（遗传学专业论文）细胞有丝分裂相关激酶aurora+c的功能研究.pdf

指导小组成员 y 7 6 9 5 3 7 余龙复旦大学遗传所 教授博导 赵寿元复旦大学遗传所 教授博导 吴超群复旦大学遗传所教授博导 专强要霉嘲 | l 旦大学博士论文 人妻有置分曼相关越肆a u r o r a c 曲功能研究 摘要 a u r o r a 激酶属于丝氨酸苏氨酸蛋白激酶家族，是目前研究得较为深入的调 控细胞有丝分裂的激酶家族。在哺乳动物细胞中，这个家族含有三个成员：a u r o r a a 、b 和c 。 a u r o r aa 从有丝分裂的前期到末期均定位在中心体上，对纺锤体的装配起 着重要作用。用s i r n a ( s h o r ti n t e r f e r i n gr n a ) 干扰a u r o r aa 后，中心体不能募 集果蝇中的d t a c c ( d r o s o p h i l at r a n s f o r m i n g a c i d i c c o i l e d c o i lp r o t e i n ) 、 c e n t r o s o m i n 和酵母中的一- t u b u l i n ，最终损坏了微管的组装和中心体的形态。过 量表达a u r o r aa 会使中心体的数量增加，产生异倍体，最终导致哺乳动物细胞 的转化。 a u r o r ab 是一个染色体伴随蛋白，它可以磷酸化哺乳动物细胞中的组蛋白 h 3 。在果蝇中，s i r n a 干扰a u r o r ab 后h 3 不能被磷酸化，导致染色体无法正 常凝聚和分离。在线虫中，s i r n a 干扰a u r o r ab 后使细胞产生多核体。许多证 据表明a u r o r ab 和另外两个染色体伴随蛋白结合，它们是s u r v i v i n 和i n c e n p ( i n n e rc e n t r o m e r ep r o t e i n ) 。将这三个成员中任何一个消除掉都会干扰其他成员的 定位，说明在有丝分裂中它们对彼此的定位和功能互相依赖。a u r o r ab 、s u r v i v i n 和i n c e n p 在许多癌细胞系中都上调表达，这些事实说明这个复合物成员的协 同上调表达以及通过s u r v i v i n 的增加来提高a u r o r ab 激酶活性的现象对于细胞 转化和肿瘤形成都是非常重要的。 尽管人们对人类的a u r o r a a 和b 以及其他物种中a u r o r a 激酶家族的成员 诸如：i p l l p ( i n c r e a s e i n - p l o i d y1 ) ( s c h i z o s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) ，a i r s ( a u r o r a i p l l pr e l a t e dk i n a s e s ) ( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ) a u r o r a 和i a l ( d r o s o p h i l a m e l a n o g a s t e r ) ，p e g l 和p e g 20 ( e n o p u sl a e v i s ) 等进行了许多深入的研究，但是， 人类a u r o r a 家族的第三个成员a u r o 阳c 却少有人问津。 a u r o r ac 是在一次筛选小鼠精卵表达的激酶时被克隆的，它在哺乳动物的 睾丸中高表达。它的基因定位在1 9 q 1 3 4 3 上，这个区域在癌组织中经常有易位 和删除。a u r o r ac 蛋白在某些癌细胞系和结肠癌组织中上调表达。在细胞周期 中， a u r o r ac 在s 期表达水平很低，而在有丝分裂中表达量最高。早期的研究 认为a u r o r ac 出现在后期的中心体上，并维持在那里直到胞质分裂。然而，除 了上述这些结果外，a u r o r ac 的生物学功能却一直无人所知。因此，本文对a u r o r a c 的亚细胞定位和它在正常及癌细胞中的功能进行了初步的研究。 在从人类睾丸c d n a 文库扩增a u r o r a c 的过程中，除了获得已报道的a u r o r a c 的c d n a 序列之外，我们还意外地获得了另一个新的剪接本。这个新型的剪 复旦大学博士论文人鼻音笠分_ l 相关照尊a u r o r a c 曲耐蠢研丸 接本编码一个n 端缩短了的蛋白质。我们将这个新型的剪接本命名为a u r o r a c s v ( s p l i c i n gv a r i a n t ) 。通过1 8 种组织的r t p c r ，我们发现a u r o r ac 和a u r o r a c s v 都在睾丸中高丰度表达。如果扩增a u r o r ac 的c 端，则发现a u r o r ac 不 仅在睾丸中高表达，在其他检测的1 6 种组织中也广谱存在。a u r o r ac 的表达水 平在肝癌和癌周肝组织中没有明显差异。体外激酶实验证实了a u r o r ac 和 a u r o r ac s v 均有磷酸化底物m b p 的活性。它们相应的d 1 6 6 y 和t 1 7 9 a 突变 体则失去了激酶活性。 为了观察a u r o r ac 在细胞中的定位，我们将融合了e g f p 蛋白的a u r o r ac 转入h e l a 细胞，结果发现在有丝分裂的前期和中期，a u r o r ac 定位在染色体上。 当染色体开始分离，细胞分裂进入后期时，a u r o r ac 则定位在纺锤体的中间区 域。当细胞分裂进入末期，a u r o r ac 又定位到缢缩环的皮层。最后，在胞质分 裂中，它定位在中体上。因此，我们认为a u r o r ac 是一个新型的染色体伴随蛋 白。除此之外，我们在有丝分裂的细胞中还迸一步观察到a u r o r ac 可与a u r o r ab 及s u r v i v i n 共定位。而且，a u r o r ac 能够与a u r o r ab 和s u r v i v i n 形成一个复合 物，并在体外与s u r v i v i n 直接结合，但是与a u r o r ab 则不能直接互作。 就像a u r o r a b 一样，激酶的活性对于维持a u r o r a c 的正常定位是必需的。 a u r o r ac 的激酶失活突变体及其野生型的过量表达都可以使细胞产生多核体。 这就给了我们一个启示：a u r o r ac 对于胞质分裂是必需的。野生型a u r o r ac 可 以挽救由a u r o r ab 激酶失活突变体引起的多核体现象，反之亦然。同时，野生 型a u r o r ac 也可以挽救由s i r n a 干扰a u r o r ab 的表达所引起的细胞多核体现 象。这些结果表明在胞质分裂中a u r o r ac 可能具有与a u r o r ab 相似的功能。最 后我们还发现无论是表达丰度还是激酶活性，a u r o r ac 都比a u r o r ab 低。 综上所述，本文的研究证明，a u r o r ac 在有丝分裂的过程中具有与a u r o r ab 类似的功能，它们之间可以在功能上互补。基于a u r o r ac 和a u r o r ab 的序列相 当保守而它们的组织表达谱却不尽相同，这就暗示了在哺乳动物体细胞的有丝 分裂中，a u r o r ac 还有可能参与调节了其他我们还没有发现的一些事件：比如 纠正动粒微管之间粘附的错误，确保纺锤体的稳定性等。然而，在a u r o r ac 和 a u r o r ab 之间是否真的存在功能上的差异? 在有丝分裂和减数分裂中，a u r o r ac 是否具有其独特的功能? 这些都有待于进一步研究。 关键词：a u r o r a c ，剪接本，激酶，染色体伴随蛋白，s u r v i v i n ，有丝分裂，胞质 分裂 2 旦太季博士论文 人粪右量分裂相关漱a u r o r l c 的琦箍研究 a b s t r a c t 1 1 1 ea u r o r ak i n a s e sf a m i l y ，b e l o n g i n gt os e r i n e t h r e o n i n ep r o t e i nk i n a s e s ，i s c n r r e n t l yo n eo ft h em o s ti n t e n s e l ys t u d i e df a m i l i e st h a tr e g u l a t em a n yp r o c e s s e s d u r i n gc e l ld i v i s i o n i nm a m m a l i a nc e l l s ，i tc o m p r i s e sa u r o r aa ，ba n dc a u r o r aai sl o c a l i z e da tt h es p i n d l ep o l e sf r o mp r o p h a s et ot e l o p h a s ea n dh a s e m e r g e da s ac r i t i c a lf a c t o ri nt h ea s s e m b l yo ft h em i t o t i cs p i n d l e d e p l e t i o no f a u r o r aa b yr n a i ( r n ai n t e r f e r e n c e ) d i s r u p t sc e n t r o s o m a lr e c r u i t m e n to fd - t a c c ( d r o s o p h i l at r a n s f o r m i n g a c i d i c c o i l e d - c o i lp r o t e i n ) c e n t r o s o m i ni nnm e l a n o g a s t e r a n d ? - t u b u l i ni n & c e r e v i s i a e , l e a d i n gt od e f e c t si nm i c r o t u b u l ea n dc e n t r o s o m e m o r p h o l o g y o v e r - e x p r e s s i o no fa u r o r aa c a u s e sa ni n c r e a s ei nc e n t r o s o m en u m b e r a n da n e u p l o i d y ，l e a d i n gt ot h et r a n s f o r m a t i o no f m a m m a l i a nc e l l s a u r o r abi sac h r o m o s o m a lp a s s e n g e rp r o t e i n i tc a l lp h o s p h o r y l a t eh i s t o n eh 3i n m a m m a l s i nd m e l a n o g a s t e r , h 3f a i l st ob ep h o s p h o r y l a t e dd u r i n gm i t o s i sa f t e r a u r o r abw a sd e l e t e db yr n a n db o t hc h r o m o s o m ec o n d e n s a t i o na n ds e g r e g t i o n a r ed e f e c t i v e i nce l e g a n c e d i s r u p t i o no fa u r o r abb yi a il e a d st op o l y p l o i d y m a n yl i n e so fe v i d e n c e ss h o wt h a ta u r o r ab i sa s s o c i a t e dw i t ho t h e rt w op a s s e n g e r p r o t e i n s ，s u r v i v i na n di n c e n p ( i n n e rc e n t r o m e r ep r o t e i n ) d i s r u p t i o no fa n y o n eo f t h e s et h r e ep r o t e i n si n t e r f e r e sw i t ht h el o c a l i z a t i o n so ft h eo t h e rt w o ，i n d i c a t i n gt h a t t h e i ra c c u r a t et a r g e t i n g sa n df u n c t i o n sd u r i n gm i t o s i sr e q u i r ee a c ho t h e r i n t r i g u i n g l y ， e a c ho fa u r o r ab ，s u r v i v i na n di n c e n pi sd e t e c t e dt ob eo v e r - e x p r e s s e di nm a n y c a n c e re e l ll i n e s t h e s ef a c t sl c a dt ot h ei d e at h a tt h ec o o r d i n a t e di n c r e a s e si nt h e c o m p l e xa n dt h ee n h a n c e da u r o r aba c t i v i t yt h r o u g hi n c r e a s e de x p r e s s i o no f s u r v i v i n ，a r ei m p o r t a n tt ot r a n s f o r m a t i o no rt u m o rf o r m a t i o n a l t h o u g hal a r g ea m o u n to fr e s e a r c hh a sb e e nc a r r i e do u to nt h eh i g h l yc o n s e r v e d m e m b e r so fa u r o r ak i n a s e s f a m i l y s u c ha s i p l l p ( i n c r e a s e i n p l o i d y 1 ) ( s c h i z o s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) ，a i r s ( a u r o r a i p l l p r e l a t e d k i n a s e s ) ( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ) ，a u r o r aa n di a l ( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) ，p e g la n d p e g 2 ( x e n o p u sl a e v i s ) ，h u m a na u r o r aa a n db ，l e s si sk n o w na b o u tt h i sn l i r dh u m a n a u r o r ak i n a s e ，a u r o r ac a u r o r ac ，h i g h l ye x p r e s s e di nm a m m a l i a nt e s t i s ，w a sf i r s ti d e n t i f i e di nas c r e e nf o r k i n a s e se x p r e s s e di nm o n s es p e r ma n de g g s i t sg e n em a p st o1 9 q 1 3 4 3 ，ar e g i o n o f t e nt r a n s l o c a t e do rd e l e t e di nc e r t a i nc a n c e rt i s s u e s ，a n di t sp r o t e i np r o d u c ti sa l s o o v e r e x p r e s s e di nc e r t a i nc a n c e re e l ll i n e sa n di np r i m a r yc o l o r e c t a lc a n c e r s a u r o r a 3 董_ 量大学博士捂文人兵有兰分裂相关瞳峰a u r o r a c 曲功彘研竞 c p r o t e i nl e v e li sl o wd u r i n gsp h a s ea n dp e a k sa tm i t o s i s i ne a r l i e rs t u d ya u r o r ac a p p e a r sa tc e n t r o s o m e si na n a p h a s ea n dr e m a i n st h e r et i l lc y t o k i n e s i s h o w e v e r ， e x c e p tf o rt h er e s u l t sm e n t i o n e da b o v e ，t h er e a lb i o l o g i c a lf u n c t i o n so fa u r o r ac i n m i t o s i sr e m a i np r o b l e m s t h ed e t a i l so ft h es u b c e l l u l a rd i s t r i b u t i o no fa u r o r aca n d i t sd i s t i n c tf u n c t i o n si nn o r m a la n dc a n c e rc e l l sh a v eb e c o m et h ef a s c i n a t i n g q u e s t i o n st ob ec l a r i f i e d w h e na u r o r acw a sa m p l i f i e df r o mh u m a nt e s t i se d n al i b r a r y ，w ea c c i d e n t a l l y o b t a i n e da n o t h e rn e ws p l i c i n gv a r i a n te x c e p tf o rt h ea u r o r acc d n at h a th a db e e n r e p o r t e d t h i sd i s t i n c ts p l i c i n gv a r i a n te n c o d e sa nn - t e r m i n a ls h o r t e n e dp r o t e i n w e n a m e dt h i sn o v e ls p l i c i n gv a r i a n ta u r o r ac - s v ( s p l i c i n gv a r i a n t ) t h r o u g hr t - p c r i n18t i s s u e s ，w ef o u n dt h a ta u r o r ac s v ，l i k ea u r o r ac ，i se x p r e s s e dt h em o s ti n t e s t i s f u r t h e rm o r e ，u s i n gs e n s i t i v er t - p c rt oa m p l i f yt h ec - t e r m i n a l ，w ef o u n dt h a t a u r o r aci sn o to n l ye x p r e s s e dh i g h l yi nt e s t i s ，b u ta l s oa m o n go t h e r16h u m a n t i s s u e si na b r o a d s p e c t r u mw a y t h ee x p r e s s i o nl e v e lo fa u r o r ac d o e sn o tc h a n g e o b v i o u s l yi nl i v e rl u m o ra n dn o r m a ll i v e rt i s s u e s 1 1 1 ei nv b r ok i n a s ea s s a ys h o w e d t h a tb o t ha u r o r aca n da u r o r ac s vw e r ea b l et op h o s p h o r y l a t em b pa sa u r o r aa a n db t h e i rd 1 6 6 ya n dt 1 7 9 a m u t a n t , r e s p e c t i v e l y ，l o s tt h ek i n a s ea c t i v i t y i no r d e rt oc h a r a c t e r i z et h es u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o no fa u r o r ac ，w et r a n s i e n t l y t r a n s f e c t e dh e l ac e l l sw i t ht h i sk i n a s ef u s e dw i t he g f p a u r o r acw a sa l s os h o w n ， d u r i n gm i t o s i s ，t oh a v eac h r o m o s o m a ll o c a l i z a t i o nd u r i n gp r o p h a s ea n dm e t a p h a s e ， t om o v et ot h es p i n d l em i d z o n ew h e nt h es i s t e rc h r o m a t i d ss t a r tt os e p a r a t e ，t o s u b s e q u e n t l yr e l o c a t et ot h ec o r t e xo ft h ec o n t r a c t i l er i n gd u r i n gt e l o p h a s e ，a n dt o r e m a i ni nt h em i d b o d yd u r i n gc y t o k i n e s i s s ow et h o u g h ta u r o r aci san o v e l c h r o m o s o m a lp a s s e n g e rp r o t e i n n e x t ，w ea l s of o u n dt h a ta u r o r aci sc o l o c a l i z e d 、v i t ha u r o r aba n ds u r v i v i ni nm i t o t i cc e l l s m e a n w h i l e ，a u r o r acc a nf o r mi n t oa c o m p l e xw i t ha u r o r ab a n ds u r v i v i n a n db ed i r e c t l ya s s o c i a t e dw i ms u r v i v i nb u tn o t a u r o r ab l i k ea u r o r ab ，t h ek i n a s ea c t i v i t yo f a u r o r acc o n t r i b u t e st oi t sp r o p e rl o c a l i z a t i o n b o t ht h ec a t a l y t i c a l l yi n a c t i v ea u r o r aca n di t sw t ( w i l dt y p e la r ed e m o n s t r a t e dt o l e a dt ot h em u h i n u c l e a t i o ni nc e l l s ，w h i c hg a v eu sa ni n d i c a t i o nt h a ta u r o r aci s r e q u i r e df o rc y t o k i n e s i s a u r o r acw t i sa b l et or e s c u et h em u l t i n u c l e a t i o ni n d u c e d b yc a t a l y t i c a l l yi n a c t i v ea u r o r ab ，v i c ev e r s a a n da u r o r acw ti sa l s oa b l et o r e s c u et h em u l t i n u c l e a t i o ni n d u c e db ya u r o r ab - t a r g e t i n gr n a i t a k e nt o g e t h e r ， t h e s er e s u l t sl e a dt ot h eh y p o t h e s i st h a ta u r o r ac m i g h tp o s s e s st h es i m i l a rf u n c t i o n 4 旦大学博士论文 人真有兰分曼相关蕾肆a u r o r a c 的功蠡研究 t oa u r o r abt h a ti se s s e n f i a lt oc y t o k i n e s i s a tl a s t w ef o u n dt h a tt h ea m o u n ta n dt h e k i n a s ea c t i v i t yo f a u r o r aca l em u c hl o w e rt h a na u r o r ab i nc o n c l u s i o n ，w ep r o v e dt h ef u n c t i o no fa u r o r acm a yo v e r l a pw i t ha u r o r abi n m i t o s i sa n da u r o r aba n dcm a yc o m p l e m e n tt h ef u n c t i o no f e a c ho t h e r i tm a yb e s u g g e s t e dt h a ta u r o r acw i t hs i g n i f i c a n ts e q u e n c eo v e d a pw i t ha u r o r ab b u tw i t h r e l a t i v e l yl o we a p r e s s i o np r o f i l e ，m a yb ei n v o l v e di na d d i t i o n a lf u n c t i o n st oe n s u r e c o r r e c t i o no fk i n e t o c h o r e - m i c r o t u b u l ea t t a c h m e n te l r o t sa n db i p o l a ra p i n d l es t a b i l i t y i nm i t o s i si nm a m m a l i a ns o m a t i cc e l l s n e v e r t h e l e s s ，w h e t h e rt h e r ea r ef i m c t i o n a l d i f f e r e n c e sb e t w e e na u r o r aca n db ，a n dw h e t h e ra u r o r acp o s s e s s e st h ed i s t i n c t i v e c h a r a c t e r sc r u c i a lt om i t o s i sa n dm e i o s i sr e m a i nt ob ei n v e s t i g a t e di nf u t u r ew o r k k e yw o r d s ：a u r o r ac ，s p l i c i n gv a r i a n t ，k i n a s e ，c h r o m o s o m a lp a s s e n g e rp r o t e i n , s u r v i v i n ，m i t o s i s ，c y t o k i n e s i s 5 蔓旦太攀博士论文 人妻有置务基相关照尊a u r o r a c 曲耐能研究 第一章 a u r o r ac 和a u r o r ac s v 的基因克隆 及其生物学性质分析 前言 生命的繁衍依赖于细胞的有丝分裂和减数分裂。在这些细胞分裂的过程中， 染色体精确的复制，而后一分为二，各自进入到两个子细胞中。为了确保基因 组的稳定性，染色体必须准确无误地复制，纺锤体必须准确的将姐妹染色单体 拉向两极。所有这些复杂的事件都要受到精确的时空调控。 那么，调节细胞有丝分裂进程的一个非常重要的因素，就是蛋白质的可逆 性磷酸化。一系列蛋白激酶对底物的磷酸化和磷酸酶对底物的去磷酸化之间的 动态平衡来精密调控有丝分裂中的一些关键开关，启动或关闭一些重要事件1 1 i 。 当细胞周期进入有丝分裂时，许多蛋白质的磷酸化状态发生剧烈的变化，这些 都是由激酶引起的。这些激酶家族包括c d k 家族( c y c l i n d e p e n d e n t k i n a s e s ) 洲、 p 0 1 0 家族【4 ，副、n i m a 家族( n e v e ri nm i t o s i sa ) 1 6 1 、b u b l 家族【7 , s l 和a u r o r a 家 族等。由于这些激酶家族在有丝分裂检验点、纺锤体装配和染色体精确分离时 都起到及其重要的作用，因此不难想象这些激酶家族对肿瘤的形成和发展也起 到关键的作用。 a u r o r a 是一类在细胞分裂过程中调节多个事件的丝氨酸苏氨酸激酶家族。 它是在筛选引起果蝇两极纺锤体发生缺陷的突变体时被首先克隆的。由于最早 发现的果蝇a u r o r a 位于细胞的两极，就像地球两极的极光( a u r o r a ) 现象， “a u r o r a ”因此而得名。a u r o r a 激酶家族中发现较早的基因还有酿酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) 中的如l l ( i n c r e a s e i n - p l o i d y l ) ，它是在筛选引起染色体 分离缺陷的突变体时被鉴定出来的p i 。在以后的1 0 年中，人们在许多生物体中 均发现了a u r o r a 家族的同源蛋白质。比如秀丽新小杆线虫( c a e n o r h a b d i t i s e l e g a n s ) 的a i r l 和a i r 2 ( a u r o r a i p l lr e l a t e dk i n a s e l i l o j ：黑腹果蝇( d r o s o p h i l a r m e l a n o g a s t e r ) 的a u r o r a 和i a l ( i p l l a u r o r al i k ek i n a s e 】1 1 1 1 ；爪蟾( x e n o p u s 1 a e v i s ) 的p e g 2 i l 副；小家鼠( m u s m u s c u l u s ) 的a r k l 、a r k 2 ( a u r o r ar e l a t e d k i n a s e ) i d i 和a i e l ( a u r o r a i p l l e g 2 ) 0 4 1 ；褐家鼠( r a t t u s n o r v e g i c u s ) 的a i m l ( a u r o r a i p l l p m i d b o d y - r e l a t e dk i n a s e l i l5 j ；以及人类( h o m os a p i e n s ) 的a u r o r a 6 旦大学博士论文人夹有置分襄相关照葺a u r o r a c 的功能研究 a 、b 和c 。由于这些激酶在不同的实验室被先后分离出来，因此它们的命名 比较混乱。后来，人们建议根据这些激酶的定位和功能特征将这一家族系统的 划分为三个组群：a u r o r aa 、b 和c 。 人类a u r o r aa 、b 和c 的氨基酸长度略有不同，a u r o r aa 为4 0 3 个氨基 酸，a u r o r ab3 4 4 个氨基酸，a u r o r ac3 0 9 个氨基酸。在二级结构上它们都可分 为保守的c 端催化区和n 端可变区，c 端催化区的氨基酸序列长度相似，且具有 较高的同源度。它们的n 端则长短不一，没有任何明显的序列相似性。a u r o r a 家 族成员都有与其它激酶相似的1 1 个保守激酶结构域，最保守的基序在催化活 性区域内。 根据以往的n o r t h e r n b l o t i n g 分析，人类a u r o r a a 和b 主要分布在睾丸、胎肝、 胸腺、骨髓等组织中，a u r o r a b 在肺中也有较多的表达l i 引。而a u r o r a c 则在睾丸 中特异性表达 1 4 , 1 7 , 1 8 1 。 尽管a u r o r aa 和b 的催化结构域有非常相似的序列和空间结构，但是， a u r o r a a 和b 对有丝分裂却有着不同的时空调节。 在体细胞中，a u r o r aa 是中心体成熟、纺锤体装配和染色体分离的重要的 调控因子【1 9 i 。在中心体成熟的过程中，a u r o r aa 的突变体干扰y - t u b u l i n 环状复 合物和其他蛋白质复合物的形成，从而影响中心体的复制和染色体的正确分离。 在有丝分裂的过程中，a u r o r aa 的含量和活性都最高0 6 。a u r o r aa 的活性来自 其激酶活性区中的t h r2 8 8 的磷酸化。a u r o r aa 是一个重要的癌基因。人类的 a u r o r aa 基因定位在染色体2 0 q 1 3 上，这是一个高频率扩增的区域，并在乳腺 癌中过表达1 2 叭。在所检测的结肠癌中，5 0 以上的样本有a u r o r a a 基因扩增， r n r n a 过表达【l “。人类和爪蟾a u r o r aa 的过表达都会转化哺乳动物细胞，并 使裸鼠致瘤i “i 。 。一 a u r o r a b 负责染色体的凝聚以及胞质分裂”，其蛋白质含量和激酶活性也 在有丝分裂时达到最高，但晚于a u r o r aa 【j “。a u r o r ab 是一个染色体伴随蛋白 ( c h r o m o s o m a lp a s s e n g e rp r o t e i n ) ，在有丝分裂的过程中动态地迁移，负责一系 列事件的有序进行。r n a i ( r n ai n t e r f e r e n c e ) 干扰a u r o r ab 会导致染色体蛋白 质复合物中的组蛋白不能被磷酸化、染色体不能正常凝聚和正确排序、胞质分 裂受阻以至于产生多核体。a u r o r ab 的基因定位在染色体1 7 p 1 3 上2 2 l ，这个区 域在多种肿瘤组织中缺失i 1 ，但是所表达的a u r o r ab 激酶在多个结肠癌细胞系 中却异常增多1 。a u r o r ab 过量表达会使细胞产生多核体样的癌细胞表现。 a u r o r ac 是在筛选小鼠精子和卵子的激酶表达谱1 1 4 1 以及筛选人类胎盘和睾 丸的e d n a 文库时被鉴定出来的1 1 7 i 。a u r o r ac 的基因定位在染色体1 9 q 1 3 4 3 上， 在肿瘤的基因组中，这个区域经常发生缺失和重排【2 5 i 。a u r o r ac 在一些肿瘤细 7 置三太学博士岳文人真有兰分曼相薯菠尊a u r o r a c 曲耐健研竞 胞系和结肠癌样本中高表达1 2 6j 。在h e l a 细胞中，a u r o r a c 在g 2 m 期的表达量 最高，暗示着它在有丝分裂过程中发挥作用。 尽管人们对于a u r o r aa 和b 研究得越来越广泛和深入，对a u r o r aa 和b 在有丝分裂过程中的具体功能也了解得越来越清楚，但是，对a u r o r ac 却知之 甚少。除了睾丸以外，a u r o r a c 在其他组织中有表达吗? 除了结肠癌，a u r o r a c 在其他癌组织中上调表达吗? 它在细胞有丝分裂过程中究竟定位在哪里? 和哪 些蛋白质相互作用? 有哪些底物? 具体发挥什么功能? 所有这些问题都 深深吸引着我们，因此也成为了本篇论文实验研究的目的所在。 本研究论文首先克隆获得了人类a u r o r ac 的基因，同时还发现了在睾丸中 a u r o r ac 存在另外一个新型的剪接本，我们命名为a u r o r ac s v ( s p l i c i n g v a r i a n t ) 。通过r t - p c r 扩增a u r o r ac 的全长，发现a u r o r ac 和a u r o r ac s v 在 睾丸中高丰度表达。然而扩增a u r o r ac 的c 端，却发现a u r o r ac 在组织中广谱 存在，但仍在睾丸中表达量最高。用半定量r t p c r 的方法检测了2 1 例肝癌 和癌旁肝组织标本中a u r o r a b 和c 基因表达的丰度，证实a u r o r a b 在大约8 0 的肝癌中上调表达，而a u r o r ac 在肝癌和癌周肝组织的表达差异却不明显。 以a u r o r aa 的晶体结构为基础对a u r o r ab 和c 进行结构预测，发现a u r o r ab 和c 的三维空间结构非常相似。原核表达纯化的融合蛋白h i s a u r o r ac 和 h i s a u r o r ac s v 在体外均有激酶活性，且h i s a u r o r ac 的活性大于h i s a u r o r a c s v 。将h i s - a u r o r ac 催化底物的关键氨基酸以及可以保持h i s a u r o r ac s v 活 性的被磷酸化的氨基酸分别突变以后，它们则失去了磷酸化底物的活性。 董王大学博士岳文 人真有兰分董相关蕾肆a u r o r a c 的功能研竞 材料和方法 一、材料 1 e d n a 文库 1 1 克隆用人睾丸e d n a 文库( c l o n t e c h 公司) 1 2 人m t c ( m u l t i p l e - t i s s u ec d n a ) p a n e l s ( c l o n t e e h 公司) 2 肝癌组织样品 2 1 例肝癌( 病理诊断为肝细胞癌) 及相应的癌周肝组织样品，每例不 少于0 5 9 ，由江苏启东肝癌研究所提供。临床病理资料见表1 1 。外科手术 切除肿瘤后于半小时内将标本放入液氮中，数小时后取出，8 0 。c 冰箱保存。 3 质粒载体 质粒p m d l 8 t 载体( t a k a r a 公司) 质粒p e t 3 2 a ( + ) 载体( a m e r s h a mb i o s c i e n c e s 公司) 4 宿主菌 大肠杆菌d h 5 a ( 本室保存) 大肠杆菌b l 2 1 c o d o n p l u s ( d e 3 ) r i l ( 本室保存) 6 p c r 引物( 上海博亚生物工程公司合成) 6 1 克隆a u r o r ac 基因的引物 5 - g g a a g t a c c t c t c t g a g c g g t t g - 3 5 t c a g g a a g c c a t c t ga g c a c