（分析化学专业论文）振动模式扫描极化力显微镜及其在生物大分子测量上的应用.pdf

摘要 摘要 本论文阐述了振动模式扫描极化力显微镜 v i b r a t i n gm o d es c a n n i n g p o l a r i z a t i o nf o r c em i c r o s c o p y v s p f m 的原理 构造及其在生物大分子 如d n a 和抗体分子 测量上的应用 v s p f m 中是在导电的原子力显微镜 a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y a f m 的针 尖上加一偏压 由于样品表面的极化 在针尖和样品之间诱导形成电场 这个 电场力又称为极化力 与范德华力相比 极化力更强 其作用距离也更远 它 叠加在范德华力上 扩大了针尖与样品的距离 与以往的扫描极化力显微镜 s p f m 的不同之处在于 v s p f m 的针尖是在一驱动频率下振动 本实验通过调节相关参数 如偏压 a m p l i t u d es e t p o i n t 4 的大小 实现 了针尖高度在极化力介导下的非接触方式和轻敲方式之间的自由切换 在 v s p f m 的非接触方式中 长程的极化力叠加在范德华力上 这就克服了a f m 非接触方式中范德华力力程太短而成像不稳定的缺点 在极化力介导的轻敲方 式中 可以用比a f m 轻敲模式中最小稳定成像力更小的力进行成像 v s p f m 中 针尖与样品的间距一般在几纳米范围内 范德华力在成像的力 中仍占相当一部分 特别是在极化力介导的非接触方式和轻敲方式的转折点处 范德华力还是主要成像力 而极化力起稳定作用 这是与一般的静电力显微镜 不同的 在生物分子的a f m 成像上 虽然轻敲模式比接触模式横向剪切力更小 对样品的移动和破坏也更小 但针尖压力仍然存在 使柔软的生物分子发生了 很大的变形 成像高度通常小于它们的直径 这种压力实际上是样品原子和针 尖原子间的排斥力 所以在a f m 轻敲模式中测量柔软样品的高度存在一定问 摭嬖 题 本文提供了一种新的基于v s p f m 的测屋树底上柔软样鼹高度的方法 可 敬奁一定程度上消除针尖压力的影响 使测量更为精确 本文工作采用了v s p f m 测量生物分子高度的两种方法 一楚在主扫描串通过改交a 来改变针尖的高度 首先在空自区域定点扫描 图内得到a 的变化值与针尖在z 轴上位移的关系 然后在待测棒品表西烽 懿筐不瑟藏 l 这拜手针尖就不断趋遥样晶 觚祥晶的上表面歼始到衬底表面结 柬 从a 的变化值能够计算出样品的高度 二是逶避调节l i f t 模式下的扫搐高度参数来敬交针尖高度 在主扫描中维 持针尖在一个恒定的高度 而在插入扫描中 不断减小担描赢度参数 从样黯 豹上袭嚣汗始到聿孪底袭蟊结束 扫播离凄参数的差值就是祥品的裔度 本文应用v s p f m 测量生物分子的高度 具商以下优势 静电力的导入扩 大了钟尖与群磊的距离 僮舒尖在垂盛方商上的移动更容易控铺 可以在不同 的高度上稳定成像 因为原子间的排斥力只在几个a 的距离内起作用 针尖的 捡舞使撵斥力逐逮减 l 也就便梯品掰受到静压力减小 所戳发生的形交也随 之减小 测得的样品高度更接近真实饭 在本论文基础上发展出新的测量方法 秘溅塞装嚣与现有技术耱魄 装置结稳魄较筒擎 使瑙方谯 本实验在胶体金颗粒的高度测量上 发现v s p f m 的结果与a f m 轻敲模式 褥裂的结果类织 嚣对于d n a 分子秽抗体分子c a l 2 5 在巅样的针尖 样品 和环境条件下 测量值比a f m 轻敲模式所得到的结果要大得多 不间样品的 结累不露 原瓣在予黢体会颗粒较必坚硬 在a f m 针尖静匿力下变形程度小 而d n a 分子和抗体分子比较柔软 在针尖压力下变形程度大 在枣度测鼙的基戳上 v s p f m 进一步发震了对生黪样熬静弹性研究 a f m n 摘要 对细胞 细胞器及生物分子的弹性研究已经成为一个热点 但在小分子测量上 衬底的干扰不可忽略 v s p f m 在测量小分子的弹性时 针尖对样品施加的力比 以往的力曲线测量法小得多 在最小力处 针尖压力近似为零 这使得对小分 子的测量更准确 因为此时可以避免衬底的影响 在d n a 分子的弹性测量上 本论文突破了原有的轴向弹性模量测量的局限 尝试进行径向模量的测量 关键词 振动模式扫描极化力显微镜 d n a 抗体分子 衬底 高度测量 弹性 i i i a b s t r a c t a b s t r a c t i nt h i sp a p e r t h em e c h a n i s ma n dc o n s t r u c t i o no f v s p f ma r ei n t r o d u c e da sw e l ia s i t sa p p l i c a t i o no nt h em e a s u r e m e n to f b i o m o l e c u l e ss u c ha sd n a sa n da n t i b o d i e s v s p f mi sad e v i a t i o nf r o ms p f m i n v s p f m ac o n d u c t i v ea f m t i pi sb i a s e dt oa v o l t a g ea n da ne l e c t r i cf i e l da r i s e sb e t w e e nt h et i pa n dt h es u r f a c ea sar e s u i to ft h e p o l a r i z a t i o no ft h es u r f a c e c o m p a r e dw i t ht h ev a l ld e rw a a l sa t t r a c t i v ef o r c e t h e e l e c t r o s t a t i cf o r c e a l s ot e r m e dp o l a r i z a t i o nf o r c e i s s t r o n g e ra n dh a sal o n g e rr a n g e t i p s a m p l es e p a r a t i o ni st h e ni n c r e a s e da sar e s u l to ft h ec o m b i n a t i o no f p o l a r i z a t i o n f o r c ew i t hv a nd e rw a a l sf o r c e t h ed i f f e r e n c eb e t w e e n s p f ma n dv s p f m i st h a tt l e b i a s e dt i po fv s p f m i sd r i v e nb yam e c h a n i c a lv i b r a t i o n b yc h a n g i n gv a r i a b l e ss u c ha st h eb i a sa n d a t h et i pc a l lb el o c a t e df r o mn o r 卜 c o n t a c tt ot a p p i n gr e g i o nw i t ht h ea s s i s t a n c eo f p o l a r i z a t i o nf o r c e i nv s p f mn o n c o n t a c tm o d e t h ed i f f i c u l t yo fs h o r tr a n g eo fi m a g i n gf o r c e i na f mi so v e r c o m e b e c a u s eo f t h ec o m b i n a t i o n o f p o l a r i z a t i o nf o r c ew i t hv a nd e rw a a l sf o r c e i nv s p f m t a p p i n gm o d e t h et i p s a m p l ei n t e r a c t i o ni se v e ns m a l l e rt h a nt h em i n i m u mf o r e ei n a f m t a p p i n gm o d e s t a b l ei m a g i n gw i t ht h ea s s i s t a n c eo f p o l a r i z a t i o nf o r c e w h e n t i p s a m p l es e p a r a t i o ni sb e l o ws e v e r a ln a n o m e t e r si nv s p f m v a nd e rw a a l s f o r c ec o n s t i t u t e st h ed o m i n a n t p a r t o ft i p s a m p l e i n t e r a c t i o n s e s p e c i a l l y i nt h e t r a n s i t i o n a lr e g i o nb e t w e e nn o n c o n t a c ta n dt a p p i n g m o d e a n dt h ep o l a r i z a t i o nf o r c e o n l ya s s i s t s i n s t a b i l i z i n g t h e i m a g i n g h o w e v e r i nn o r m a le l e c t r o s t a t i cf o r c e m i c r o s c o p y e f m e l e c t r o s t a t i cf o r c ei st h em a i nf o r c ei ni m a g i n g i nt h ea p p l i c a t i o no fa f m o nb i m o l e c u l e s t h et i pp r e s s u r es t i l l e x i s t si nt a p p i n g m o d ea n dr e s u l t si n g r e a td e f o r m a t i o no ft h e s es o f tb i m o l e c u l e s t h o u g ht h el a t e r a l f o r c ei n t a p p i n gm o d ei sm u c hl e s st h a nt h a t i nc o n t a c t m o d e t i pp r e s s u r ei s e s s e n t i a l l yar e s u l to ft h er e p u l s i v ef o r c eb e t w e e nt h et i pa n dt h es u b s t r a t e t h e v a b s t r a c t a p p a r e n th e i g h t so f t h e s em o l e c u l e si na f mt a p p i n gm o d e a r eq u e s t i o n a b l es i n c et h e y a r ea l w a y ss m a l l e rt h a nt h e i ra c t u a ld i a m e t e r si nt h i sp a p e r w e p r o v i d e an e wm e t h o d f o rh e i g h tm e a s u r e m e n to fs o f t s a m p l e so ns u b s t r a t e sb yv s p f m i nw h i c ht i p p r e s s u r e c a l lb ed e c r e a s e dt oac e r t a i ne x t e n ta n dt h em e a s u r e m e n tw i l lb em o r e p r e c i s e t h e r ea r et w ow a y si nh e i g h tm e a s u r e m e n t b yv s p f m o n ei st oc h a n g e t i p s a m p l es e p a r a t i o nb y a 妒f i r s t l y t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e na a s p a n d v e r t i c a ld i s p l a c e m e n to ft h et i pi nz e r o s c a l es c a n c a nb ec a l c u l a t e da n d c a l i b r a t e di nz e r o s c a l es c a n s c a ns i z ei s0n m t h e nt h e t i p i s p o s i t i o n e do na m o l e c u l ea n d a p p r o a c h e st ot h es u r f a c ew i t ht h ed e c r e a s eo f a s rf r o m t h et o po ft h e m o l e c u l et ot h es u b s t r a t e t h ev e r t i c a ld i s p l a c e m e n to f t h et i pc a r lb ec a l c u l a t e df r o m z j a a n di sc l o s e t ot h et r u eh e i g h to f t h i sm o l e c u l e t h eo t h e ri st oc h a n g e t i p s a m p l es e p a r a t i o nb ya l t e r i n gt h ep a r a m e t e ro f 澎s c a n h e i g h ti nl i f tm o d e t h eh e i g h to f t h e t i pi sm a i n t a i n e di nm a i ns c a n a n di ni n t e r l e a v e s c a r l t h et i pi sl o w e r e df r o mt h et o po ft h em o l e c u l et ot h es u b s t r a t ew i t ht h ed e c r e a s e 醯i 疆s c a nh e i g h t t h ed i f f e r e n c ei nt h ep a r a m e t e ro f l 渗s c a n i g h t a p p r o x i m a t e s t h e t r e eh e i g h to f t h i sm o l e c u l e t h e h e i g h tm e a s u r e m e n t c a r r i e do u tb yv s p f mh a ss o m e a d v a n t a g e s t h ev e r t i c a l m o v e m e n to ft h e t i p i sm o r ec o n t r o l l a b l ew i t ht h e a s s i s t a n c eo fl o n g r a n g e p o l a r i z a t i o nf o r c e a n d s t a b l e i m a g e s c a nb eo b t a i n e da t d i f f e r e n t t i p s a m p l e s e p e r a t i o n w i t ht h el i f to ft h et i p r e p u l s i v ef o r c e t i pp r e s s u r e d e c r e a s e sr a p i d l y b e c a u s ei t se f f e c t i v er a n g ei s o n l ys e v e r a la n g s t r o m sa n dt h ed e f o r m a t i o ni sr e d u c e d c o n s i s t e n t l y t h en e wm e t h o da n da p p a r a t u so ft h em e a s u r e m e n td e r i v e df r o mt h i s p a p e ri ss i m p l ea n da c c e s s i b l ec o m p a r e dw i t ht h ee x i s t i n gt e c h n i q u e s t h em e a s u r e d h e i g h t so f c o l l o i d a lg o l dp a r t i c l e sb yv s p f m a r ea l m o s tt h es a m ea s v a b s t r a c t t h o s ei nt m a f m b u tt h er e s u l 拓o fd s d n aa n da n t i b o d i e sb e h a v ed i f f e r e n t l ye v e n u n d e rt h es a m ec o n d i t i o n ss u c ha st i p sa n ds a m p l e s ap o s s i b l er e a s o ni st h a tt h e 谛 p r e s s u r e i na f mt a p p i n gm o d er e s u l t si n l a r g e d e f o r m a t i o no ns o f td n aa n d a n t i b o d i e sb u tn o to n r i g i dc o l l o i d a lg o l dp a r t i c l e s e l a s t i c i t ym e a s u r e m e n t o nb i m o l e c u l e sb yv s p f mi sn o w b e i n gd e v e l o p e do nt h e b a s eo f h e i g h tm e a s u r e m e n t a l t h o u g hm a n ya f mr e s e a r c h e sh a v eb e e nf o c u s e do n t h ee l a s t i c i t ym e a s u r e m e n to f c e l l s o r g a n e l l e sa n db i m o l e c u l e s t h ei n f l u e n c eo ft h e s u b s t r a t e sc a n n o tb en e g l e c t e di nt h ec a s eo fs m a l lm o l e c u l e s t h ef o r c e st h a tt i p s a p p l y t o s a m p l e s i nv s p f ma r em u c hs m a l l e rt h a nt h a ti nf o r c e c u r v e s a n d a p p r o x i m a t ez e r oi nt h et r a n s i t i o n a lr e g i o nb e t w e e nn o n c o n t a c ta n dt a p p i n gm o d e w h i c he n s u r e st h ep r e c i s i o ni ne l a s t i c i t ym e a s u r e m e n tb e c a u s eo f t h ee l i m i n a t i o no f t h ei n f l u e n c eo ft h es u b s t m t e s o nt h ee l a s t i c i t ym e a s u r e m e n to f d n a w ec a ng e t r a d i a le l a s t i cm o d u l u s w h i l et h ep r e v i o u ss t u d i e s o n l yg a v eo u ta x i a lr e s u l t s k e y w o r d v i b r a t i n gm o d es c a n n i n gp o l a r i z a t i o nf o r c em i c r o s c o p y v s p f m d n a a n t i b o d y s u b s t m t e h e i g h tm e a s u r e m e n t e l a s t i c i t y 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究 成果 据我所知 除文中已经注明引用的内容外 本论文不包含其他个人已经 发表或撰写过的研究成果 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体 均已在 文中作了明确说明并表示谢意 作者签名 学位论文使用授权声明 本人完全了解华东师范大学有关保留 使用学位论文的规定 学校有权保留学位论文 并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版 有权将学位论文用于非赢利 目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅 有权将学位论文的内容编入有关数据 库进行检索 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版 保密的学位论文在解密后适用本规 定 学位论文作者签名 日期 沙 弓撇各撬 彤 日期滚脚 勿 垆 第一牵引言 第一章弓f 言 1 1 原子力显微镜 a f m 的基本原理 a f m 是一种超微成像技术 由b i n n i g 及其台作者在1 9 8 6 年发明 l 它不 仅在生物棒最的表露托孝 结构硬究方嚣取缮了事萋或续 嚣虽在生物楼熬戆力 学特性磅究方嚣毽逐速发震 在a f m 中 将一个对徽弱力极为敏感的微慧臂 c a n t i l e v e r 一端固定 另 一端接一微小针尖 针尖与样品表面可轻轻接触 针尖尖端的原子与样品表面 原子间存在着极微小的吸引力或排斥力 将这种力控制为恒定 带鸯针尖的微 悬臂在萋虚于样品表露驰方国上起伏运动 剥用必学浆检测方法可谗录下暴饕 对盛予捂摧各患戆霞置交亿 这襻 裁可获褥祥晶表裔酌形貌信息 用予表面拓扑形貌观察的a f m 工作模式有三种f 2 t 接触模式 c o n t a c t m o d e 轻敲模式 t a p p i n gm o d e 非接触模式 n o n c o n t a c tm o d e a 在接触模 式下 针尖与样品一直保持接触 以悬甓的偏折羹傲为反馈信号来保持针尖与 样品阀作熠力鲍恒定 农轻敷模式中 懋譬在其欺振频率瓣近搬动 在摄动簿 麓懿簌部敲击群品 锌尖程样品静裙互作雳哥改交其振幅 黻振幅的r m s 值律 为反馈信芍傈持针尖与样品的恒定间距 在非接触模式下 悬臀也以一定频率 振动 但针尖与样品不接触 其相瓦作用使怒臂的共振频率发生偏移 以频率 的变化值作为反馈信号来控制扫描管的伸缩 接触模式可以获褥离分辨率的图 像 但针尖与榉晶鲍接触也会对样品表嚣造成一定损像 轻敲模式减少了针尖 瓣样菇救援伤 并曼也麓获褥分辨率较离静窝象 嚣前在接触稻轻蔽两种模式 下 分辨率一般为纳米水平 在某些特殊样品表面可达猁亚纳米水平 第一章 言 1 2 拯接极他力显微镜 s p f m 1 2 1 装置和原理 a f m 可以在几乎任何环境 如空气 真空 惰性气体及液体中 得到固体 样品表丽的原予级结构图 但与扫描探针显微镜 s c a n n i n gp r o b em i c r o s c o p y s p m 家族斡茭缝戚受一样 瓣滚薅袭瑟戆成豫仍然是令空鑫 一秘赣豹显徽 镜技术在此背聚下应运而生 这就是扫描极化力显微镶 s c a n n i n gp o l a r i z a t i o n f o r c em i c r o s c o p y s p f m 3 1 9 a s p f m 的针尖是a f m 的s b n 4 针尖 表面镀一层厚1 0 0 1 0 0 0 a 的p t 或a u 阂菇这嚣耱金弱都是壤瞧熬 不易在空气中氧纯 缦稳定 在藏导电针尖上施 加几伏的电压 针尖与榉品之闻就形成电场 通过测量和控制针尖与样品闻的 吸引力 这种吸引力是静电力和范德华力中的引力的叠加 就可以控制针尖与 样品的闯距来对样品表蕊进行成像 静电力来自样品表丽的极化和在电场作用 下移动懿电蔫 蠢毫荣移动在a f m 铮尖辩运雯强 辍纯力 这个名称主要是 强调引起图像反蒺的针尖与样晶问作用力的物理本源 对电极不需要与榉品相 涟 可以接地 样品可以是绝缘体 针尖附近的电场是由针尖的曲率半径 而 不是由对电极的位置决定的 s a m 圈1s p f m 戆示意耀 第一章引言 s p f m 中静电力的长力程对液体表面的成像起关键作用 当针尖上所加偏压 为几伏时 针尖与样品间的吸引力是n n 级 唰距几十n m 这就减小了针尖对 液体的扰动 但同时也降低了横向分辨率 这个分辨率不会小于针尖与样品的 间距 但比起光学显微镜u m 级的分辨率还是好很多 s p f m 的垂直分辨率不 受针尖 样品间距的影响 只由仪器的噪声决定 达到亚a 级 在s p f m 中 电子反馈系统控制悬臂向下的偏折量为恒定值 也就是说受 到的吸引力恒定 这时所得到的图像反差不仅来自样品表面的形貌变化 对于 相同高度 不同介电常数的表面 由于所产生的静电力不同 在图像中的表现 高度也不同 极化力与所加偏压的频率有很大关系 新鲜剥离的云母表面除了有大量的 k 离子外还有别的离子如h 在直流和低频交流的条件下 如果样品表面有水 膜 这些离子外面就会形成水合层 从而大大降低了这些离子与衬底的结合能 提高了它们在表面扩散的能力 水合离子在电场的作用下做长距离迁移 对极 化力有很大贡献 在s p f m 中 悬臂并没有受到一外界压电陶瓷的驱动 但如果悬臂上所加 的是交流电压 而且环境湿度较高及样品表面有相当浓度的离子时 悬臂还是 能够以一定频率振动 具体地说 在偏压的一个周期内 当悬臂上所加的电压 为正时 样品表面的负电荷在电场作用下向针尖方向移动 悬臂受到的是吸引 力 而当电压转为负时 此时样品上的负电荷还来不及移走 悬臂就突然受到 一个排斥力 然后随着正电荷的逐渐补充 悬臂受力方向又改变 所以在一个 电压周期内 悬臂的受力方向会改变两次 悬臂实际振动的频率是所加偏压频 率的2 倍 当所加偏压频率是悬臂固有振动频率的一半时 悬臂的振动幅度最 第一章引言 大 悬譬戆振动蘸度还与湿度有关 璇湿度鑫每下降嚣增大 1 2 2 瘦用 s p f m 首先被用来研究云母表面水的凝聚 新鲜剥离的云母在5 0 的相对 湿度 r h 环境中 表面会形成单分子水膜 厚2a 如果把s p f m 的针尖辍 轻接触一下云母表藤 幽于毛细傍用 在接触点会弓l 进掰瓣承鼹 形成警整熬 块状结拘 这磐结檐戆袭戏嵩度为足令轰 滚然羧舷点大小只存凡个蕊 这鎏 块款永骥可敬延续凡千pm 一段对闻后 这些结构就会消失 水膜一般具有 t 2 0 角的多边形状 与随后的云母表面的a f mc o n t a c t 模式成像比较 可以明 显看到这些区域的边界与云母表谢周期结构取向类似 这说明袭层水膜是有序 的 取向与云母的终构鸯关 类似二维的拣的结橡 酸东孝芎辩 翅嚣墨 表瑟是不浸溺的 麓s p f m 来蚕羿究石篓表瑟电解质溶 液如k o h 液滴的缩构 可戳看到表面即使融被吹干 在光学显微镜下 还是 有许多小液滴 特别是在台阶边缘 这魑液滴的尺寸 浓度只由环境湿度来决 定 与初始浓度无关 在高湿度下 这姥液滴会膨胀 而在低湿度下会收缩 童到形成绩晶水合物沉淀 大气g l 起黪化学瘸镶对许多金属都楚严鬟载藏耱 始含有硫酸秘雨滚霜露 窳都会弓 超铝的腐镪 s p f m 可以观察铝被硫酸腐蚀的过程中的物理 化学变 化 酋先将h 2 s 0 4 液体滴在a 1 的表面 然后快速地用气流吹掉 这样就产生了 贬微米级的液滴 h s 0 4 的浓度与起始浓度无关 在与环境达到平衡后 浓度 只与r h 稳关 r h 3 0 的条l 牛下 经过2 小时 这些波濂基零无变化 谈暖a l 狡浓硫酸键德了 r h 舞裂9 0 戬上 这些波滚鸯予嘏浚了空气牵静承 髓显 交大 当逸剜最大静膨涨体积薅 这些液滴就铺震开并融合起来 同样的实验 第一章i l 宦 在金表蔼展开时 金不与h s 0 4 反应 液滴只是膨涨丽不展歼 由此可免 液 滴的展歼反映了腐蚀威戚的开始 如果搏撼a l 表面的r h 降低 榉黯裁有明显 糍变 姨均匀的a 1 s o a 选s 0 溶液到小液瀛鲍形袋 然詹逡蹙小液滴逐激增 多 郄毽r h 2 0 遮黧滚滴仍熬存在 说疆它们蔻飙a 1 2 s o a 中橱蹬静来爱 成究的h 2 s o 当r h 足够低时 a 1 2 s o b 形成晶体 壤 s 酝与a l 表嚣隧开 黻褥滋一步静疼饿 l 3 静瞧力显檄镜簿f 黻 1 3 1 原理 e f m 也怒在导电的a f m 针尖上抛 偏压 与s p f m 不阅的爨针尖至少在 稿箍懿一拳霹蔑褒以鼹定额率强蘸 它旁褥糖戚像方式 瞧搦攥瘦戴稼黎表 谣电势成像 这两种成像方式都要用到两通道的l i f t 模式 在主扫描 m a i n s c a n 中 用t a p p i n g 模式完成一道扫描线 得到榉品的表嚣形貔 然朦像置不变 铮 尖焱播入据搂 i n t e r l e a v es c a n 中漤主籀掇翁扫攒赣迹捻蠹一个寒度 这个每 度酃l i r 乎曩箍高度 1 i f ts c a nh e i g h t 完成第 道掴摇线 如j 圪交嵇进行 型2 援入 登撼涿意辫 1 惫臀在第一次搦描 盎躲描 中测蠡样龋的袭面形貌 2 懋臂抬升一个高度 3 墨 皇 蔓 一 悬臂在第二次扫描 插入搦描 中澄主扫描的轨嬷运动 厨时记录静电信息 摘自d i g i t a l i n s l r u m p 月t 殆p c m e t r o t o g y g r o 印韵n a n o s c o p e i i i a 扎 拥 d e 州即肼说明二转 的4 3 1 版 1 电场梯度成像 程主扫描裁矮入摇摇中 悬譬在压毫晦瓷熬驱动下以一藿定鹣频率羰动 驱动频率 d r i v i n gf r e q u e n c y 选择在共振频率 r e s o n a n tf r e q u e n c y 附近a 如果受 到癸力 乍蔫 基鬻静共振频率会改变 啜 l 力使悬臀表滋得更 软 共振频率 降低 反之 如果受至q 排斥力 则共振频率升离 如图3 所示 可以用三种方式探测插入扫描中悬臂共振频率的偏移 相检测 p h a s e d e t e c t i o n 频率滔钱 f r e q u e n c ym o d u l m i o n 毒 1 摄辐硷溅 a m p l i t u d ed e t e c t i o n 藩 两种必需用扩展电子模组 e x t e n d e re l e c t r o n i c sm o d u l e 图像上的反差 c o n t r a s t 来骞予样品表西静电力裙瀵g 起兹憨帮共振额率弱偏移 虻 因f r e l u e l y a t t r a c t i v e 剑 a d i e n te q u i v a l e n tt o d d i t i o n 1 i 即n 皑i r lt e n s i o na t t a c h e d i ot l p t 州u c i n 盛t h ec a n n l i x s o n a n c cl r c q u 口n c u 图3 外力作用引起的悬臂共搬频率的改变 摘自d i g i t a l i n s t r u m e n t v e e c o m e t r o t o g y g r o u p 的n a n o s c o p e i i i a m u l t i m o d e t m s p m 说明书 的4 3 1 版 电场梯度成像适用于表丽电势起伏较大而拓扑形貌鞍平整的样品 否则拓 6 图堑 扑形貌信息就会掺杂在表面电势的成像中 因为在越粗糙的表面 静电力梯度 越密集 在电场梯度成像中 既可以在针尖也可以在样品上加电压 但如果样 品本身有永久性的电场 就不需要外加偏压 2 表面电势成像 表面电势成像中必须用到扩展电子模组 成像方式与k p m k e l v i np r o b e m i c r o s c o p y 和s c a n n i n gm a x w e l ls t r e s sm i c r o s c o p y 类似 在插入扫描中 压电 陶瓷晶片的振动停止 在针尖上加一振动电压v c o s c o t 针尖与样品之间产 生振动的驱动力f 鼽打r 其中 一 帆是针尖与样品间的直流电势差 当 0 即针尖与样品的电位相等时 针尖就不再受到振动的驱动 力 此时可以确定样品表面的电势 针尖上所加的电压就反映在e f m 的 图像中 表面电势成像适用于粗糙表面或表面电势起伏较小的样品 1 3 2e f m 在d n a 分子导电性能测量上的应用 测量电阻最简单的方法 是在待测体两端引出两根导线然后与直流电源相 接 从电压电流关系得到电阻大小 在d n a 导电性的测量上 这也是一种方法 将d n a 的一端用金层覆盖 作为一极 导电针尖作为另一极 测量通过d n a 的电流1 2 0 2 2 1 但针尖与样品间的接触电阻可能很大 结果使测量得到的d n a 电阻值偏大 有些小组用e f m 的方法测量d n a 的导电性1 2 3 2 6 1 排除了针尖与 d n a 分子接触不良的可能性 因为它事实上是一种非接触的成像模式 实际操 作方式有三种 第一露 言 1 将d n a 分子啜瓣在云蹲褥底上 震热蒸发法溅积金屡 d n a 键嚣一臻 被一微米级的金电极覆盖 2 d n a 的 端与s w n t s i n g l ew a l l e dc a r b o nn a n o t u b e 相谶 而s w n t 的 另一瑞再与金电极连接 3 d n a 滋积在云舔衬底 不与强褥电擞程连 鬓4 翻 m 方法测爨撵瑟导电蛙的零意匿 摘自p r o e n a t l a c a d tus a 9 9 1 3 8 4 8 4 2 0 0 2 蘸掰耱方法中 在众龟稷上热一穰疆 锌尖接遗 针尖与群晶之闻就形或 电势差 针尖和撑品之阈的静惫力由运动电蕊秘静止电耱改密魔及形状决定 从静电角度来看 分子导线 包括d n a 和s w n t 都可以被认为是电阻电容 当电荷通过电阻时 电容就带电 导线的电子传输性质l 圭j 运动电荷韵密腹和移 劝戆力决定 通过溅量电容土表露静宅力酌大小可戳褥翻电容掰带的龟爨 在 纳米尺度陡 e f m 鲍针尖就是一个很好的力探测器 针尖以一定豹撮蠛裙频率 搬动时 针尖和样品分予间的静电力使针尖的共振频率发生偏移 如果在所测 擞的分子上没有观察到频率偏移 说明分子内部没有电荷传递 则该分予是绝 璺 兰 堇 缘的 在第三褥方法中 针尖上翔一僚压 群瑟势予逶过较纯律麓澎残漱蓊 龟 量与分子匏分电常数有关 在前两种方法中 即使针尖上所加电压上升到1 2 v 与金电极相避的 d n a 链的对比度也没有明显变化 说明没有电荷在d n a 内流动 同时进行k p m 检 测 k p m 的原理是通过晟小化针尖与样品间的静电力来得到表面的电势像 可 以将样品的静电力信息与拓扑形貔分开 在d n a 链的k p m 图像上没肖对比度 d n a 与衬底混为一体 与筵疆毙 s w n t 翻完金不瓣 当趣投主爨燕电压是2 v 潜 与众毫稷褶 连的碳管表现得更高更宽 隧麓电压的下降 碳管豹对比度也躐小 这主要是 因为碳管是一种导电性能较好的材料 而在导电区域聚集的电荷比绝缘区域的 多 产生的静电力也更强 叠加在范德华力上 所成的图像上不仅殷映了导电 材料的拓扑形貌 也叠加了静电信息 在k p m 图像上s w n t 仍然有对比度 移动电荷达到平衡需要一段时阕 如果是导体 静电平衡的时阕锻短 远 j 予e f m 匏或像嚣霹 爱淤对s w n t 来说 褥裂懿是静龟乎籀捧孛戆黧像 嚣 电芬滚动直到与赝连接龟缀的泡势相等对的盈缘 如果一个导窀能力撬麓豹分 子固定在绝缘性能很好的衬底上 达到静电平衡就需要很长时间 黼谯xd n a 样品上 经过一夜也没有观察到对比度的变化 说明 d n a 即使有导电性 电 阻也非常大 与云母接近 如果把 d n a 换成p o l y c p o l y g 也能得到同样 的结果 l 4d n a 兹样品剑各 不论在a f m 还是v s p f m 枣 蕊察荠测量圭魏分子 魏d n a 熬鼹摇条 第一雄引富 粤楚裁鍪分数赵好显背爨摄小夔撵晶 绣鞋树底露 冬方法缀重要 1 4 1 在氨基亿的云母表面 3 氨基丙基三乙氧熬硅烷 3 一a m i n o p r o p y lt r i e t h o x y s i l a n e a p s 修饰的云母 较为常用 2 7 2 8 1 经处理过的云母表面有许多带磁电的氯基 可以吸附带负电的 d n a 但这种方法处理过的衬底平整度较难控制 另终由于较强鲍吸黠能力 d 後不窭易震开 精胺 s p e r m i n e 和噩精藏 n i m n 2 z n 2 c d 2 d i 耋o 1 衄时 可认为此处是点a 的上表面 相应的d 定义为d 1 0 p a s p 定义为a 刚0 p 当d 满足旧一d t m 0 1n m r m s s 时 r m s s 是t m a f m 中衬底的粗糙 度 d h 是点a 在t m a f m 下的表观高度 认为此处是点a 的基面 相应 的a s p 定义为a p f o p 针尖从点a 的上表面到基面的位移 d z 可以从公式2 计 算得到 然后点a 的高度 d 等于d 加d 公式3 d z 2 k 口 1 0 p 厂a p 2 箜三兰堑塑查查查 一 d d 帅 d z t h e t r a c ko f t h e t i p 3 图1 2v s p f m 中通过改变爿 来测量样品高度过程的示意图 i 针尖刚感受到样品分子的作用力 为保持针尖一样品间作用力的恒定 即保持针尖振 幅的恒定 针尖上抬 i i 随着a 的减小 针尖逐渐靠近样品 因为针尖一样品闻作 用力的增大 振幅减小 但一直保持恒定 1 1 1 此时针尖已经非常接近样品 可以感受 到衬底的作用力 振幅进一步减小 针尖在竖直方向上的位移接近于样品的高度 2 4 2l i f t 模式下改变针尖的高度 通过调节l i f t 模式下的扫描高度参数来改变针尖高度 如图1 3 所示 在 m a i n s c a l a 中 调节所加的偏压或a p 使针尖远离样品 使样品在图像上没有反 差 这样维持针尖在一个恒定的高度 而在i n t e r l e a v es c a n 中 不断减小l i f t s c a nh e i g h t 从样品的上表面开始到衬底表面结束 扫描高度参数的差值就是样 品的高度h 第二章材料和方法 i i m 鞠1 3v s p f m 审遴过改交l i f ts c a nh e i 酶 来测量榉晶高度避程静承意圈 焱此赢疫钟尖剐感受到撵晶分子的份熠力 但铮尖的轨迹不变 在榉鑫静正土方掇蠛 略宵减小 i 随着l i f ts c a nh e i g h t 的减小 针尖逐渐靠近样品 针尖一样品间作用力 增犬 此处擞蟠进一步城小 i i i 此对毒t 尖已经非常接近梯晶 可以感受到挂疯的作煺 力 在感受到作用力的区域振幅减小 针尖在竖威方向上的位移接i 琏于样品的高度 第三章实验结果 第三章实验结果 3 1d n a 拉伸效果与速度的关系 图1 4 是未经过拉伸的d n a 分子 可以明显看至i j d n a 互相缠绕成束状 但 经过分子梳的拉伸后 这些束状物就可以分成单根的d n a d n a 分子的取向与 分子梳的方向平行 图1 5 图1 4n i 2 修饰的云母衬底上未经过拉伸的d n a 分子 d n a 浓度是1 5n i a 5g m 5 j a m b 1p m 1 m zr a n g e 是5n m 图1 5n i 2 修饰的云母衬底上用不同速度分子梳拉伸的d n a 分子 d n a 浓度是1 5n 咖l a 1 c m s b 2 c m s c 4 c m s 扫描范围 4g mx4p m z r a n g e 是3n m 不同浓度的n i n 0 3 溶液修饰的云母衬底的吸附能力不同 对d n a 的拉伸 效果就有很大影响 当浓度d 于1 0 0m m o l l 时 随n i 2 浓度的升高拉直的d n a 第三章实验结果 数目也明显上升 但当n i 2 浓度大于1 0 0 m m o l l l