（农产品加工及贮藏工程专业论文）柑橘生理落果有效成分复合提取工艺研究.pdf

柑橘生理落果自效成分复合提取t 艺研究 摘要 柠檬苦素、辛弗林和橙皮苷是柑橘落果中主要的天然活性成分，在食品工业和 药业中有很高的应用价值。本论文围绕柑橘生理落果中三种有效成分的复合提取工 艺这一中心课题，以我国湖北省松滋市的不同柑橘品种两次生理落果为研究对象， 针对不同品种、不同落果期、不同干燥方式下的柑橘落果中的有效成分进行了测定， 通过乙醇回流提取制备活性成分提取液，旋蒸至糖浆状浓缩液，然后利用三种活性 成分的溶解性不同，依次进行分离，对提取工艺进行了探讨与研究。通过上述研究， 得出如下结论： 1 、单一提取柑橘生理落果中的活性成分，利用显色反应和h p l c 相结合的方法 初步证明柑橘生理落果中含有柠檬苦素、辛弗林和橙皮苷三种活性成分。 2 、总的提取工艺采用5 0 乙醇回流提取法，以料液比为1 ：5 0 ( w v ) ，温度 7 0 ，提取3 次，每次提取2 h 为柑橘生理落果三种活性成分最佳提取工艺。提取率 为：柠檬苦素2 1 9 9 m g 、辛弗林4 8 5 9 m g 、橙皮苷2 4 4 7 9 m g ，纯度分别为2 9 9 4 、 5 6 4 9 、9 1 4 1 。 3 、比较不同前处理方式对柑橘落果有效成分的影响，落果中橙皮苷含量在8 0 鼓风干燥下大于其他处理( 8 0 鼓风干燥、4 0 鼓风干燥、自然干燥) ，柠檬苦素含 量和辛弗林含量则在6 0 鼓风干燥处理下有较高值。 4 、同一品种中两次生理落果和不同品种之间所含活性成分的含量存在差别。同 一品种的生理落果中，第二次生理落果中柠檬苦素，橙皮苷的含量均大于第一次落 果，辛弗林的含量有所下降。对不同直径柑橘落果中主要活性成分的含量比较分析， 直径s 1 5c n l 的生理落果提取辛弗林为佳，第二次生理落果( 直径 1 5 c m ) 提取橙 皮苷较好，第二次生理落果( 直径 2 5 c r n ) 则有利于提取柠檬苦素。 5 、不同品种间，橙类( 朋娜、纽荷尔、酸橙) 和柚类品种( 瑁溪蜜柚、胡柚) 中柠檬苦素含量相对温州蜜柑类品种较高，其中以朋娜最高( 3 5 2 士0 0 8 4 “咖g ) ； 对于辛弗林的含量，温州蜜柑类品种( 尾张、国庆1 号) 的含量相对橙类( 朋娜、 纽荷尔、酸橙) 和柚类品种( 瑁溪蜜柚、胡柚) 较高，以尾张最高( 2 0 5 0 - 士0 8 9p 咖g ) ； 橙皮苷的含量均以瑁溪蜜柚最高，胡柚、宽皮柑橘类的两个品种( 国庆1 号和尾张) 与甜橙的两个品种( 朋娜和纽荷尔) 之间含量变化不显著。 关键词：柑橘生理落果；高效液相；柠檬苦素；辛弗林；橙皮苷；复合提取工艺 华中农业人学2 0 0 9 届硕士学位论文 a b s 仃a c t l i m o n i n ，s y n e p h r i n ea n dh e s p e r i d i n a r et h em a i nn a t u r a la c t i v ec o n s t i t u e n t sm p h y s i o l o g i c a lf r u i t d r o po fc i t r u s ，w h i c hh a v eh i g ha p p l i c a t i o nv a l u ei nf o o da n d m e d i c i n e i n d u s t r i e s e n c o m p a s s i n gt h ec e n t r a lt a s ko fc o m p r e h e n s i v ee x t r a c t i o nt e c h n o l o g y o f t h r e ea c t i v ep r i n c i p l e sf r o md i f f e r e n tp h y s i o l o g i c a lf r u i td r o po fc i t r u s ，c h o o s i n gt h e d i f f e r e n tp h y s i o l o g i c a lf r u i td r o p so fc i t r u sd u r i n gt h et w of r u i td r o pp e r i o d sw h i c h o b t a i n e df r o mc i t r u sv a l l e yc o r p o r a t i o ni ns o n g z io fh u b e i ，c h i n a a c c o r d i n gt ot h e d i f f e r e n tv a r i e t i e s ，d i f f e r e n tf r u i td r o pp e r i o d sa n dd i f f e r e n td r y i n gm e t h o d s ，t h ea c t i v e p r i n c i p l e sf r o mp h y s i o l o g i c a lf r u i td r o po fc i t r u sw e r ed e t e r m i n e d a c t i v ep r i n c i p l e s e x t r a c tw a sp r e p a r e db ye t h y la l c o h o lr e f l u x ，a n dt h e nt h e yw e r ec o n c e n t r a t e db yt h e r o t a r ye v a p o r a t i o n f i n a l l y , t h r e ea c t i v ep r i n c i p l e sw e r ei s o l a t e di nt u mb a s e do nd i f f e r e n t s o l u b i l i t y t h i sa r t i c l em a i n l yd i s c u s s e sa n ds t u d i e st h ee x t r a c t i o nt e c h n o l o g y t h r o u g h t h es t u d i e sa b o v e ，c o n c l u s i o n sw e r em a d ea sf o l l o w s ： 1 t h em a i nn a t u r a la c t i v ec o n s t i t u e n t sw e r ee x t r a t e db yu s i n gas i n g l ee x t r a c t i o n s y s t e m a n a l y s i sb yc o m b i n a t i o no fc o l o rr e a c t i o na n dh p l cs h o w e dt h a tt h e r ew e r e l i m o n i n ，s y n e p h r i n ea n dh e s p e r i d i ni np h y s i o l o g i c a lf r u i t d r o po fc i t r u s 2 t h et o t a lt e c h n i q u e so fe x t r a c t i n ga c t i v ep r i n c i p l e sw a se t h y la l c o h o lr e f l u x ，a n d t h eb e s tc o n d i t i o nw e r e ：5 0 e t h y la l c o h o l ，r a t i oo fs o l i dt ol i q u i d1 ：5 0 ，t e m p e r a t u r e7 0 c ， t i m e s3a n dt i m e2 h t h ee x t r a c t i o nr a t eo fl i m o n i nw a s2 19 i t g m g ，t h a to fs y n e p h r i n e w a s4 8 5 _ t g m ga n dh e s p e r i d i nw a s2 4 4 7 1 x g m g p u r i t yw e r e2 9 9 4 ，5 6 4 9 a n d 9 1 4 1 ，r e s p e c t i v e l y 3 、i tf o u n dt h a tt h ec o n c e n t so fh e s p e r i d i nu n d e r8 0 h o ta i rd r y i n gw e r eh i g h e rt h a n o t h e rt r e a t m e n t ( n a t u r a ld r y i n g ，4 0 ch o ta i rd r y i n g ，6 0 ch o ta i rd r y i n g ) b yc o m p a r i n g t h ee f f e c t so ne x t r a c t i n ga c t i v ep r i n c i p l e sb yd i f f e r e n tf o r e t r e a t m e n t t h ec o n c e n t so f l i m o n i na n ds y n e p h r i n eu n d e r6 0 ch o ta i rd r y i n gh a dh i g h e rv a l u e s 4 t h ec o n c e n t so fa c t i v ep r i n c i p l e sw e r ed i f f e r e n tb e t w e e nt h es a m ev a r i e t yi nt h e t w of r u i td r o pp e r i o d sa n dd i f f e r e n tv a r i e t i e s f o rt h es a m ev a r i e t y , t h ec o n c e n t so f l i m o n i na n dh e s p e f i d i ni nt h es e c o n df r u i td r o pp e r i o dw e r eh i g h e rt h a nt h a to ft h ef i r s t o n e ，w h i l et h ec o n c e n t so fs y n e p h r i n ew e r ed i f f e r e n t l yd e c r e a s e d i tw a sf o u n dt h a tt h e f r u i td r o p sw h o s ed i a m e t e r sw e r el e s so re q u a lt h a n1 5c l t lw e r eg o o df o re x t r a c t i n g s y n e p h r i n e t h ed r o p si nt h es e c o n df r u i td r o pp e r i o dw h i c h d i a m e t e r s 1 s c mw e r eg o o d f o re x t r a c t i n gh e s p e r i d i na n dw h i c hd i a m e t e r s 2 5c n lw e r eg o o df o re x t r a c t i n gl i m o n i n i i 柑橘生理落果有效成分复合提取工艺研究 b yc o m p a r i n ga n a l y s i st h ec o n c e n t so fa c t i v ep r i n c i p l e si n d i f f e r e n td i a m e t e ro ff r u i t d r o p s 5 f o rd i f f e r e n tv a r i e t i e s ，t h ec o n c e n t so fl i m o n i ni no r a n g e ( b o n a n z an a v e lo r a n g e ， n e w h a l ln a v e lo r a n g e ，s o u ro r a n g e ) a n dp u m m e l o ( g u a n x ih o n e yp o m e l o ，h u y o u p u m m e i o ) w e r eh i g h e rt h a nt h o s ei ns a t s u m ao r a n g e ，w h i c ht h ec o n c e n t so fl i m o n i ni n b o n a n z an a v e lo r a n g ew e r eh i g h e s t ( 3 5 2 士0 0 8 4l x g m g ) t h ec o n c e n t so fs y n e p h r i n ei n s a t s u m ao r a n g e ( g u o q i n gn o 1 ，o w a r i ) w e r eh i g h e rt h a nt h o s ei no r a n g e ( b o n a n z an a v e l o r a n g e ，n e w h a l ln a v e lo r a n g e ，s o u ro r a n g e ) a n dp u m m e l o ( g u a n x ih o n e yp o m e l o ，h u y o u p u m m e i o ) ，w h i c ht h ec o n c e n t so fs y n e p h r i n ei no w a r iw e r eh i g h e s t ( 2 0 5 0 士o 8 9i _ t g m g ) t h eh i g h e s tc o n c e n t so fh e s p e r i d i nw e r ei ng u a n x ih o n e yp o m e l o 。t h ec o n c e n t so f h e s p e r i d i ni nh u y o up u m m e i o ，s a t s u m ao r a n g e ( g u o q i n gn o 1 ，o w a r i ) a n ds w e e to r a n g e ( b o n a n z an a v e lo r a n g e ，n e w h a l ln a v e lo r a n g e ) c h a n g e dl i t t l e k e yw o r d s ：p h y s i o l o g i c a lf r u i td r o po fc i t r u s ；h p l c ；l i m o n i n ；s y n e p h r i n e ；h e s p e r i d i n ； c o m p r e h e n s i v ee x t r a c t i o nt e c h n o l o g y i i i 华中农业大学2 0 0 9 届硕上学位论文 英文缩写对照表 i v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否 如需保密，解密时间年 月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生张瓣象帆卅年月g 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书。 学位论文储始拶隆 导师张拟似 柳期：如7 年么月易日 槲期：呵年6 月儿 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 柑橘生理落果有效成分复合提取工艺研究 1 柑橘生理落果情况 第一章文献综述 柑橘属芸香科( r u t a c e u e ) 柑橘属( c i t r u s ) 植物，为世界的第一大水果，2 0 0 5 年世界柑橘产量达到l 亿多吨，中国约为1 5 0 0 万吨，仅次于巴西和美国( 叶兴乾， 2 0 0 5 ；李建敏等，2 0 0 7 a ) 。柑橘是一种常绿灌木或小乔木，春末、夏、秋开白色花， 果扁圆，红或橙黄色，味甜酸，盛产我国，有4 0 0 0 年栽培历史。我国柑橘种质资源 丰富，是世界许多柑橘种类的原产地，世界各国的许多柑橘品种最初都引自我国。 目前，中国柑橘品种仍然以宽皮柑橘为主，约占5 5 ，甜橙占3 0 ，柚子占1 0 ， 其它占5 ( 田世英，2 0 0 4 ) 。柑橘属容易成花，但座果率较低，一般为3 5 ， 丰产树可达1 0 左右，低产树通常不到1 ( 钟云等，2 0 0 6 ) 。 各种类、品种间，落果、落花、落蕾比例不同，宽皮橘类是以落果为主，占落 花落果总数的8 3 - - 一9 7 ，而橙类是以落蕾落花为主，占落花落果总数的6 9 - - - - 7 7 。 柑橘落花落果严重，座果率低，是一普遍现象。幼果由于生理原因凋落为生理落果。 生理落果有两个明显的高峰期，柑橘落果从调查的数据看，第一次在5 月上中旬( 花 谢后1 2 周) ，幼果从果梗( 花梗与枝的结合部) 处脱落，落果的数量多，约占总落 果量的7 3 - - 一9 9 ，时间短而集中；第二次落果高峰期出现在6 月上旬，幼果枯黄后 从蜜盘( 子房基部和果蒂之间) 处脱落，至6 月下旬以后才基本停止脱落，落果较大， 约占总落果量的o 0 2 2 7 ( 李玲等，1 9 9 8 ；胡国元，2 0 0 3 ) 。 柑桔包括了柑、桔、橙、柚、柠檬等品种，其营养全面，含有黄酮类、柠檬苦 素类、生物碱类、香豆素类及维生素等多种活性成分( 赵雪梅等，2 0 0 7 ) 。生理落果 是柑橘果实发育过程中的一种正常现象。柑橘类植物品种多、栽培广，每年产生大 量落果，但仅有少部分被加以利用。中药枳实即是多种柑橘类植物的落果，原植物 包括酸橙及其栽培变种、甜橙、枸橘、香圆、红河橙、宜昌橙、蟹橙、柚等，温州 蜜柑、桠柑等栽培面积最大的宽皮柑橘并未归入枳实中被加以利用。枳实的主要药 用成分有类黄酮物质( 如柚皮苷、橙皮苷) 和生物碱( 如辛弗林) ，在抗氧化、抑菌、 升压等方面有着重要的生理作用而被广泛应用于制药行业( 周鸣谦等，2 0 0 8 ：蔡逸 平等，1 9 9 9 a ) 。在发展柑橘生产中，从栽培到收获都会有大量的落花、落果及残、 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 次果实。柑橘的落花落果的资源很容易被人忽视。在保花保果的同时，生理落果及 疏果依然占很大比重，如果充分利用柑橘的落果以及疏果，从中连续提取辛弗林、 橙皮甙、柠檬苦素类似物等，就能充分保证柑橘落果和疏果中有效成分的提取和利 用，将对有效保护环境，提高柑橘综合利用价值有重大意义。同时，将落果提取后 的残渣进行营养成分分析，用微生物发酵制备饲料或肥料，可以最大化提高落果的 综合利用率。柑橘落果资源的充分利用，不仅可以促进柑橘栽培业的发展，也可为 制药等行业提供丰富的原料( 周鸣谦等，2 0 0 8 ) 。 2 柑橘生理落果中活性成分的研究 2 1 柠檬苦素的研究进展 2 1 1 柠檬苦素的物化性质及功能特性 1 8 4 1 年b e m a y 首次发现柠檬苦素是柑橘中的主要苦味成分( 刘亮等，2 0 0 7 a ) 。 柠檬苦素( 1 i m o n i n ) 是一个含呋喃环的高度氧化的四环三萜类化合物，具体结构如 图1 1 所示( 孙崇德，2 0 0 6 ) 。柠檬苦素类似物( 1 i m o n o i d ) 是以柠檬苦素的化学结 构为基本单位，包括有苦味的糖苷配基和无苦味的柠檬苦素1 7 一b d 糖苷配体 ( 1 i m o n o i d s1 7 p d g l u c o p y r a n o s i d e s ) 在内的一系列化合物均称为柠檬苦素类似物。 柠檬苦素及其类似物自2 0 世纪8 0 年代被认为是具有高度生物活性的天然物质。它 主要存在于芸香科和楝科植物中( 张哲等，2 0 0 5 ) 。 o 图1 - 1 柠檬苦素的化学结构式 f i g 1 - 1c h e m i c a lc o n s t r u c t i o no fl i m o n i n 2 柑橘生理落果有效成分复合提取工艺研究 柑橘属芸香科植物，是天然柠檬苦素化合物的主要来源( 蔡护华等，1 9 9 6 ) 。至 今已从柑橘属植物中分离出3 8 种柠檬苦素类似物甙元及2 0 种柠檬苦素类似物糖甙 ( s a i p e t c h ，2 0 0 4 ) 。在幼果中，类柠檬苦素多以苷元等形式存在，随着果实不断发 育，苷元逐步转化为配糖体，作为一种贮存形式存在于成熟果实中( m a n n e r se ta 1 ， 2 0 0 0 ；刘君，2 0 0 8 ) 。柠檬苦素及其类似物在柑桔果实中，特别是在果皮、种子中含 量丰富( 葡萄柚种子中柠檬苦素占种子鲜重的1 5 ) ( 孙崇德等，2 0 0 2 ) 。柠檬苦素 类似物具有强烈苦味是柑橘汁苦味的重要原因之一( 蔡护华和桥永文男，1 9 9 6 ) 。 柠檬苦素类似物甙元的结构为d 环的c 1 7 位上连有一个呋喃环，c 3 ，c 4 ， c 7 ，c 1 6 和c 1 7 上连有含氧的官能团，除脱氧柠檬苦素外，1 4 和1 5 位上均有环 氧结构。迄今为止发现的柠檬苦素类似物甙的结构均是甙元在c 1 7 位和一分子葡萄 糖以糖苷键的形式结合。甙元与糖甙结构的差别决定性质的差别，甙元的水溶性差 且具有明显苦味，而糖甙具有良好的水溶性且几乎没有苦味( 刘亮等，2 0 0 7 a ) 。柠 檬苦素类似物甙元主要存在于未成熟的种子和果实中，而其配糖体则主要分布于成 熟的种子和果实中( 贾冬英等，2 0 0 1 ) 。对于多数柑桔品种来说，柠檬苦素是最主 要的类柠檬苦素苷元( 唐传核，2 0 0 4 ；刘君，2 0 0 8 ) 。未成熟果实中柠檬苦素和诺米 林2 种苷元含量高于成熟果实中的含量( 蜜柑尾张除外) ，这可能是由于在成熟过程 中，苷元在u d p d 葡萄糖转移酶的作用下转化为相应的糖苷所致( m o r i g u c h ie ta 1 ， 2 0 0 3 ；刘亮等，2 0 0 7 a ) 。柑桔果实成长的早期，类柠檬苦素含量很高，而成熟的果 实中含量很低( o l s o n ，1 9 7 9 ；邹连生；2 0 0 1 ) 。因此，可以利用生理落果和疏果进 行提取类柠檬苦素。 柠檬苦素类物质在柑桔果实中，特别是在果皮、种子中含有丰富，由于这类物 质具有抗癌与保健的功效，以及高效的除虫作用，越来越受到人们的重视( h a s h i n a g a e ta 1 ，1 9 7 7 ；h a s h i n a g aa n di t o o ，1 9 8 3 ；温靖等，2 0 0 7 ) 。目前，已经证明柠檬苦素 类化合物具有广泛的生物学活性，如作为昆虫的杀虫剂、昆虫拒食剂、昆虫生长调 节剂等；另外，柠檬苦素类化合物还有抗癌、镇痛、抗炎、抑菌等其他药理活性( 赵 雪梅等，2 0 0 7 ) 。 ( 1 ) 抗癌作用 l a m 等( 1 9 9 4 ) 在小鼠实验中，发现5 种柠檬苦素类似物( 柠檬苦素l i m o n i n 、 诺米林n o m i l i n 、奥巴叩酮o b a c u n o n e 、异奥巴叩酸i s o o b a c u n o i c a c i d 、宜昌银i c h a n g i n ) 具有明显的激发肝和小肠粘膜上谷胱苷酞转移酶( g s t ) 活性。g s t 是体内主要的 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 解毒酶系，它可催化谷胱苷酞与体内强亲电子性的致癌物质结合，降低毒性，增强 水溶性，使之成为水溶性物质易于从体内排出( 张哲等，2 0 0 5 ) 。唐莉莉等( 2 0 0 1 ) 研究了柠檬苦素类化合物对人乳腺癌细胞( m c f 7 ) 的生长抑制及细胞周期动力学 的影响。结果显示柠檬苦素类似物能明显抑制m c f 7 的生长，抑制率高于7 0 ，并 随作用时间和剂量增加其效果增强。 ( 2 ) 镇痛抗炎作用 温靖等( 2 0 0 7 ) 对小鼠福尔马林实验及扭体实验，小鼠耳廓肿胀模型和角叉菜胶 致大鼠足肿胀模型观察发现柑桔果实中提取的柠檬苦素具有显著的抗炎及镇痛作 用。h a g a 报道，从柑桔属植物中提取的柠檬苦素类物质具有兴奋中枢神经的作用。 将其作为饲料添加剂( 2 0 0 m g & g ) 喂饲小鼠，发现小鼠的睡眠时间比对照组减少了 5 0 ( 赵雪梅等，2 0 0 7 ) 。 ( 3 ) 抗氧化作用 y u 等人( 2 0 0 5 ) 对柑桔中的1 1 种活性物质进行抗氧化活性实验时发现，在d p p h 体系中，柠檬苦素和柠檬苦素甙对自由基的清除率分别为o 5 和0 2 5 。另外，柠 檬苦素、柠檬苦素糖甙和香豆素对过氧化物自由基的清除率为2 5 一1 0 ，同时柠檬 苦素还能够防止低密度脂蛋白的氧化。s u n 等人( 2 0 0 5 ) 的研究表明，柠檬苦素和 诺米林的抗氧化活性随柑橘组织和品种的不同而异，柠檬苦素和诺米林的活性约是 v c 的2 9 8 3 倍。 ( 4 ) 抑菌作用 罗水忠等( 2 0 0 6 ) 用不同浓度的柠檬苦素对被试微生物的抑菌试验表明，1 o e c l 的柠檬苦素对枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌有较强的抑制作用；0 5 e , l 的柠檬苦素 对枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌有较弱的抑制作用；柠檬苦素对其它被试微生物没 有抑制作用。所以，柠檬苦素及类似物在功能食品、保健品以及植物天然活性物质 的开发方面具有广阔的前景。 2 1 2 提取柠檬苦紊的的工艺研究 柠檬苦素类似物的提取原理是依据提取成分的极性和溶剂极性相似原则。文献 报道的提取方法有；丙酮提取结晶分离法、热水提取树脂吸附法( 提取配糖体) 、 丙酮提取一甲醇分离树脂吸附法、超临界c 0 2 提取法；超声循环提取法；分离和纯 4 柑橘生理落果有效成分复合提取工艺研究 化方法有结晶法、萃取法、柱层析法、制备型高效液相法等( 孙崇德等，2 0 0 2 ；王 青山和邓放明，2 0 0 7 ) 。 有机溶剂提取法是目前国内外使用最广泛的方法，比较容易实现工业化生产， 常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮等。孙崇德等( 2 0 0 4 ) 从提取液、提取方法、 提取时间、温度等方面进行了研究，优化了提取方法，提取柠檬苦素和诺米林的回 收率分别为9 0 4 和9 1 1 ，并采用薄层层析与高效液相色谱结合的方法有效的定 量柠檬苦素和诺米林，得到检测限均为o 0 3 9 9 g ，r s d 分别为6 4 8 和2 9 0 。罗 水忠等( 2 0 0 6 ) 对柑桔籽中柠檬苦素的脱脂、索氏提取以及结晶等工艺进行了优化： 在温度3 2 ，p h 值为6 5 条件下，采用石油醚( 6 0 - - 一9 0 。c ) 脱脂8h 效果最好；最 佳索氏提取工艺为：丙酮在8 0 条件下，索氏提取8h ；而二氯甲烷：异丙醇以1 ： 4 为最优结晶溶剂。柠檬苦素的提取工艺流程为：橘籽一干燥一粉碎一脱脂一浸提 一索氏提取一脱脂一结晶一产品。 近年来，国外有学者开始利用极易溶于水的有机盐和水溶助剂增加有机成分的 水溶性，优化提取效率( h a s e g a w ae ta 1 ，1 9 8 0 ；m i y a k ee ta 1 ，1 9 9 1 ；刘君，2 0 0 8 ) 。 d a n d e k a r 等( 2 0 0 7 ) 通过改变水溶助长剂浓度，提取温度和原料的用量对酸橙种子 中生物活性成分类柠檬苦素进行提取，研究发现可明显减少有机溶剂用量，减少提 取生物活性成分过程中的污染。刘君( 2 0 0 8 ) 利用水溶助剂法提取类柠檬苦素，通 过正交实验得出用n a c u s 提取类柠檬苦素的最佳工艺参数为：提取时间为6 h 、提取 剂浓度为2 5 m o l l 、温度为4 0 。c 、提取剂用量为2 5 m l ，影响因素大小为提取剂浓 度 提取剂用量 温度 提取时间。在此最佳工艺下提取得率为4 3 2 2 m g g 。 超临界流体萃取法是一种新型的萃取分离技术。与传统的溶剂浸提法相比，具 有提取效率高、无化学溶剂残留、无污染、无异味、天然植物中活性成分和热不稳 定成分不易被分解破坏等优点。同时还可以通过控制临界温度和压力的变化，来达 到选择性提取和分离纯化的目的。y u 等( 2 0 0 7 ) 运用超临界二氧化碳( s c c o z ) 流 体萃取技术从葡萄抽种子中的柠檬苦素和柚皮甙，第一步用s c c 0 2 萃取弱极性的 柠檬苦素，第二步用有乙醇的s c c 0 2 萃取强极性的柠檬苦素糖苷和柚皮甙，实验 表明，当压强为4 8 3 m p a ，温度为5 0 。c 时浸提6 0 m i n 时从葡萄抽籽粒中提取柠檬苦 素含量为6 3 m g g ( y ue ta 1 ，2 0 0 7 1 刘君，2 0 0 8 ) 。 类柠檬苦素的检测方法有薄层色谱法( t l c ) ( o h t a ，1 9 9 3 ) 、h p l c - m s ( s c h o c h e ta 1 ，2 0 0 1 ) 、分光光度法( a b b a s ie ta 1 ，2 0 0 5 ) ，气相色谱法( g c ) ( k r u g e r de ta 1 ， 5 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 1 9 7 2 ；胡阳，2 0 0 7 ) 等，其中，h p l c 法是工业中测定柠檬苦素最常用的方法( 胡 阳，2 0 0 7 ) 。1 9 6 5 年，d r e y e r 首次使用薄层色谱( t l c ) 对柠檬苦素类似物甙元进 行了定量分析( 刘亮等，2 0 0 7 b ) 。f i s h e r 等( 1 9 7 3 ) 最早运用薄层色谱法( t l c ) 分 离出柠檬苦素，然后溶解于氯仿中，蒸干后硫酸溶解定容，最后用荧光光度法检测 ( 刘君，2 0 0 8 ) 。 分光光度法测量柑桔中的类柠檬苦素化合物主要是根据柠檬苦素和艾利希 e h r l i c h 试剂的反应呈红色，可粗略的测量样品中的类柠檬苦素化合物的总量，而且 快速方便，可用于类柠檬苦素的提取研究。田庆国( 1 9 9 9 ) 用该方法得到的线性范 围为o 7 6 2 5 0 h m l ，检测限为o 7 6 x 1 0 。a b b a s i ( 2 0 0 5 ) 等人使用该法得到柠檬 苦素检测的线性范围为0 5 0 p g m l 。但该方法缺乏专一性和普遍性，不能被广泛应 用( 刘亮等，2 0 0 7 b ) 。 r o u s e f f 和f i s h e r ( 1 9 8 0 ) 建立了正相高效液相色谱法，采用c n 基键合硅胶柱 和正己烷、异丙醇、甲醇的三元体系，有效分离奥巴叩酮、诺米林、柠檬苦素和脱 氧诺米林等4 种甙元。孙崇德( 2 0 0 6 ) 对柠檬苦素和诺米林样品的定性采用薄层层 析( t l c ) 的r f 与h p l c 保留时间相结合的方法进行，能有效地对提取样品中的柠 檬苦素和诺米林进行辅助定性，二者的r f 值分别为o 2 5 和o 3 7 ，分离度良好；对 柠檬苦素和诺米林分别进行紫外扫描，结合流动相对分析的影响，确定了2 1 0 n m 作 为二者h p l c 的紫外检测波长。样品定量采用h p l c 的峰面积积分计算。陈静等 ( 2 0 0 6 ) 采用高效液相色谱法，以乙腈四氢呋喃水为流动相在2 0 7 n m 波长下测定 了桔汁中的柠檬苦素。结果表明，柠檬苦素在1 o o 5 0 0 0 m g l 时线性关系良好，检 出限为0 0 7 i t g ，平均加标回收率为9 5 6 9 ，r s d 为2 5 。刘亮等( 2 0 0 7 b ) 人建立 了同时测定柑桔中柠檬苦素和诺米林2 种苷元的高效液相色谱方法。采用 p h e n o m e n e xc 18 ：色谱柱，体积分数4 5 乙睛作为流动相，流速为1 0 m l m i n ，柱 温为2 5 ，在2 1 0 n t o 波长下检测，得到柠檬苦素和诺米林的平均回收率分别9 9 9 1 和9 8 2 8 ，r s d 分别为2 5 5 和2 3 0 。 近年，加利福利亚一位教授( 2 0 0 7 ) 建立一个测定柑桔果汁中的类柠檬苦素糖 苷配基和糖苷浓度的简单、快速的比色方法( 刘君，2 0 0 8 ) 。利用4 二甲氨基苯甲醛 ( d m a b ) 与类柠檬苦素上的呋喃环作用显色测定柑桔果汁中柠檬苦素的浓度。柠 檬苦素的最低检测限和最低定量限分别为o 2 5 和0 5 0 p g m l ，柠檬苦素糖苷分别为 0 5 0 和1 o l a g m l ( f i s h e r ，1 9 7 3 ；刘君，2 0 0 8 ) 。 6 柑橘生理落果有效成分复合提取工艺研究 2 2 辛弗林的研究进展 2 2 1 辛弗林的物化性质及功能特性 辛弗林主要存在于芸香科柑橘属( c i t r u s ) 植物的幼果中。熔点及溶解度：1 8 4 1 8 5 ，盐酸盐结晶熔点1 5 1 , - - 1 5 2 。c ，易溶于水；重酒石酸盐熔点1 8 8 - - - - 1 8 9 。c ，易 溶于水，难溶于乙醇，几乎不溶于氯仿、乙醚。具体结构如图1 - 2 所示。 h o o h h n 图1 2 辛弗林的化学结构式 f i g 1 - 2c h e m i c a lc o n s t r u c t i o no fs y n e p h r i n e 常用中药陈皮、青皮、枳实和枳壳均为芸香科植物果皮或果实，尤其枳实，文 献报道辛弗林含量较高。枳实是一种古老的中药材，始载于神农本草经，是来源 于芸香科( r u t a c e a e ) 柑桔属( c i t r ul ) 的宜昌橙c i c h a n g e n s i ss w i n g 、酸橙 c a u r a n t i u ml 、甜橙c s i n e n s i s ( l ) o s b e c k 、柚c g r a n d i ( l ) o s b e c k 和枳属( p o n c i r u s r a f ) 等植物干燥幼果的统称。枳实中所含成分复杂，主要含有挥发油，生物碱和 黄酮类物质。 辛弗林是枳实中的一种生物碱，是枳实中起主要药理作用的有效成分，具有收 缩血管、升高血压和较强的扩张气管和支气管的作用，麻醉猫静脉注射辛弗林可完 全对抗组胺所引起的支气管收缩；其对豚鼠离体器官亦有同样作用。n 甲基酪胺可 增加冠脉流量和肾血流量，降低心肌耗氧量，并有明显的利尿作用( 任棣等，2 0 0 2 ： 赵雪梅等，2 0 0 8 ) 。除中医的传统应用外，也有生产注射剂在临床应用，用于抢救各 种休克、心衰以及治疗胃及十二指肠溃疡等病症。枳实提取物是西方国家用于减肥 的食品添加剂产品的原料。近年来的研究发现辛弗林能够提高新陈代谢、增加热量 消耗、提高能量水平，氧化脂肪，是一种天然兴奋剂，无副作用，能够缓解因肥胖 引起的轻度和中度抑郁症状，改善心情，因被认为具有潜在的减肥功效而受到青睐 7 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 ( 袁丹等，2 0 0 5 ：p e n z a ke ta 1 ，2 0 0 1 ；周鸣谦等，2 0 0 8 ；c c o l k e re ta 1 ，1 9 9 9 ；蔡 艳华，2 0 0 5 ；陈志红等，2 0 0 8 ) 。不论从其生理活性还是不良反应，辛弗林的的存 在使上述柑橘类果实药材倍受关注( 赵宇等，2 0 0 6 ) 。随着研究的深入，辛弗林的应 用领域逐渐广阔，在食品、饮料等保健行业也显示了极大的应用潜力( 蔡艳华，2 0 0 5 ) 。 目前，辛弗林研究较多的主要从枳实中提取，其含量随药材的生长程度变化成 规律性的变化，即果实越趋于成熟，辛弗林含量越低，一般在未成熟果皮中的含量 较高( 赵宇等，2 0 0 6 ) 。因其在未成熟果皮中含量较高，生理落果主要是未成熟果实， 所以从落果中提取辛弗林是具有可行性的。 2 2 2 提取辛弗林的的工艺研究 y o s h i m u r ak 首次报道了柑桔属中的生物碱，并分离出了甜菜碱( b e t a i n e ) 和水 苏碱( s t a c h y d r i n e ) 。h e r b s tej 等在橙汁中鉴定出了腐胺( 又名丁二胺，p u t r e s c i n e ) 。 u d e n f r i e n ds 等在橙中分得了酪胺( t y r a m i n e ，1 0 m g k g 橙子) 。s t e w a r ti 等分得了脱 氧肾上腺素( s y n e p h r i n e ) ，同年在柠檬的叶子和果汁中发现了l 真蛸胺( 又称作章 鱼胺，l o c t o p a m i n e ) 。w h e a t o n 等在葡萄柚的果汁和叶子中第一次分离鉴定了阿魏酰 腐胺( f e r u l o y l p u t r e s c i n e ) ，并首次从柑桔属植物的叶及果皮中分离得到l 辛福林 ( l s y n e p h r i n e ) ，同年在柑中分离鉴定了n 一甲基酪胺( n m e t h y l t y r a m i n e ) 和大麦芽 碱( h o r d e n i n e ) 。2 0 世纪7 0 年代，我国湖南医药研究所从枳实中也分离得到了n 甲基酪胺( 赵雪梅等，2 0 0 8 ) 。 张良华等( 2 0 0 8 ) 建立了离子交换柱色谱高速逆流色谱法纯化制备辛弗林的方 法。高速逆流色谱溶剂系统为乙酸乙酯正丁醇水三氟乙酸( 1 ：2 ：3 ：0 0 0 3 ，体 积比) ，下相为固定相，上相为流动相，从含辛弗林1 0 的枳实粗提物中纯化制备出 辛弗林产品，经高效液相色谱分析纯度为9 5 2 。 李俊和余丽娟( 1 9 9 8 ) 提出从枳实中提取辛弗林的工艺：用稀盐酸水溶液提取， 用0 0 1x 7 强酸性苯乙烯阳离子交换树脂进行交换，用n a h c 0 3 溶液湿润树脂，用乙 酸乙酯洗脱。这一工艺生产的产品辛弗林含量较高。吴崇珍等( 2 0 0 4 ) 最佳工艺为 用6 倍量9 5 乙醇回流提取3 次，每次1 5h ；枳实药材中辛弗林含量为0 4 3 8 ， 枳实提取物中辛弗林含量为4 0 6 。 蔡艳华( 2 0 0 5 ) 通过比较选择渗漉法作为辛弗林的提取方法，确定了先用枳实 粗粉浸润，之后酸液浸泡溶出辛弗林，然后以酸液为提取溶液进行渗漉的提取工艺。 柑橘生理落果有效成分复合提取工艺研究 确定了以两倍水量浸润枳实1 2 小时，减小了后续实验中传质阻力；以3 倍体积 0 2 m o l l 盐酸溶液浸泡2 h ，使枳实中辛弗林完全转化为辛弗林盐酸盐。选取0 0 1x 8 树脂进行分离，结合前述渗漉提取工艺，整个提取分离工艺的辛弗林提取率达8 6 。 浸膏得率3 7 4 ，纯度2 2 2 7 。 肖荣国( 2 0 0 5 ) 采用紫外分光光度法定量，以生物碱含量作为评价指标，以l 8 ( 27 ) 正交设计优选提取工艺条件。优选枳壳中有效成分生物碱的最佳提取工艺。 结果枳壳的最佳提取工艺条件为：枳壳粗粉加9 、6 、6 倍量水，浸泡0 5 h ，分别煎 煮3 次，时间分别为3 0 、1 5 、1 5 m i n ，醇沉加醇量为3 倍量。结论该方法简单，数 据可靠，可作为枳壳中总生物碱提取的最佳工艺。罗旭彪( 2 0 0 6 ) 提出“绿色”色谱， 以章鱼胺，辛弗林和酪胺为对象，对有机胺类生物碱进行分析方法研究。发展了“绿 色”色谱分析有机胺类生物碱的h p l c u v 方法，利用室温离子液体的水溶液作为绿 色流动相，解决了分离章鱼胺、辛弗林和酪胺的峰形拖尾、低保留和低分离度的问 题，实现了对章鱼胺、辛弗林和酪胺的同时分离。 刘海兴( 2 0 0 8 ) 采用毛细管电泳法测定枳壳中辛弗林和柚皮素的含量。在 3 0 m m o l l 硼砂缓冲溶液( p h l o o ) 的条件下，实现了被测组分的有效分离。测得枳 壳中辛弗林含量为0 7 2 4 2m e d g ，相对标准偏差为5 9 ( n = 5 ) ；柚皮素的含量为o 9 0 4 7 m g g ，相对标准偏差为