组培实验设计性实验方案.doc

正交实验法研究铁皮石斛原球茎分化影响条件摘要 利用6-BA、IBA、NAA和外源添加物四个因素三水平进行L9 ( 34 )正交实验, 研究各因素对铁皮石斛原球茎分化的影响. 对实验统计通过极差分析及均值分析, 结果表明: 当6-BA的浓度为2 mg /L、IBA 浓度为0.5mg /L、NAA浓度为0.75mg /L和外源添加物为苹果（50g/L）时, 原球茎最易于分化成丛生小苗; 影响原球茎分化程度的因素依次为6-BA浓度外源添加物NAA浓度IBA浓度。关键词 铁皮石斛；组织培养；原球茎分化；正交实验。1 前言1.1 目的意义铁皮石斛( Dendrobium candidum Wall ex Lindl ) 为兰科石斛属多年生附生型草本植物，别名铁皮兰，因其茎节处呈黑褐色，又名黑节草 1。利用石斛茎尖组织培养无病毒植株的无性繁殖技术创立以来, 石斛组织培养技术逐步走向深入化。 目前, 有关铁皮石斛的原球茎分化和生根条件的研究大都基于单因素试验, 如不同培养基、激素浓度、无机盐浓度、碳源、pH 等以及香蕉、马铃薯等附加物2。但是铁皮石斛原球茎分化及生根受培养基中综合因素的共同影响, 不同因子的合理配置决定着培养基的科学性和高效性. 运用正交实验设计可以精简试验次数、克服培养基配方设计的盲目性、大大提高工作效率和试验的可靠性。1.2 研究进展自1960年法国人Gmore l利用石斛茎尖组织培养无病毒植株的无性繁殖技术创立以来, 石斛组织培养技术逐步走向深入化. 目前, 有关铁皮石斛的原球茎分化和生根条件的研究大都基于单因素试验, 如不同培养基、激素浓度、无机盐浓度、碳源、pH 等以及香蕉、马铃薯等附加物. 运用正交实验设计可以精简试验次数、克服培养基配方设计的盲目性、大大提高工作效率和试验的可靠性. 广东省植物研究所关于籼稻花药的离体培养的报道, 还相继在兰科植物中得到了应用3, 但尚未应用于铁皮石斛的离体培养. 本实验利用6-BA、IBA、pH 和培养基种类、琼脂浓度、KCl浓度各三因素三水平及空白对照分别设计两套L9 ( 34 )正交实验4, 以期分别得到有利于铁皮石斛原球茎分化和生根的理想培养基配方.在20 世纪70 年代，谭文澄等就进行铁皮石斛兰组织培养研究并获得完整植株。到今天，铁皮石斛的组织快繁依然是热点。归纳起来，当前铁皮石斛的组织快繁可分为种子无菌萌发、试管苗原球茎发生和试管苗器官发生3 种途径。袁正仿等将铁皮石斛带茎节的茎段接种于培养基上( N6 + 25 mgL 1 BA) 诱导茎节发芽，再将芽接种于培养基上( N6 + 25 mgL 1 BA + 05 mgL 1 IBA) 诱导出原球茎，并指出只有将诱导出的小植株再诱导，诱导出大量的原球茎，才能扩大其繁殖。秦廷豪用铁皮石斛茎段、带顶芽的茎段和根蔸3 类外植体在培养基上( MS + 0.5 mgL 1 6-BA + 02 mgL 1 NAA) 培养，仅根蔸能诱导出原球茎。王春等研究表明，铁皮石斛原球茎诱导最佳培养基为1 /2 MS + 1.0 mgL 1 BA + 0.5 mgL 1 NAA，诱导率为58%。王丽萍等研究表明，选用铁皮石斛幼嫩茎段为外植体诱导出原球茎的最佳培养基为MS + 0.5mgL 1 6-BA + 0.5 mgL 1 NAA + 1.0 mgL 1 2，4-D。郑宽瑜等.以铁皮石斛种子为外植体诱导出原球茎。苏钛等.研究表明，BA 相对于其他激素对铁皮石斛原球茎诱导效果最好，以2.0 mgL 1 BA 诱导率最高5。 周俊辉等研究表明，以1.0 mgL 1 NAA 诱导铁皮石斛生根效果最明显。袁正仿等将铁皮石斛原球茎接种在分化培养基上( N6 + 1.5 mgL 1 BA + 1.2 mgL 1 NAA + 5%香蕉汁) 诱导原球茎分化，结果表明，添加一定浓度的土豆汁、香蕉汁有利于原球茎分化，且添加浓度直接影响分化率和分化时间; 用N6 + 2.5 mgL 1 NAA + 10%香蕉汁培养基使苗快速长高，把长高的苗转接到培养基上( N6 + 2.5 mgL 1NAA + 10%土豆汁) ，使茎变得粗壮6。徐雪荣等研究表明，铁皮石斛原球茎最佳分化培养基是MS + 0.3mgL 1 6-BA + 3.0%白糖，分化率为74%; 分化出的丛芽接种在生根培养基中( MS + 0.05%AC + 3.0%白糖) ，28d 生根率达到87%。朱艳等研究表明，铁皮石斛丛生芽在培养基上( 1/2 MS + 10% 香蕉汁+0.5%AC) 生根效果最好。林丛发等研究表明，最适于铁皮石斛原球茎分化的培养基是1 /2 MS + 0.5mgL 1 NAA + 20%马铃薯汁+ 20 gL 1蔗糖+ 0.8 gL 1 琼脂。王春等研究表明，铁皮石斛不定芽最佳生根培养基为1/2 MS + 0.5 mgL 1 NAA，生根率为100%，平均生根数为7.1 条7。1.3 拟解决的关键问题1.3.1 探究不同激素对圆球茎分化的影响，得出影响最深的因素；1.3.2 通过该探究得出铁皮石斛原球茎分化最理想培养基配方。2 材料与方法2.1 材料2.1.1 实验材料。铁皮石斛一代圆球茎。2.1.2 仪器设备。超净工作台、接种器械、高压灭菌锅、烧杯、量筒、容量瓶、滴管、天平等。2.1.3 实验试剂及用具。MS培养基、6-BA、IBA、NAA、外源添加物(香蕉、马铃薯、苹果)、琼脂、75%酒精、0.1%升汞、蒸馏水。2.2 方法2.2.1 实验方法 对6-BA、IBA、NAA及外源添加物四因素选取三水平研究其对原球茎分化的影响(表1) , 设计正交实验形成9个不同的处理. 将原球茎增殖后形成的拟原球茎分成直径0.15-1.0 cm 大小接入待检培养基中, 基本培养基为MS培养基, 附加琼脂4 g /L, 培养温度25 1 , 每日光照12 h, 光照强度1600-2500 lx，9个待检培养基处理分别接种 5 瓶, 每瓶接种 3 个点, 每个20个左右，重复3次,一段时间后统计并参照下列公式计算繁殖系数.繁殖系数= 诱导产生芽的数量 圆球茎外植体的总数 表1 铁皮石斛原球茎分化的参试因素及三水平 因素水平123A6-BA浓度mg /L0.524BIBA浓度mg /L00.20.5CNAA浓度mg /L0.250.50.75D 外源添加物香蕉30g/L马铃薯50g/L苹果50g/L表2 分化条件正交试验设计实验处理ABCD11111212233133242231523136212273321831339321210（空白）2.2.2 统计分析依据方开泰的正交试验统计方法, 对统计的数据利用Excel软件自编程序进行极差处理。表3 结果记录处理12345678910诱导产生芽的数量320381445513690452478643488312表4 结果分析(均值与极差分析）实验处理ABCD繁殖系数111111.07212231.27313321.48422311.71523132.3621221.51733211.59831332.14932121.6310（空白）1.04均值1(K1)1.2731.5731.6671.457均值2(K2)1.841.5371.4571.54均值3(K3)1.7871.791.7771.903 极差（R）0.5670.2530.320.446A：K1=(1.07+1.27+1.48)/3=1.273 K2=(1.71+2.3+1.51)/3=1.84 极差（R）=1.841.273=0.567K3=(1.59+2.14+1.63)/3=1.787B: K1=(1.07+1.51+2.14)/3=1.573 K2=(1.27+1.71+1.63)/3=1.537 极差（R）=1.791.537=0.253 K3=(1.48+2.3+1.59)/3=1.79 C: K1=(1.07+2.3+1.63)/3=1.667 K2=(1.27+1.51+1.59)/3=1.457 极差（R）=1.7771.457=0.32 K3=(1.48+1.71+2.14)/3=1.777 D: K1=(1.07+1.71+1.59)/3=1.457 K2=(1.48+1.51+1.63)/3=1.54 极差（R）=1.9031.457=0.446 K3=(1.27+2.3+2.14)/3=1.9033 结果与分析3.1 接种培养后,原球茎颜色由淡绿色开始变为淡黄绿色, 基部为白色透明状;然后, 原球茎开始出现膨大; 一段时间后, 每个原球茎的茎顶均长出2-3片幼叶;然后, 原球茎分化形成簇生长的无根丛生芽,各处理组原球茎繁殖系数存在一定的差异. 如表繁殖系数柱状图可看出, 处理5、8繁殖系数较大，而处理1、2繁殖系数较小. 据观察繁殖系数较大的处理其分化状况也相对较好, 其中处理5原球茎分化状况及繁殖系数均较好。3.2 不同处理对原球茎分化影响的直观分析见表4。从原球茎的繁殖系数和各因素的K值（均值）与极差( R)值的柱形图可知, 该试验因素A（图中为1）即6-BA 浓度的R值最大为0.567, 而因素B（图中为2）即IBA的浓度的R 值最小为0.253, 因此可初步推断影响原球茎分化主次程度为ADCB（即1432）,可初步推断分化培养基的最优水平的组合为A2D3C3B3。4 结论4.1 三因素对原球茎分化的影响实验结果表明：IBA 作为植物生长素能促进细胞的生长, 具有低浓度更有利于植物生长的特性, 因此当IBA 为0.5mg /L时原球茎的分化状况最好； 6-BA在植物细胞分化中至关重要, 过高或过低浓度都对分化不利, 因此2mg /L的浓度对圆球茎分化最有利；NAA浓度为0.75mg /L时，有利于圆球茎的分化；而外源添加物对圆球茎的分化也有很大影响，其中苹果最有利于圆球茎的分别年华生长。4.2 本实验的创新点目前, 有关铁皮石斛的原球茎分化和生根条件的研究大都基于单因素试验, 如不同培养基、激素浓度、无机盐浓度、碳源、pH 等以及香蕉、马铃薯等附加物8. 而本实验运用正交实验设计了多因素多水平，可以精简试验次数、克服培养基配方设计的盲目性、大大提高工作效率和试验的可靠性。5 讨论5.1 铁皮石斛原球茎诱导分化实验中污染产生的原因及防治措施。本实验采用的材料是从无菌培养瓶中取出的一代原球茎，所以材料是无菌的。因此产生污染的原因可能是：培养基或接种工具灭菌不彻底、接种室消毒不严、人员因素、超净工作台上的滤网过滤不彻底等等9。防治措施：改善接种室和培养室的环境条件，保证接种与培养环境清洁无菌、操作人员严格遵守无菌操作规程、培养基及接种工器具要严格灭菌，确保灭菌质量、在培养基中加入适量的抗生素等等10。参考文献1 叶秀妹, 刘炜婳, 赖钟雄. 铁皮石斛组织培养研究进展 J. 亚热带农业研究，2012年01期。2 周根余, 谢薇, 程磊. 影响铁皮石斛原球茎生长的若干因素 J. 江西科学, 1999,(4): 231-235.3 黄闽敏, 刘晓芳, 曹青爽. 寒兰组培苗生根培养的多因子正交试验研究 J. 北方园艺, 2009( 4): 53-55.4 方开泰, 马长兴. 正交与均匀实验设计M . 北京: 科学出版社, 2001: 35-52.5 张明, 夏鸿西. 石斛组织培养研究进展 J. 中国中药杂志, 2000, 25( 6): 323-326.6 王国梅, 韦鹏霄, 岑秀芬. 基本培养基和激素组合对金钗石斛原球茎增殖的影响 J. 广西农业科学,