基于分子生物学的长江口外海域中微生物鉴定.doc

基于分子生物学的长江口外海域中微生物鉴定摘要：作为国家卫星海洋中心组成部分，本论文主要是初步查明秋季长江口外海域海洋悬浮物中的微生物种类。2008年秋季，我们在长江口外海域采集的海洋悬浮物样品，利用对海洋微生物16SrRNA基因的直接扩增，克隆和测序，从而鉴定微生物的种类。通过开展本研究，我们希望能初步查明长江口外海域海洋悬浮物中的微生物种类，为建立海洋微生物分子生物学检测的技术体系打下一定的基础。关键词： 海洋微生物，种类鉴定，16SrRNA，海洋悬浮物 Identifications of Microorganism from the Outside waters of Changjiang River Estuary by Molecular Biology TechniquesAbstract: Being as a major part of Satellite Ocean Center of China , this study is trying to primarily investigate the microorganism species in the Suspended solids from the Outside waters of Changjiang River Estuary。 In fall in 2008, we collected Suspended solids samples from the biology investigation spot 24 of Satellite Ocean Center of China, then identified the marine microorganism species by using direct amplifications of 16S rRNA gene from marine microorganism, cloning and sequencing techniques. In this study, we hope to identify the marine organism species in sediment from the China East Sea near to Shanghai, which could provide basis for the establishments of marine microorganism molecular detection technique system.Key words: Marine microorganism, species identification, 16SrRNA, marine sediments基于分子生物学的长江口外海域中微生物鉴定DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。 电源电压 在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。 离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。 对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸,TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温.三、 琼脂糖凝胶的制备 1、 取5TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5TBE稀释缓冲液,待用。 2、 胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml 0.5TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。 3、 胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。 向冷却至50-60的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5g /ml(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5g/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。 4.微生物种类的鉴定方法4.1微生物的鉴定技术分类分类鉴定方法包括表型鉴定法和分子遗传学鉴定法两大类,分成4个水平：细菌形态和生理生化水平、细胞组分水平、蛋白质水平和核酸水平。4.1.1 表型鉴定法它是对前3个水平的鉴定,包括常规鉴定法、数值分类鉴定法和化学分类鉴定法。（1）细菌常规鉴定法：它是细菌形态和生理生化水平及蛋白质水平的鉴定,前者是最经典、最常用的分类鉴定指标,也是现代化分类鉴定的依据,后者包括免疫诊断技术、蛋白质图谱分析和氨基酸序列分析等。(2)细菌的数值分类和自动化鉴定：它应用大量已知菌对相关生化试验反应出现的频率得出数据进行分析,优化组合数10项生理生化指标集合成套试剂,根据相似系数大小判断细菌种属间的亲源性。自动化微生物鉴定系统即采用数值分类原理。微生物数值分类鉴定集数学、电子、信息及自动分析技术于一体,具有系统化、标准化、微量化和简易化等优点,采用商品化的鉴定测试卡,将未知菌鉴定到属、种、亚种或生物型,可对不同来源的临床标本进行针对性鉴定,所得结果以数字方式表达,与数据库数据(手册或软件)对比得出鉴定结果。(3)化学分类鉴定法：它主要通过细菌细胞壁化学成分即氨基酸和糖的分析进行分类鉴定,属的分类主要测定各种氨基酸组分,种的鉴定主要是对糖的分析.另外,还有全细胞水解液糖型分析、脂肪酸分析、磷酸类脂成分分析、枝菌酸分析、醌类分析和光合色素成分分析等,常使用红外光谱、气相色谱、高效液相色谱和质谱等新技术。4.1.2.分子遗传学分类鉴定法分子遗传学鉴定法是核酸水平的鉴定,对细菌染色体或质粒DNA进行分析,包括G+Cmol%含量测定、核酸杂交、PCR 技术、16SrRNA和1623SrRNA序列分析、全基因组测序等,此类方法使细菌种属定位和亲源关系判别由表型特征深化为基因型鉴定。随着分子生物学技术的发展，分子遗传学分类鉴定方法逐渐成为微生物鉴定的主要手段，其鉴定结果更具有说服力。下面我们主要对16SrRNA序列分析进行详细介绍。4.216SrRNA序列分析4.2.116SrRNA 的结构与性质16SrRNA为原核生物核糖体中一种核糖体RNA。目前,在细菌的系统分类学研究中最有用的和最常用的分子钟是rRNA,其种类少,含量大(约占细菌RNA含量的80%),分子大小适中,存在于所有的生物中,特别是其进化具有良好的时钟性质,在结构与功能上具有高度的保守性,素有“细菌化石”之称。核糖体是细菌唯一的细胞器,是蛋白质合成的场所,它的RNA含有3种类型:23S、16S和5SrRNA,它们分别含有的核苷酸约2900、1540和120个。60年代末,Woese开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分类,他通过比较各类生物细胞的核糖体RNA(rRNA)特征序列,认为16SrRNA及其类似的rRNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适。其主要依据是:它们为细胞所共有,其功能同源且最为古老既含有保守序列又含可变序列,分子大小适合操作:它的序列变化与进化距离相适应(陈文新1998)。5SrRNA虽易分析,但由于核苷酸少,没有足够的遗传信息用于分类研究。而23SrRNA含有的核苷酸数几乎是16SrRNA的两倍,分析较困难。16SrRNA的相对分子量适中,作为研究对象较理想。细胞核糖体RNA可将遗传信息得以表达,转译成蛋白质,因此可以想象这些分子具有作为种系发生的指示所必不可少的性质。在相当长的进化过程中,rRNA分子的功能几乎保持恒定,而且其分子排列顺序有些部位变化非常缓慢,以致保留了古老祖先的一些序列。也就是说,从这种排列顺序可以检测出种系发生上的深远关系。rRNA结构既具有保守性,又具有高变性。保守性能够反映生物物种的亲缘关系,为系统发育重建提供线索;高变性则能揭示出生物物种的特征核酸序列,是属种鉴定的分子基础。可变区序列因不同细菌而异,恒定区序列基本保守,所以可以利用恒定区序列设计引物将16SrRNA片段扩增出来,利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类。rRNA在细胞中含量大,一个典型的细菌中含有1000020000个核糖体,易于提取,可以获得足够的使用量供比较研究之用。选用的PCR扩增引物及测序引物对应的序列是16SrRNA中高度保守的序列,其中PCR引物827位的16(+)和15121492位的16(-)扩增分离物的16SrRNA全基因,选择位于827位的16(+)、683702N3R和15121492位的16(-)保守序列作为测序引物,可准确测定16SrDNA的一部分序列。根据核糖体16SrRNA结构变化规律,在所测定的区域中包括了V1、V2、V3和V44个高变区,尤其是V2这一高变区,由于进化速度相对较快,其中所包含的信息,足够用于物种属及属以上分类单位的比较分析。因此,测定16SrDNA部分序列即可达到对分离物的分子鉴定的目的。4.2.2.16SrRNA序列分析的基本原理和技术步骤通过比较各类生物16SrRNA的基因序列,从序列差异计算它们之间的进化距离,可以绘出生物进化树。因此,16SrRNA序列分析技术的基本原理就是从微生物样本中的16SrRNA的基因片段,通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得16SrRNA序列信息,再与16SrRNA数据库中的序列数据或其他数据进行比较,确定其在进化树中位置,从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。其技术主要包括以下3个步骤。（1）基因组DNA的获得首先从微生物样品中直接提取总DNA,对易于培养的微生物可通过培养富集后再进行提取。另一种选择是提取微生物细胞中的核糖体RNA。一个典型的细菌含有10000 20000个核糖体,而基因组DNA中rrn操纵子(即rDNA序列)的拷贝数相对较少(原核生物一般为110个左右),因此rRNA在细胞中的含量很高,易于获得较多的模板,但是RNA易于降解,RNA的提取技术相对于DNA的提取较为复杂,一般研究多采用提取细胞总DNA,但也可根据情况选择提取rRNA。由于rRNA在死亡的细胞中很快降解,提取rRNA通过反转录钓取16SrDNA序列的方法能够区分被检测的细胞是否为活体细胞(Ku rabachew,1998)。（2）16SrRNA基因片段的获得过去常常将提取的总DNA经酶切后克隆到K噬菌体中建立DNA库,进一步通过16SrRNA通用探针进行杂交,筛选含有16SrDNA序列的克隆(鸟枪法)。由于PCR技术的产生和发展,现在一般采用16SrRNA引物PCR扩增总DNA中的rRNA序列,或通过反转录PCR获得CrDNA序列后再进行分析。采用PCR技术的优点在于不仅一次性从混合DNA或RNA样品中扩增出16SrRNA序列,而且方便了后面的克隆和测序。但也同样会出现PCR所固有的缺点,尤其是采用16SrRNA保守序列的通用引物对多种微生物混合样品进行扩增,可能出现嵌合产物(Chimericproduct)和扩增偏嗜性现象,影响结果的分析。（3）通过16SrRNA基因片段分析对微生物进行分类鉴定16SrRNA基因片段的分析方法主要包括以下3种:一是将PCR产物克隆到质粒载体上进行测序,与16SrRNA数据库中的序列进行比较,确定其在进化树中的位置,从而鉴定样本中可能存在的微生物种类,该方法获得的信息最全面,但在样品成分复杂的情况下需要大量的测序工作。二是通过16SrRNA种属特异性的探针与PCR产物杂交以获得微生物组成信息。此外探针也可以直接与样品进行原位杂交检测,通过原位杂交不仅可以测定微生物的形态特征和丰度,而且能够分析它们的空间分布。该方法简单快速,主要应用于快速检测,但可能出现假阳性或假阴性结果。三是对PCR产物进行限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphisms,RFLP)分析,通过观察酶切电泳图谱、数值分析,确定微生物基因的核糖体型,再同核糖体库中的数据进行比较分析样品中微生物组成或不同微生物的种属关系。4.3微生物多样性与DNA指纹技术环境样品中的微生物DNA提取物通常是不同微生物的DNA混合物,经过PCR后,其产物是序列等长但不同源DNA片段的混合物。混合物中序列的多样性和不同序列的丰度在一定程度上反映了原始样品中微生物种群的多样性和不同物种的丰度。如果可以将这些序列等长但不同源DNA片段分离开,则可对样品中微生物群落的组成进行初步的分析。经过多年的研究,现在已经有多种DNA指纹技术,又称为多态性分析,可以用于上述DNA片段的分离,它们包括如变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Elec-trophoresis,DGGE),温度梯度凝胶电(Temperature Gradient Gel Electrophoresis,TGGE),单链构象多态性分析(Single Strain Conformation Polymorphism,SSCP),限制性片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP),末端限制性片段长度多态性分析(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism,T2RFLP)等。DGGE的原理是:在碱基序列上存在差异的不同DNA双链解链时需要不同的变性剂浓度,DNA双链一旦解链,其在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度将会急剧下降;因此,将PCR扩增得到的等长的DNA片段加入到含有变性剂梯度的凝胶中进行电泳,序列不同的DNA片段就会在各自相应的变性剂浓度下变性,发生空间构型的变化,导致电泳速度的急剧下降,以至停留在其相应的不同变性剂梯度位置,染色后可以在凝胶上呈现为分开的条带。每个条带代表一个特定序列的DNA片段。在不同泳道中停留在相同位置的条带,一般可视为具有相同的DNA序列。尽管DGGE凝胶上的条带可以在回收后用于测序,以便进行更详尽的微生物分类分析,但研究者一般仅利用DGGE等技术进行微生物群落的初步分析,而用建立细菌16SrDNA文库的方法进行更为深入的分析。4.4.DNA测序及微生物分类鉴定对微生物16SrDNA进行测序时最好进行全长测序,尤其是所测序列将要用于探针设计和新物种确定时。另外,采用正反向引物对所测序列进行重复验证可以确保序列的准确性。但由于目前测序费用还比较高昂,因此许多研究者也采用测16SrDNA部分序列的方法进行微生物多样性分析和平行样品比较。研究表明,400600碱基的序列足以对环境中微生物的多样性和种群分类进行初步的估计,但这样短的序列通常不能用于新物种鉴定和探针设计。有了微生物16SrDNA序列,不论是全长还是部分,都可以提交到GenBank采用BLAST程序与已知序列进行相似性分析。Gen Bank将按照与测得序列的相似性高低列出已知序列名单、相似性程度以及这些序列相对应的微生物种类,但更为精确的微生物分类还取决于系统发育分析(phylogeneticanalysis)。系统发育分析,就是根据能反映微生物亲缘关系的生物大分子(如16SrDNA、ATP酶基因)的序列同源性,计算不同物种之间的遗传距离,然后采用聚类分析等方法,将微生物进行分类,并将结果用系统发育树(phylogenetictree)表示。计算菌属、菌种之间的遗传距离可以采用不同方法,如Jukes-Cantor方法。在计算遗传距离之后,构建进化树时有许多种方法,其中以NeighborJoin法最为常用。在进行系统发育树分析时常用到的一些软件包括MEGA2.1和ARB。5.材料与方法5.1材料5.1.1样品的采集调查区域范围为长江口冲淡水与外海水团交汇的锋面区域，有沿岸向东外海海域共设置两条断面，断面1范围为3000N， 12230-12400E间设置10个调查站位；断面2范围为3100N， 12210-12400E间设置12个调查站位；另外在3020 N， 12400E；3040 N，12400E设置2个站点，共计设置调查站位24个。样品采集时间为2008年秋季。样品暂放于4冰箱中，带回实验室。带回实验室后立即准备后续的海洋悬浮物的微生物培养工作。具体采样地点如图1。29.53030.53131.5121121.5122122.5123123.5124124.51251 图1 样品采样的地点说明：我们这次的调查范围是在靠近长江口的杭州湾附近，是在1这个点位采集的样品带回来进行研究的。5.1.2其它设备和仪器5.1.2.1主要试剂:(1)配制100ml的TE溶液:10Mm Tris-HCl；1mM EDTA(pH=8)；1ml Tris母液;0.2mlEDTA母液定溶到100ml,高压灭菌4保存备用。(2)抽提液I 酚:氯仿:异戊醇=25:24:1(盛与棕色瓶)(3)抽提液II 氯仿:异戊醇=24:1(盛与棕色瓶)(4)70%乙醇(5)100%异丙醇（6）10%SDS溶液（7）蛋白酶K3（8）Nacl溶液（9）CTAB/ NaCl溶液（10）异丙醇5.1.2.2实验仪器海尔冰箱 BCD-196F青岛海尔股份有限公司 ；FEB-78型双向磁力加热搅拌器 江苏金坛市金城国胜实验仪器厂；DHG-9053A型 电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司；不锈钢手提式压力蒸汽灭菌器 YXQ-SG46-280S 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-2F型双人双面净化工作台 苏州净化设备有限公司；ZF-6型三用紫外线分析仪 上海嘉鹏科技有限公司；BIO-RAD电泳槽 PowerPac Basic 041BR 38252；SHZ-A水浴恒温振荡器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DK-8B型 电热恒温水槽 上海华连医疗器械有限公司；EPPENDORF PCR仪 5341 0605679；EPPENDORF 离心机3417R 5407 0022202；格兰仕微波炉 P70D17TL-D5 佛山市顺德区微炉有限公司；电子天平BS124S 40960483 北京赛多利斯仪器系统有限公司；5.2 提取DNA的步骤我们采集到的微生物没有进行培养，直接进行微生物鉴定实验。本次实验是采用传统的方法即酚、氯仿法。传统法是目前最常用最可靠的DNA提取方法,所需费用低,所提取的DNA可满足临床各种检测需要，但操作繁琐,耗时长,DNA损失量大,产率低,且有污染和毒性作用，传统法适用于初学者或经费有限的实验室。具体步骤如下：（1） 把溶液放进离心机中离心，然后移去上清液，得到沉淀物质。（2）加入567ulTE溶液重悬（3）加入10%SDS 30l和20mg/ml蛋白酶K3l,于37温育1h（4）加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,412000g/min离心5min。（5）将上清液转入另1个离心管中加等体积的酚/氯仿/异戊醇,混匀,412000g/min离心5min（6）提取上清置于另一管中,加入0.6体积异丙醇,轻柔混合,412000g/min离心5min（7）弃上清,加入70%乙醇洗涤1min,离心,弃上清（8）将沉淀的DNA溶于100l的无菌去离子水中,-20保存备用细菌离心（12000g/min,4min）,10%的SDS去破壁,蛋白酶K3溶解蛋白,CTAB/NaCl溶液去多糖,氯仿/异戊醇和酚/氯仿/异戊醇抽提,异丙醇沉淀DNA,最后以70 %乙醇溶解。5.3用电泳检测DNAA洗净玻璃板或塑料盘并干燥备用，调节电泳槽底脚螺丝使其水平,在塑料盘两侧放置挡板。B根据扩增片段大小所需浓度,准确称量琼脂糖于三角瓶中,加入50ml 1TbE电泳缓冲液。缓冲液不要超过三角瓶的50%。C在三角瓶上盖上锡箔纸,用微波炉或在沸水上加热至琼脂糖溶解,然后使溶液冷却至60,此时胶浓度为1%,再加入2.5ul溴化乙锭(EB)溶液(用蒸馏水配制),充分混匀(注意EB有毒,强诱变剂,有致癌作用,操作时务必戴上手套,小心操作)。D用加样枪吸取少量溶液封住档板边缘。在距离底板0.51.0mm处放置梳子。E将剩余的溶液倒入塑料盘中。凝胶厚度为3-5mm,用枪头将溶液中的气泡排掉。F凝胶完全凝固(约需30-40min)后,小心拔去梳子,将塑料盘及凝胶一起放入电泳槽中,加入恰好没过胶面1mm的1TBE,准备点样。G.DNA样品和6DNA Loading buffer(含有溴酚蓝和甘油等物质)以5：1比值混合后，用微量枪慢慢将混合物加至样品槽中，最边上的孔加Marber2-3ul对照。I.盖上电泳槽并通电，使DNA向阳极移动，采用电压为80100V。J.溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后切断电流，取出玻璃板，在紫外灯下观查凝胶。K.跑完电泳后在紫外光下观察结果：溴化乙锭是荧光染料，该物质含有一个特殊的碱基，会导致染料与DNA结合并呈现荧光，由于结合了染色剂的DNA和其它物质所发出的荧光属于不同的发光段，因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。5.3 PCR扩增检测（1）PCR引物:根据细菌特有的高度保守序列16srDNA，设计合成了一对引物：27F 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-31492r 5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3(2)PCR反应体系（50ul）：PCR反应的基本成分包括:模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液其中模板DNA（提出的细菌DNA）8ul；其他的基本成分如下表1所示：表1.部分反应体系反应成分储备液浓度终浓度工作液配制Reaction ComponentsStock Solution Concentration Final ConcentrationWorking Solution PreparationddH2O-29ulPCR Buffer10*PCR Buffer1*PCR Buffer5ulDNTPs25mmol/l2mmol/l4ul引物11.0umol/l0.3umol/l1.5ul引物21.0umol/l0.3umol/l1.5ulTaq酶2.5U/ul0.25U/ul0.5ul终体积-50ul说明：10Buffer是提取缓冲液；dNTP是四种脱氧核苷三磷酸；Taq酶是DNA聚合酶（3）PCR扩增条件:PCR扩增是通过变性(denaturation)、退火(an-nealing)和延伸(extension)三个步骤反复循环来实现的。因此,确定正确的PCR反应程序参数是PCR成功的保证。热循环参数设置为：预变性95oC5min；95oC变性1min；53oC退火1min；72oC延伸1.5min，进行了30个循环；72oC延伸10min；4oC保存。具体反应程序如表2.表2.反应程序Step1预变性：955minStep2变性：951minStep3退火：531minStep4延伸：721.5minStep52-4步骤，30个循环Step6延伸：7210minStep7保温：41-12hStep8结束PCR技术十分灵敏，少数几个模板分子就可以检查出来。它的括增效率非常高，通常可以括增106倍。其扩增产量可以按下列公式计算：y =(1+x)ny=产量 x=扩增效率 n=循环次数PCR反应在EPPENDORF PCR仪上进行。PCR产物经脱盐纯化后,用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，点样量为3l。5.4割胶纯化PCR产物A.从琼脂糖凝胶中切下DNA条带（尽量切除多余的部分）,然后把条带放入离心管中，称取重量。B.向胶块中加入4倍体积溶胶液PN，然后在50的水浴中放置10min。期间不断上下翻转离心管，使胶块完全溶解。溶解完全后放置在常温下2-3min。C.把上述溶液放入到吸附柱中，3，000rpm离心30s，重复一次，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。D.向吸附柱中加入700ul漂洗液PW，然后重复一次步骤3的操作。E.向吸附柱中加入500ul漂洗液PW，13，000rpm离心30s，倒掉废液。将离心吸附柱放回收集管中，13，000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50温箱数分钟，彻底晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步实验。（影响回收率和DNA质量）F.将吸附柱放入一干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加25mlddH20，室温放置2min。13，000rpm离心1min收集DNA溶液。G.可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复6。即把其室温放置2min。13，000rpm离心1min，收集DNA溶液。H.纯化后用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。5.5 PCR产物的电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,是大多数实验室常用的方法。尽管琼脂糖凝胶的分辨能力较低,但分离范围广。具体操作步骤如下:A洗净玻璃板或塑料盘并干燥备用。调节电泳槽底脚螺丝使其水平,在塑料盘两侧放置挡板。B根据扩增片段大小所需浓度,准确称量琼脂糖于三角瓶中,加入50ml1TAE电泳缓冲液。缓冲液不要超过三角瓶的50%。C在三角瓶上盖上锡箔纸,用微波炉或在沸水上加热至琼脂糖溶解,然后使溶液冷却至60,此时胶浓度为1%,再加入2.5ul溴化乙锭(EB)溶液(用蒸馏水配制),充分混匀D用加样枪吸取少量溶液封住档板边缘。在距离底板0.51.0mm处放置梳子。E将剩余的溶液倒入塑料盘中。凝胶厚度为3-5mm,用枪头将溶液中的气泡排掉。F凝胶完全凝固(约需30-40min)后,小心拔去梳子,将塑料盘及凝胶一起放入电泳槽中,加入恰好没过胶面1mm的1TAE,准备点样。G.DNA样品和6DNA Loading buffer(含有溴酚蓝和甘油等物质)以5：1比值混合后，用微量枪慢慢将混合物加至样品槽中，最边上的孔加Marber2-3ul对照。H盖上电泳槽并通电,电压为80100V,使DNA向阳极移动。I待溴酚蓝和二甲苯青在凝胶中迁移出适当的距离,切断电源,小心取出凝胶在紫外灯或紫外透射仪下检查凝胶并摄影。5.616SrDNA的测序和分析将以上PCR扩增纯化产物直接送至测序公司,用ABI3730全自动测序仪进行序列测定。然后把获得的序列与GenBank数据库中已存在的细菌16SrDNA序列进行相似性比较。6.结果与讨论6.1结果6.1.1.DNA的提取和PCR扩增将从样品中提取的总DNA进行1%的琼脂糖凝胶电泳,在20kb左右出现条带(如图2A),表明已获得较为完整的微生物的全部基因组的DNA。提取出的基因组DNA经过用16sRNA引物PCR后,均获得了特异扩增片段,扩增片断约1,400bp左右,此片断为16SrDNA基因的全序列扩增(如图2B)。图1显示了一个样品的总DNA和16SrDNA基因的扩增产物。 AB图2(A和B).细菌基因组DNA和16SrDNA的PCR产物6.1.2 16SrDNA序列测定与种类鉴定对纯化后PCR扩增产物直接进行测序，我们获得如下序列结果。对一种单菌落部分测序结果（713bp）GGGGACGTTATCGGATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGAATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTAGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGTCTTGAACTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCTAGAGATAGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTATTTACCAGCACGTAATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGAGGTTATGGCAGTTATTAGTGGGCTACACACGTGCGGTAAAGATCTGGTGTTGGGCTGC将该序列与GenBank数据库中已存在的细菌16SrRNA序列进行相似性比较，我们发现：该序列的覆盖度占整个的95%，与一种假单胞菌（Pseudomonas）菌株的16SrRNA的核苷酸序列（403bp）相似性达到97%。该菌的基因序列号为EU681009.1(Pseudomonas sp.W15Feb26 16S ribosomal RNA gene Pseudomonas sp.W15Feb26 16S ribosomal RNA gene,EU681009.1)根据上面的步骤我们把剩下的微生物鉴定出来的结果列成表格的形式如表3.表3.微生物鉴定结果汇总英文名称属别query coveragemax identCellvibrio sp.纤维弧菌属60%96%Pseudomonas sp.假单胞菌属92%91%Pseudomonas sp.假单胞菌属92%95%Rheinheimera sp.棍着色菌属61%92%Tepidiphilus sp.硫杆状菌属24%77%Pseudomonas sp.假单胞菌属91%98%Bacillus pumilus短小芽孢杆菌43%99%Pseudomonas sp.假单胞菌属45%85%Pseudomonas sp.假单胞菌属98%99%Pseudomonas sp.假单胞菌属98%94%Pseudomonas sp.假单胞菌属97%97%Pseudomonas sp.假单胞菌属98%96%Shewanella baltica波罗的海希瓦氏菌98%96%Shewanella sp.希瓦氏菌92%93%Serratia marcescens 粘质沙雷氏菌94%98%Shewanella sp.希瓦氏菌88%91%Pectobacterium果胶杆菌属98%93%Shewanella baltica 波罗的海希瓦氏菌98%98%Aeromonas sp.气单胞菌81%90%Serratia proteamaculans变形斑沙雷氏菌99%96%Serratia marcescens粘质沙雷氏菌菌株56%96%Shewanella sp.希瓦氏菌97%90%Aeromonas sp.气单胞菌75%87%Shewanella baltica波罗的海希瓦氏菌99%99%Aeromonas sp.气单胞菌97%89%Shewanella sp.希瓦氏菌99%99%Shewanella sp.希瓦氏菌86%94%Pseudomonas假单胞菌91%98%Shewanella sp.希瓦氏菌94%98%Aeromona daceae 气单胞菌科细菌96%98%Aeromonas sp. 气单胞菌98%98%Pseudomonas sp.假单胞菌82%96%Pseudomonas sp.假单胞菌93%99%Aeromonas salmonicida 杀鲑气单胞菌91%98%Aeromonadaceae bacterium气单胞菌科细菌22%90%Shewanella sp.希瓦氏菌98%98%Shewanella sp.希瓦氏菌86%81%Pseudomonas fluorescens荧光假单胞菌株91%95%Pseudomonas sp.假单胞菌96%96%Pseudomonas sp.假单胞菌属83%90%Pseudomonas fluorescens 荧光假单胞菌98%97%Rahnella aquatilis 水生拉恩氏菌95%99%Rahnella aquatilis水生拉恩氏菌97%97%属别的形态及生理生化特征的分析：从列表中测算出微生物的平均覆盖度是85%，平均最大相似度是94%，这些数据表明鉴定微生物结果是比较可靠的。6.2讨论6.2.1对实验结果的分析(1)本实验样品是3000-3100E,12210-12400E组成的长江口杭州湾附近海域内采集的。采集地点位于潮间带以外。由于采集的地点远离陆地,从而确保分离到的微生物是真正的海洋微生物，从而排除陆地微生物的污染。(2)从鉴定出的微生物的生理生化分析的结果来看，这些细菌大致有以下特性：运动性、异养或化能异养、寡营养性、嗜盐性，嗜低温性，抵抗力强。从呼吸作用方式来看，有好氧型、厌氧型和兼性厌氧型的细菌，它们对氧的要求并不高。绝大多数海洋细菌都具有运动能力，这和微生物所生成的环境有关系，只有运动才能获得足够的营养。异养细菌和浮游植物有很大的关系，所以初级生产是影响长江口邻近海域浮游异养细菌分布的重要因素。由于海水中营养物质比较稀薄，大多数细菌都是寡营养细菌。海水中有机碳的平均水平相当低，寡营养细菌能够利用低浓度的有机碳，因此，寡营养细菌是海洋浮游生物的主要成员，在生物地球化学循环中起重要作用。对寡营养细菌生态学的研究，能为有效控制海洋生物圈的物质循环和能量流动提供可靠依据。研究发现氯气、甲烷和一氧化碳这些气体在任何环境中都微量存在，极有可能被寡营养细菌用来作为能量储备，以对付其生存环境可能出现的营养物质缺乏。嗜盐性，嗜低温性都是由于海洋独特的环境所决定的。在这个独特的环境中，生物必须具有强的抵抗力，例如芽孢杆菌产生孢子来度过不良环境。6.2.2用16SrDNA微生物鉴定的方法的优点传统的微生物分类是依赖纯培养分离方法，通过表型特征和细胞形态学的观察，对其生理生化反应和细胞组成成分结构进行比较分析来实现分类鉴定的。许多研究结果表明，这种方法有很大的缺陷。（1）在自然环境中有许多的菌种用传统的方法无法培养出来，同时纯培养分离忽略了气候变化和生物相互作用的影响，丢失了大量的微生物资源。（2）在培养基上不可避免的会造成菌株的富集或衰减，人为改变了原始菌群的微生态构成，对研究结果造成了较大的偏差。（3）根据形态特征、理化特征、菌体某些化学成分对菌株进行分类鉴定菌株的确很有用，至今这些特性的应用十分有限。根据这些缺点，在加上于海洋独特的环境, 包括高盐、高压、低营养、低温等, 造就了海洋微生物有别于陆地微生物的诸多特异性而导致对它们种类区分的困难, 有碍于海洋微生物研究和开发的深入, 因此迫切需要建立一种简单、方便、易于操作的分类鉴定方法对海洋微生物进行分析, 使人们在一定程度上更科学、更精确、更快速地找到海洋微生物的分类地位, 为海洋微生物资源的开发利用奠定基础。随着科学的发展，以16SrDNA为基础的现代分子生物学技术体高了解析的灵敏度，在基因水平上扩大了物种多样性的视野，可以实现快速，微量，准确简便的对微生物进行分类鉴定。操作简便还可有效地避免实验数据丢失;通过从基因水平探索微生物群落的丰度、均匀度、分析菌种的变异情况等,可将微生物多样性的研究提高到遗传多样性水平上,为全面认识微生物多样性在生态系统中的原始构成、筛选出未知菌种提供了行之有效的技术手段。虽然可以用DNAG+CmoL含量测定和DNADNA杂交、随机扩增DNA多态性图谱(RAPD)分析和限制性片段长度多态性分析(RFLP分析)、DNA探针分析等其他的分子生物学技术来进行鉴定微生物，但16SrRNA测序技术表现的更高效，更准确、更简便，有很强的特异性。随着基因组学的迅猛发展, 细菌16SrRNA间隔区序列数据库不断扩大,运用16SrRNA序列分析技术对微生物进行分类鉴定,确定微生物在进化中的位置,已成为微生物分类学中最重要的方法。6.2.3存在的问题（1）在实验过程中，我们很难提取到DNA，用了很多方法才得以成功。失败的原因有很多，比如我们采集到的物品没有及时操作，而且我们生活的环境和海洋微生物生活的环境不相同，可能导致海洋微生物不适合环境而死亡，因为死亡的微生物中的RNA很容易降解，这就使得微生物在采集到实验这一段很长的时间内我们很少采集到总的DNA；还有就是没有很好的控制细菌污染问题。环境中的细菌无处不在，很有可能是样品中进入了杂菌，使得海洋中的微生物不能正常生长，所以在试验中如何控制细菌污染是一个关键问题。通过各个环节的严格无菌操作,选择恰当的扩增循环次数,DNA提取、扩增和产物分析的隔离措施,以及使用一次性吸头等,可提高鉴定的正确性和可靠性。（2）以16SrDNA/RNA为基础的分子生物学技术正日益成为微生物种群分析的重要手段,但在应用这些技术时必须清楚地认识到它们存在的局限性和偏差,例如核酸提取的效率和PCR中的问题等。下面以PCR中出现的问题来说明。模板DNA是PCR体系中最重要的基本成分，它可能受到蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、能结合DNA的蛋白质及多糖类物质的污染，所以要选用纯化的DNA做模板，增加增加模板分子的