出口动物源食品中克伦特罗 莱克多巴胺 沙丁胺醇和特布他林残留量的测定液相色谱 质谱 质谱法 受体激动剂是指含氮激素中的苯乙胺类药物 苯乙胺类药物具有苯乙醇胺结构母核 苯环上连接有碱性的 羟胺 肿胺 侧链 按照苯环上取代基的差异 可将PEAs分为苯胺型和苯酚型 称取5g试样 添加50 L内标工作液 加入20mL乙酸铵缓冲溶液 pH5 2 均质1min 8000r min离心5min 收集上清液 加入20mL正己烷 振荡脱脂 加入40 L 葡萄糖醛苷酶 芳基硫酸酯酶 混匀 37 酶解16h 12000r min离心5min 下层水相过滤 待净化 01 02 03 04 依次用3mL甲醇 3mL水和3mL0