实验八 酵母RNA的提取及成分鉴定(浓盐法).ppt

实验八酵母RNA的提取及成分鉴定（浓盐法）,实验目的,掌握浓盐法提纯RNA的基本原理和方法了解RNA成分鉴定的原理及其方法,实验原理,核酸的分类与分布,DNA：主要存在于细胞核的染色体中,线粒体、叶绿体、质粒有少量RNA：存在于细胞质中,样本的选择：,酵母RNA（RNA占干重的3%-10%）,制备方法：,稀碱法、浓盐法,破碎细胞,提取,纯化,I.材料准备II.破碎细胞或包膜内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中,制备过程：,RNA以可溶性钠盐的形式游离析出,离心去除菌体,收集上清液,调至RNA的等电点（pH22.5）,使RNA沉淀析出，离心收集沉淀,乙醚洗涤沉淀、去除杂质、提纯RNA,浓盐加热使酵母细胞壁破裂，蛋白质变性沉淀,RNA提取方法(浓盐法),RNA成分鉴定,RNA在强酸性条件下沸水浴加热可以水解：,1.磷酸鉴定,通过鉴定RNA的三种水解产物来鉴定RNA:,钼酸铵,磷钼酸+FeSO4,钼蓝（蓝色）,2.碱基(嘌呤)鉴定,3.核糖鉴定,5-甲基间苯二酚,（蓝绿色）,糠醛,仪器试剂,仪器,精密pH试纸（pH0.55.0）、广泛pH试纸（pH114）、冰块、锥形瓶、离心机、天平、电炉,干酵母、10NaCl、6MHCl、冰块、5氨水、(NH4)2MoO4,试剂,实验操作,酵母RNA提取（4人一组）,1.酵母破壁：,10NaCl(40mL),100mL锥形瓶煮沸,加入干酵母（一勺）,沸水浴40min,取出冷却,玻棒搅匀,取出锥形瓶,自来水冷却后转入50mL离心管,3500rpm离心5min,取上清,2.离心分离RNA,两两平衡后对称放入离心机中,3.沉淀提纯RNA,将上清液转入小烧杯中（不可带入沉淀）,冰浴中冷却,用6MHCL调pH值至2.02.5(RNA等电点),冰浴中静置5-10min（可见烧杯底部有大量沉淀）,轻轻摇匀后转入离心管，两两平衡后对称放入离心机,3500rpm离心5min，并收集沉淀,精密试纸,如何调pH值？,2.0,RNA成分鉴定,溶解RNA,2.水解RNA（此处开始2人一组）,加22d1.5MH2SO4沸水浴10min,取5mlRNA至大试管溶液澄清,加1d蒸馏水搅成糊状加10ml蒸馏水搅匀加5%氨水至pH6-7，继续滴加至沉淀完全溶解,广泛试纸,核糖鉴定：20d水解液+20dFe3+HCL+2d5%的5-甲基间苯二酚,3.RNA成分鉴定,嘌呤鉴定：20d水解液+20d0.1molAgNO3,磷酸鉴定：20d水解液+20d钼酸铵+FeSO4结晶粉,加浓氨水至沉淀消失,+10d浓氨水,沸水浴15min,摇匀,沸水浴2min,沸水浴2-3min,？,？,？,（绿豆大小）,离心机的使用方法,1.选择合适的离心管2.使用天平对所离心样本（包括离心套筒）称量配平3.打开离心机电源，设定离心速度和离心时间4.按“停止”键打开离心机盖子，将样本按中心对称放置,5.盖紧盖子，按“离心”键启动离心6.离心结束后，待仪器完全停止转动后方可打开盖子取出离心管,实验结果,123,1号：磷酸鉴定（蓝色）2号：碱基鉴定（红棕色）3号：核糖鉴定（蓝绿色）,思考题,