（应用化学专业论文）芯片高效液相色谱飞行时间质谱联用系统性能评价及药物小分子分析.pdf

硕i ：论文芯j 1 l - 荔效液相色谱飞行时问质谱联用系统悱能订价及药物小分了分析 摘要 本文首次建立了药物小分子的纳流高效液相色谱芯片飞行时间质谱( n a n o l c c h i p o t o f - m s ) 分析方法，以茶碱、咖啡因等药物小分子为研究对象对芯片 色谱性能及应用于药物小分子分析的可行性进行了评价。试验采用带有5 0 0 n l 富集柱的色谱芯片，以0 1 甲酸水及乙腈为流动相，梯度沈脱，纳流泵流速 0 3 9 l m i n ，毛细管泵流速4 p l m i n ，飞行时间质谱电喷雾电离阳离子检测模式， 以茶碱为基准物质测得的色谱柱效为1 4 4 0 0 塔板数，而传统色谱柱只有数千塔板 数。实验测得系统具有良好重现性，峰面积相对保留偏差小于6 7 1 ，保留时问 相对标准偏差小于0 3 2 。以咖啡因和乙酰卡尼为目标组分测定系统的线性，线 性回归系数r 2 分别为0 9 9 6 和0 9 9 5 1 。本法测定的药物小分子的最低检测限达 到了匹克每微升级，可的松甚至达到了0 0 2 p g g l ，同快速高分辨液相色谱相比 降低了3 个数量级。 建立了辉瑞成药组分的芯片色谱分析方法，确定l g l 的进样体积、4 9 l 的 上样体积、阀切换模式和0 1 甲酸水流动相为最优化的检测条件。完成了对样 品稀释溶剂组成的考察，在2 0 的乙腈水溶液时获得了最高的检测值和良好的重 复性，并消除了峰拖尾现象。药性成分的最低检测限达到了0 1 p p l ，峰面积相 对保留偏差小于7 2 7 ，保留时| 、日相对标准偏差小于0 5 5 ，线性动态范围在 1 0 21 0 3 之问。成功测定了辉瑞成药中含量1 的药物活性组分，但是和主成分出 峰时间相近的组分由于离子竞争作用难以得到良好检测。 初步探索了芯片色谱技术在复杂生物样品分析中的应用，建立了复杂生物样 品的芯片色谱分析方法，完成了目标组分在复杂生物样品中的色谱分离优化，利 用标样比对、一级质谱谱图解析、二级质谱谱图解析等方法成功对目标组分进行 了定性分析。 关键词：纳流液相色谱芯片飞行时间质谱；最低检测限；线性动念范围；药 物小分子；药物活性成分 a b s t r a c t硕l ：论文 a b s t r a c t t h e p a p e rs e tu pt h em e t h o do fs m a l lm o l e c u l ep h a r m a c e u t i c a la n a l y s i ss u c ha s t h e o p h y l l i n ea n dc a f f e i n ew i t hn a n ol c c h i p o t o fm ss y s t e m t h es y s t e mu s ea c h i pw i t ha5 0 0 n l e n r i c h m e n tc o l u m ni n s t e a do ft h et r a d i t i o n a lc o l u m n t h ef l o wr a t e o fn a n o p u m pi s0 3 i t l _ m i n ，a n d c a p i l l a r y p u m pi s4 1 a l m i n c o m p a r e dw i t hf e w t h o u s t h a n d sp l a t en u m b e r so ft r a d i t i o n a lc o l u m n ，t h ec h i pi s1 4 4 0 0 t h es y s t e mh a sa g o o ds t a b i l i t y , r e p r o d u c i b i l i t ya n dl i n e a r i t y t h er tr s d i sl e s st h a n0 3 2 ，p ar s d l e s st h a n6 7 1 t h el o do fs m a l lm o l e c u l ep h a r m a c e u t i c a li sf e wp i c o g r a m sp e r m i c r o l i t r e ，w h i c hi st h r e eo r d e r so fm a g n i t u d el o w e rt h a nt r a d i t i o n a lh p l c s e tu pt h em e t h o do fp f i z e rd r u g sa n a l y s i s ，o b t a i n e dt h eb e s tr e s u l t su n d e rt h e c o n d i t i o n so f1p li n j e c t i o nv o l u m n ，4 1 a li n j e o i o nf l u s hv o l u m na n dc h i pv a l v em o d e l t h ep a p e ra l s ot e s t e dt h ec h a n g e so fd e t e c t i o nr e s u l t sa f f e c t e db yd i f f e r e n ts a m p l e s o l u t i o n s t h el o do fa c t i v ep h a r m a c e u t i c a li n g r e d i e n to fp f i z e rd r u g si s0 1 p l a l ， r tr s dl e s st h a n0 5 5 ，p ar s dl e s st h a n7 2 7 ，t h ed y n a m i cr a n g eo fl i n e a r i t yi s b e t w e e n1 0 2a n d1 0 3 d e t e c t e da l la c t i v ep h a r m a c e u t i c a li n g r e d i e n ta ta b o u t1 l e v e l ， b u tt h ea p lw h i c hh a sas i m i l a rr e t e n t i o nt i m ew i t hz i p r ai sd i f f i c u l to td e t e c t e d b e c a u s eo ft h ec o m p e t i t i o no fi o n i z a t i o n p r e l i m i n a r y r e s e a r c ho fc o m p l e xb i o l o g i c a ls a m p l e sa n a l y s i sw i t hn a n o l c - c h i p o t o fm ss y s t e m ，o p t i m i z e dt h es e p r a t i o nc o n d i t i o n s q u a l i t a t i v ea n a l i z e d t h et a r g e tc o m p o n e n ti np l a s m aw i t hs t a n d a r ds a m p l e ，m ss p e c t r a m sa n dm s m s s p e c t r a m s k e y w o r d s ：n a n ol c - c h i p o t o f - m s ：l o d ；d y n a m i cr a n g eo fl i n e a r i t y ：s m a l l m o l e c u l ep h a r m a c e u t i c a l ；a p i 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在 本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发 表或公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学 历而使用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均 已在论文中作了明确的说明。 研究生签名： 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅 或上网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或机构送 交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容。对 于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名：壅丝笪伊7 年，月工乡日 颐i j 论文一u h - 川i = 川- 效液相色谇警飞行时问质带联用系统性能评价及药物小分了分析 1 绪论 现代色谱技术的突飞猛进使它在分析复杂体系时具有无与伦比的优势，并成为人们 分析复杂体系的优先选择，它被广泛应用在医药科学、生命科学、环境科学以及石油化 工等领域n 咱1 。药物在人类的生活中占有极其重要的地位，为人类的生命和健康提供保 障。但是有很多药物的药性成分、代谢途径以及作用机理等并不被人们所知，所以我们 要对此进行深入的研究探讨，以便更好的指导用药和新药研发。 目自 ，气相色谱、液相色谱、质谱以及它们的联用技术已经在药物分析领域取得了 良好的效果。但是随着人们对药物体系中更加微小含量物质的分析要求的增加，原有色 谱技术已经越来越难以满足。芯片色谱技术的出现，为这个难题的解决带来了希望，和 电喷雾电离质谱联用后得到了比传统高效液相色谱质谱高的多的灵敏度。 1 1 纳流芯片高效液相色谱技术 芯片色谱技术已经在蛋白质组学研究中得到了成功的应用，并展现出了极高的灵敏 度优势，但是在药物小分子应用领域尚无人涉及。本课题通过分析药物小分子对芯片色 谱系统系能进行评价并对应用于药物小分子分析的情况进行初步研究。不论是对芯片色 谱进行性能评价还是将芯片色谱技术应用于药物小分子分析在国内均属于首次。 纳流芯片高效液相色谱技术采用新颖的设计把传统色谱柱浓缩成约8 厘米长4 厘米 宽几毫米厚的色谱芯片，色谱芯片采用聚酰亚胺复合材料，通过激光镭射技术在色谱芯 片上刻出分析通道，填以粒径5 u m 的z o r b a x8 0 a s b c 1 8 固定相 1 。此系统采用安 捷伦g 1 3 7 7 a 纳流泵和g 1 3 7 6 a 毛细管泵提供稳定的液流，使色谱芯片上分析柱的流速 达到几百个纳升每分钟的流速。 纳流高效液相色谱作为一种新兴的色谱技术还不被人们所熟知，最先它被应用在蛋 白质组学的研究中，并表现出了卓越的色谱性能，引起了科学工作者极大的关注和兴趣。 现在人们已经不局限于把色谱芯片技术应用在蛋白质组学上，在其他领域色谱芯片技术 也应有美好的应用自订景。 1 1 1 纳流高效液相色谱技术发展历程 二十世纪九十年代，科学工作者制造出了内径1 0 0 1 a m 规格的硅毛细管色谱柱，最 初这种规格的毛细管被用在气相色谱上，管内填充了液体固定相，得到了良好的检测效 果。柱内径的减少，使得样品的消耗量减少，但是柱效并没有因此损失反而获得了更好 的信号强度，色谱柱微型化带来的一系列成功使它成为色谱工作人员的研究热点。 1 绪论 硕l ：论义 随后发展出了1 。2 m m 内径的微孔光滑钢质色谱柱，这种柱子仍然能和传统的高效 液相色谱连用，并且和装有相同填料的4 m m 内径柱子有相同的色谱性能，最主要的原 因是色谱柱硬件和填充水平的改进，这种填充的压力一般高于1 0 0 0 b a r ，最佳的填充压 力取决于硅胶填料的型号。r o u m e l i o t i s 等n 2 1 增加压力到2 0 0 0 b a r ，硅胶填料仍然保持稳 定的机械性能。 色谱柱的进一步微型化使柱内径降到了几百微米，最小的内径达到了2 0 p m ，它使 用聚乙烯材料叠加而成，这就是现在的芯片技术。我们使用的色谱芯片材料是由聚酰亚 胺薄膜叠加而成的，色谱芯片上的分析柱的内径只有7 5 1 a m ，柱体积只有约3 3 0 纳升， 真f 把色谱柱降到了纳升级别。柱体积的微型化极大的降低了死体积，进而缩短了死时 间，特别是对短分析而言。 色谱柱的内径降到了几十微米，还需要提供和如此窄内径的色谱柱相配套的稳定流 速。k l a u sk u n g e r n 3 1 通过实验测得了不同内径的色谱柱所对应的最佳流速，如下面表 1 1 所示： 表1 1 色谱梓内径对应的最佳流速 从上表可以看出，微流柱和纳流柱对应非常低的最佳流速，7 5 p m 内径的色谱芯片 只需要几百个纳升每分钟的流速，这就要求微流液相系统和纳流液相系统不但在等度条 件下，在梯度条件下也要能提供相应的流速范围。r a p p 和t a l l a r e k n 钉着重从可行性、死 时间和死体积方面探讨了微流和纳流的形成和控制。安捷伦公司研制的g 1 3 7 7 a 纳流泵 和g 1 3 7 6 a 毛细管泵采用独特的设计可以提供稳定可靠的纳流，在下面的章节将会做详 2 硕l j 论义 j 苍 高效液相位讲飞行时问质谱联用系统性能评价及药物小分了分析 细介绍。 流速的降低、柱内径的减小、柱体积的减少，带来的不仅是灵敏度的提高、分析时 间的缩短和样品消耗的减少，同时也带来了很多设计上的技术难题。它迫使设计人员充 分考虑毛细管、色谱芯片以及阀之脚的接口闯题，以减少接口的死体积降低柱外效应和 峰展宽，获得理想的柱效。除了这些，色谱芯片技术还需要不同的进样系统和检测器， 下面会做详细介绍。 1 1 2 纳流芯片高效液相色谱飞行时间质谱系统构建 纳流高效液相色谱芯片飞行时间质谱是安捷伦公司在a g i l e n t 系列液质连用仪器 基础上设计丌发出的一款新型液质连用仪。此系统由n a n ol c 液相色谱系统、纳流高效 液相色谱一芯片飞行时问质谱系统转换界面( i n t e r f a c ec u b e ) 、电喷雾质谱转换接口、 6 5 1 0q t o f 质谱以及m a s s h u n t e r 数据采集处理系统构成。a g l i e n t1 2 0 0n a n ol c 系统包 括微型自动进样器( 带有样品恒温器) 、全自动在线脱气机、毛细管泵( c a pp u m p ) 和 纳流泵( n a n op u m p ) 。高效液相色谱一芯片飞行时间质谱系统转换界面提供高效液相色 谱一芯片、毛细管泵、自动进样器、纳流泵和6 5 1 0 单重四极杆飞行时间质谱之间的所有 连接。 该仪器把芯片和进样系统及电喷口连在一起，实现了样品的在线分离分析。据 h o n g f e n gy i n 和k e v i np k i l l e e n 0 5 1 报道，使用个单流体泵产生的梯度流动相流速可以 低于1 u i m i n 梯度滞留时间也从商业液相色谱泵的几分钟降到了几秒钟，大大缩短了分 析时间，增大了分析量。因为使用了该芯片，溶剂输送系统得到了很大的简化，提高了 仪器的稳固性和可靠性，减少了污染，而且非常易于使用。 芯片高效液相色谱质谱连用技术提供了更高的检测灵敏度，在蛋白质研究和医药领 域得到了广泛应用。该技术提供了一个传统毛细管分离平台的替代品，但是仍然需要一 个微流泵柬产生溶剂梯度，输送流动相通过芯片的分离通道【l6 。所以这个系统的梯度滞 留时间仍然是有意义的，特别是在低的流速下，因为：微流泵本身有个死体积； 连接泵和芯片的毛细管也有死体积。在2 0 0 n i _ c m i n 的流速下，由于泵和连接毛细管，在 液相色谱柱中的实际梯度形成时问比理论值要长2 - - 5 分钟。这个滞留对于长时间分析的 影响不大，但是对于短时间高分析量低流速的分析来说就很重要了。传统的液相色谱泵 在特定的低流速范围内可以很好的工作，大概在1 0 p l m i n 1 m l m i n 之问。当需要形成 梯度沈脱时，两个泵须独立的输送流动相a 和b ，形成b a 的变化。梯度沈脱刚丌始时， 流动相b 通常只有总流动相的百分之几，这意味着泵b 的流速比总流动相的流速要小的 多，且有时不在泵的最佳流速范围内。当使用微孔液相色谱柱和总流速低于1 0 i - t l m i n 时 情况更糟糕，例如，当泵流速为1p l m i n ，梯度开始5 b ，泵b 的流速就会是5 0 n l m i n 。 出于温度变化、活塞的阻流、溶剂的可压缩性，精确的输送这么低的流速是很困难的。 1 绪论硕i ：论义 有个解决办法是用反馈测量法控制压力从而获得合适的流速【1 。”。但是这种设计的成功需 要有流体传感器精确快速的反应和回流控制电路的良好工作，它面临的最大挑战来自于 梯度循环过程的丌始和结尾，此时传感器和回流控制电路被迫在一个非常小的流速下工 作。如果流体传感器放在溶剂混合点的下游，这个问题就迎刃而解了8 1 。这样，泵就能 以一个比较大的流速输送流动相，大概在2 0 0p l m i n - - 8 0 0 1 a l m i n 之间。但是，输送的流 动相只有很少的一部分进入色谱柱，大部分的流动相被排到废液瓶中。 近来，科研工作者已经研究了很多的梯度洗脱方法。i s h i i 等设计了h p l c 梯度( 间 歇式喷出) 装置，特别是对微流色谱。他们形成梯度的方法包括往一个混合容器中持续 的通入一种溶剂，而这个混合容器被包含在一个内径0 5 m m 的管道中。这样，他们可以 把完成的梯度储存在这个管道中【1 9 1 。d a v i s 等描述了另一种低流速梯度溶剂输送系统， 在一个长的细孔管道中用两个注射型泵来完成和储存梯度溶剂1 2 0 1 。e s c h e l b a c h 和 j o r g e n s o n 用一个梯度泵形成溶剂梯度，然后用一个高压泵让梯度溶剂通过纳米色谱柱 1 2 。d e g u c h i 等用一个十孔真空管来描述液相色谱梯度，通过一个高流速的低压泵和另 一个低流速高压泵【2 2 1 。通过合适的混合，从众多装满不同浓度流动相的储液瓶中流出的 混合流动相，可以得到光滑的梯度曲线田j 。 为了可以得到大量的应用，分析中的死时间需要尽可能的小。传统的液相色谱泵一 般有压力阀和搅拌器，由此带来的死体积对纳米规模流速的分析是很不利的。例如，溶 剂混合点到柱头之间l “l 的死体积( 包括各配件、连接毛细管、真空管和样品富集柱引 入的死体积) ，在2 0 0 n l m i n 的流速下会产生5 m i n 的死时间。 芯片高效液相色谱只使用几毫升的流动相a 和b 就可以在芯片上形成良好的流动相 梯度。芯片夹放在a g i l e n t 高效液相色谱和芯片真空固定子之间。由于梯度和液相色谱分 离芯片产生的死体积可以降低到几个纳升，死时间因此也只有几秒钟，很大程度的减少 了死时间和分析时间，增大了样品的分析量。 1 1 3 纳流芯片高效液相色谱原理 纳流高效液相色谱芯片飞行时问质谱采用了独创的芯片色谱技术代替了传统的色 谱柱，带来了色谱柱技术的飞跃式进步，做到了色谱柱的微型化、自动化和智能化。色 谱芯片长约8 厘米宽约4 厘米，由微米厚度级的聚酰亚胺薄片在高温高压条件下叠加而 成，再通过激光切割技术在色谱芯片上切割出富集和分析通道，最后用独特的生产工艺 填充固定相。色谱芯片包括1 5 0 m m x o 0 7 5 r a m 的分析柱、纳米电喷1 2 1 ( n a n os p r a y ) 、连 接毛细管路和富集柱分析柱的接口，根据不同的分析需求，色谱芯片上可以装有不同富 集体积的富集柱，有的色谱芯片没有富集柱而只有一个1 4 n l 的l o o p 环，富集柱和色谱 柱均使用z o r b a x8 0 as b c 1 85 p m 固定相填充，如下图1 1 。所有的色谱芯片上都内 嵌有一个微型电脑芯片，记录此色谱芯片的规格型号、编号、填料等详细信息和使用时 4 i 论r剖：，敢淑相也阱1 t 时目质晰联1 玎系统”价鲥物十n 丁分析 问、进样次数等实时信息，蕈；现了色谱芯片和操作系统的智能连接，操作人员在系统操 作界面上即可以完成芯片的装卸，非常方便快捷。更重要的是可以通过操作界面调节纳 米电喷口的位置，实现最优化的电喷电离效果，提高分析的灵敏度。 莲萝 图 幽1 i 色谱芯片剖面剀 纳流高效液相色谱一芯片飞行时削质谱系统转换界面( i n t e r f a c ec u b e ) 实现了色谱 芯片、泵、自动进样器以及质谱之间的连接。它由高效液相色谱芯片，质谱转换箱、显 示器和芯片箱装配器= 二部分组成。高效液相色谱芯片转换箱属于安捷伦1 1 0 0 系列，它 把芯片和泵、自动进样器联系在一起，把芯片从固定器中吸出，并同定在卜次使用时相 对r 质谱入口的位置，并提供两个独立的高压纳流转换阀。芯片箱装配器充分利用商效 液相色谱一芯片转换箱形成了一个喷雾室。带有保险丝的硅喷针可以放在固定器的支架 上，这样在没有转换箱的条件r 也u 丁以形成纳流喷雾了。装配器使用两个最常用的卡槽 和质谱连接起柬，它可| 三【很方便的装卸，也便r 质谱的维修。当使用者把色谱芯片放进 转换箱的装载槽时，所有的装载操作都是电脑自动完成的而不需要手工。当操作界面中 待机和操作状态可选时，芯片固定臂把芯片旋转进来。阀和定子位于芯片的两边，当芯 片固定器处于阀和定子的垂直位置时，阀和定子会把芯片紧紧的夹住，实现阀和芯片的 无线连接，而不会增加死体积，内切阀和外切阀均是由多级传动机制动。 当芯片不在操作位置时，毛细管泵和纳流泵会自动关掉，这样可以阻止泄露的溶剂 通过外着的定子丌u 进入转换箱。当芯片处在操作状奎时泵可咀被打丌。当质谱处于 操作模式时，高电口i 产生了- 个静电场，小液滴从电喷雾喷针口进入静电场，纳流喷雾 丌始。实际操作起来并不像描述的那么容易，激发喷雾是一个相当困难的事情，我们可 5 1 绪论顾l ：论文 以通过工作站调节芯片喷针的上下位置、电压的高低，以及转换箱下面的旋钮来调节芯 片的左右位置。最优化的喷雾情况应该是喷针口处于毛细管端口的上沿和电极上沿的连 线上，液流有个平滑稳定的曲线，落在毛细管端口的下沿( 图1 2 所示) 。喷雾情况还 和流动相的组成密切相关，当流动相中水含量大时，由于水的黏度大表面张力大，不容 易激发喷雾，需要相对较高的电压，随着洗脱强度的增加，有机相比较增加，流动相黏 度变小，同样的电压条件下，有可能会引起喷雾情况变的不稳定甚至于难以产生液流， 而只是产生喷射状的雾团，影响电离效率，所以在实验过程中如何选择合适的电压是非 常重要的，下图1 2 是一个理想的纳流电喷雾示意图。 图1 2 纳流电喷雾示意图 从芯片电喷雾喷口流出的液体在静电场、干燥气等多方面因素的影响下，产生一个 纳流曲线。带点小液滴在高温干燥气的脱溶剂化作用之后，由于电场作用进入连接质谱 的毛细管，进而进入单重四级杆质谱。 1 1 4 纳流芯片高效液相色谱在蛋白质组学中的应用 芯片技术的出现，迅速吸引了研究人员极大的兴趣，尤其以蛋白质组学方面的应用 最为活跃。x i a o j i n gl i 等m 】将芯片技术应用到u p l c 和傅里叶质谱连用上，在充分优化 保留时间、液滴流速、单个液滴体积之间的关系后，得到了纯净的切片峰，检测到了细 胞释放的信号物质a h l ，a h l 的同间保留时间r s d 小于0 2 ，同白j 峰面积r s d 小于 0 5 。峰宽在0 0 3 - 0 0 5 分钟之间，r s d 小于0 1 。质量精度高于2 0 0 p p b ，r s d 小于 0 0 1 。j a ns r b e k 等1 2 5 】用芯片技术从非常复杂的生物药品中，得到了目标组分的定性信 息。实验结果显示，他们从大米和扁豆种子里分离鉴定出了1 1 到1 3 种蛋白质，经二级 质谱鉴定后，估计氨基酸的最低检测限可以达到5 到7 f m o l 。h o n g f e n g n 等1 2 6 j 用2 0 f m o l 浓度的b s a 酶解样品测试芯片喷雾的稳定性，连续运行周后仍然状况良好，而且b s a 的四种酶解产物得到了分离，证明芯片可以用以蛋白质组分的色谱分离。此外，他们还 考察了灵敏度和流速的关系，在考察了1 0 0 4 0 0 n l 的流速范围后发现线速度越低灵敏度 越高，这是因为流速越低离子化效率越高。 r e i da b r e n n e n 等【2 7 】用实际样品检测芯片的分离情况，得到了良好的重现性和色谱 6 硕i ：论义芯j | 1 南敛液相色莆飞行时问质讲联用系统性能评价及药物小分了分析 图，电喷雾也很稳定，和传统纳流液相色谱相比，梯度延迟缩短了2 0 到4 0 。m a r k u s t m n z e r 等f 2 8 j 将芯片和普通色谱柱连用，组成二维液相分析人尿中的b s a 代谢组分，生 物样品在普通色谱柱上分离切割后进入芯片。此方法检测到了3 7 种代谢物，比普通 l c m s 法要多，而且得到了更高的灵敏度。m i l a d yr n i n o n u e v o 等 2 9 3 0 利用 h p l c c h i p m s 检测人奶中的生物活性分子低聚糖。人奶中含有的低聚糖虽然不能作为 直接的营养物质，但是有人设想它们对婴儿的免疫力非常重要。但是检测低聚糖的准确 成分和了解它们的生物作用是非常困难的，芯片技术为这些提供了可能。他们检测到了 三种含量最高的成分，约占总量的5 5 ，和已经发表的检测结果相一致，充分显示了高 效的分离能力。连续进样十针，保留时间r s d 小于0 1 ，时间偏差在0 0 1 到0 1 5 分钟 之问。但是不同芯片或者已经使用了几天的芯片的保留时间偏差最大达到了1 5 分钟， 所以在分析样品的时候要使用同一个芯片并尽量在一天内完成。峰面积的r s d 在 3 。2 9 之间，峰高的r s d 在3 。1 5 之间，响应强的组分的r s d 更小。此方法最终 检测到了1 8 3 种低聚糖类物质，证明了c h i p 在分析生物样品时的优良特性。 m a r t i nv o l l m e r 掣3 1 j 把芯片色谱和阳离子交换色谱联合起来形成二维色谱，对人类 细胞核蛋白质组分进行鉴定分析，最终鉴定出来2 0 6 种经典蛋白2 0 2 4 种具有代表性的 氨基酸，而不使用芯片色谱仅仅使用阳离子交换色谱只能鉴定出3 4 种蛋白1 5 1 种氨基 酸，说明芯片色谱和其他色谱的连用非常适合分析超复杂的生物样品。j u l i eh a r d o u i n 等 【3 2 l 把芯片技术和离子阱质谱结合起来用来蛋白质标记物的鉴定。缩氨酸类在芯片色谱上 得到了很好的分离，稳定的分离度和重现性。精确的保留时间、荷质比对了标记物的定 性非常有意义。他们把芯片色谱和纳流液相色谱做了对比，相同的样品纳流液相色谱的 保留时间的相对标准偏差为0 4 7 一1 9 6 ，而芯片色谱只有0 0 7 - 0 5 3 。a ns t a e s 等【3 3 】对芯 片技术蛋白质组学上的应用进行了评估，他们分别用色谱芯片和传统n a n o 色谱分析人 类t 细胞蛋白成分。实验结果证明，色谱芯片可以用来分离非常复杂的生物蛋白样品， 同传统方法相比还可以鉴定出更多的蛋白和缩氨酸。传统方法分别只鉴定出了9 0 2 、3 5 0 种缩氨酸和蛋白质，而运用芯片色谱技术分别鉴定出了1 5 4 3 和5 5 0 种，因为芯片拥有 更高的灵敏度，可以检测到传统方法检测不到的低成分物质。同时，运用芯片技术检测 到的分子量和传统方法差别不大，证明芯片色谱可以提供精确的定性能力。纳流液相色 谱已经作为一种成熟的技术应用在寻找新的生物标记物的研究，但是芯片技术表现出了 可以进一步提高鉴定能力的潜力。m a g a l i ed u c h a t e a u 等】利用芯片色谱和离子阱质谱连 用技术分析牛血清白蛋白( b s a ) ，鉴定出了比传统纳流液相色谱更多的蛋白，保留时间 有很好的重现性，分子量有很高的精确度，灵敏度也提高了5 个数量级。 纳流芯片高效液相色谱、纳流芯片高效液相色谱和其他色谱组成的多维色谱联用以 及和质谱的联用技术，在蛋白质组学研究领域表现出了很好的特性，得到了更高的灵敏 度，可以检测到常规色谱方法难以分离检测到的痕量组分，电喷雾电离联用时强极性的 7 1 绪论 硕i ：论义 物质灵敏度甚至会有几个数量级的提高。色谱芯片获得的色谱峰的保留时间相对标准偏 差也非常小，对于色谱定性具有很重要的作用。芯片色谱在蛋白质组学研究中的成功为 其在其它领域的发展提供了信心，拥有潜力巨大的应用前景。 1 2 电喷雾电离 电喷雾电离是一种软电离技术，即是在不破坏分子结构的情况下，产生检测物的准 分子离子。同其他电离方法相比，电喷雾电离产生的谱图比较简单，易于确定检测物的 分子量利于定性。电喷雾电离可以检测分子量范围很宽的物质，不仅适合检测小分子， 还能使大质量的有机分子生成带多电荷的离子。电喷雾电离和质谱的联用技术已经成为 药学和生物医学研究领域的标志性工具，广泛的应用在组合化合物库的高通量筛选、杂 志分析、药代动力学研究和代谢产物的确认，以及蛋白质结构特征的表达等各方面应用 领域。 1 2 1 电喷雾电离发展历程 对电喷雾现象的研究最早可以追溯到二十世纪六十年代，e r w i nn e h e r i ”】首次使用电 喷雾法产生大分子气溶胶，并将其中生物聚合大分子引入质谱电离源。1 9 6 8 年，m a l c o l m d o l e t 3 6 _ 7 】及其合作人员展示了聚苯乙烯从苯和丙酮溶液中可以产生电喷雾的实验数据， 其平均分子质量可以达到或超过5 1 0 0 0 u 。但是随后的7 0 年代，电喷雾作为质谱离子源 的系统研究进入了停滞阶段，研究人员的目光被a p c i 电离所吸引。进入8 0 年代后， e s i 电离的研究重新变得活跃起来，j o h nf e 衄【3 & 3 9 】采用逆流的反吹气不仅提高了去除溶 剂的效率，而且降低了真空区域的污染，通过对小分子化合物的研究，更加清楚和理解 了电喷雾电离的机理。 二十世纪九十年代的电喷雾电离研究进入高速的增长和全面的发展。v a nb e r k e l l 4 0 j 报告了离子阱质谱和电喷雾电离源的成功连用。l a r s e n 和m c e w e n t 4 1 1 报告了适用于磁质 谱的电喷雾离子源，由于采用了高电压浮空的机械泵，从而避免了电喷雾电离源与机械 泵之间的高压放电现象。b o y l e 和w h i t e h o u s e t 4 2 “3 】首次分别报道了电喷雾飞行时问质谱 系统。d o d o n o v 【4 4 】等首先报告了正交加速电喷雾飞行时间质谱系统。随后，不断有研究 人员公布了将电喷雾电离与傅罩叶质谱连用的相关测试数据。 早期的e s i 电离源所能适应的流速非常有限，仅有几个微升每分钟左右，而且对溶 剂的组成也有很多限制。b 1 1 l l n os 【4 5 l 等使用了气体辅助的电喷雾技术，使得电喷雾电离的 实用技术有了重大突破，可以适应很宽的流速范围，各种溶剂的组合、不同的电解液浓 度和各种电场强度，喷雾接口能承受几百微升每分钟的流速，可以满足蚴s 的接口 要求。现在的纳流电喷雾接口可以提供几百个纳升每分钟的接口，带来了电喷雾技术的 又一次重大突破，在纳流电喷雾部分将做详细介绍。 8 颁i ：论文心- i i ，l i 商效液相色谱飞行时间质辫联用系统住能评价及药物小分了分析 1 2 2 电喷雾电离原理 电喷雾电离的基本过程可以简述如下：在管内含有极性溶剂的毛细管术端加上高电 压，可以产生微小液滴的气溶胶喷雾，在喷雾过程中常辅以雾化气或超声雾化装置。为 了克服液体膨胀吸热而产生的簇离子，还常常同时使用干燥的浴气或加热去溶剂法。通 过取样小孔或气液分离器将小液滴引入真空系统，真空接口还包括差级真空系统和离子 聚焦系统，保证最大的离子传输率。真空系统中的碰撞诱导解离( c i d ) ，一方面可以克 服溶剂簇离子，另一方面可以提供具有结构特征的碎片离子信息。 电喷雾过程实质上是电泳过程，通过高压电场可以分离溶液中的正离子和负离子， 比如在正离子模式下，电喷雾电离针相对真空取样小孔保持很高的正电位，负电荷离子 被吸引到针的另一端，在半月形的液体表面聚集着大量的正电荷离子。液体表面的正电 荷离子之间相互排斥，并从针尖处的液体表面扩展出去，当静电场力与液体的表面张力 保持平衡时，液体表面锥体的半顶角为4 9 3 。，gt a y l o r 4 6 】称之为“t a y l o r 锥体”。随着小 液滴的变小，电场强度逐渐加强，过剩的j 下电荷克服表面张力形成小液滴，最终从t a y l o r 锥体的尖端喷射出来，如下图1 3 所示。 图1 3t a y l o r 锥体电喷雾电离示意幽 喷雾针喷出的气溶胶带有过量的正电荷，随着溶剂的挥发和小液滴的变小，表面电 荷与表面积的比值就会变大，直到电荷排斥力足以克服表面张力，使小液滴发生溅射， 此时电荷排斥力等于表面张力，并服从雷利稳定限【4 7 】，可用公式表述如下： l q r y = 8 万( 毛旭j ) 2 q 为小液滴电荷数；r 为小液滴半径：e o 为真空介电常数；y 为表面张力。 带点小液滴通过发射出细小的小液滴来降低库伦力，随着溶剂的不断挥发，小液滴 又会重新达到雷利稳定限，然后又会进一步发射出更细小的小液滴，干燥小液滴的最终 命运现在有两种理论：o r o l l g e n 4 8 】提出带点残渣理论，认为电喷雾电离检测到的小离子 9 1 绪论 硕i j 论文 是小液滴中的全部溶剂蒸发后留有带电的残渣；( g ) i r i b a r n e t 4 9 5 0 】提出了离子蒸发理论， 认为当小液滴小于1 0 n m 时，溶液中溶解的离子可以从小液滴中直接发射出来。 水的极性强导电性好，非常适合电喷雾，但是同时水的表面张力很大，为了使纯水 产生电喷雾就必须要提供一个很高的喷雾电压。在用负离子模式时，带有极高负电压的 喷针会发射电子，抑制离子的形成，甚至是毁坏离子源内的组件。 d p h s m i t h t 5 1 j 推导出电喷雾电压和电喷雾过程中几个参数的公式，如下： 0 2 厄l n ( 4 0 0 0 d ) 尸 式中，v o n 代表发生电喷雾的电压，r 代表电喷雾针的半径，丫是溶剂的表面张力， d 代表喷雾针尖与反相电极( 质谱毛细管入口) 的距离。 1 2 3 纳流电喷雾电离 自从2 0 世纪8 0 年代中期以来，当人们丌始认识到电喷雾电离的使用潜力后，基于 这种解吸机理的离子源就呈现出截然不同的两个发展方向。其一是改进仪器设计，使仪 器能够以最高的效能接受流量从微升每分到毫升每分的液流；其二是朝着相反的方向发 展，让仪器在低好几个数量级的纳升每分流量范围内，完成样品的喷雾和电离过程1 5 2 1 。 高效液相色谱的研究已经有三十多年的历史，为了得到较好的分析结果，所丌发出 的实际操作参数均被锁定在较高的流量范围内，因为在这个流量范围内，能够保证液相 色谱泵系统获得优异的重现性和精度。在此流量下的工作条件下，常规的样品进样量也 适合于全自动化并保持高精度和重现性的要求。在这个流量范围内，色谱柱的设计、固 定相填料以及装填技术已经被优化而达到最佳的分离效率和分析速度。 纳流高效液相色谱的研究却是2 0 世纪9 0 年代以后才发展出来的最新色谱技术。 w i l m 和m a n n l 5 3 5 7 1 的创新工作，发展了纳升电喷雾的物理基础1 5 8 1 ，并用于鉴定从二维 凝胶电泳分离得到的蛋白质【5 5 5 6 1 。他们不仅在原理上证明了纳流电喷雾的可行，而且发 展了整套的分析方法学，包括必要的软件和样品制备的工具【5 7 1 。 高流量的电喷雾遇到了这样一个问题，仅仅依靠电场实际上不可能维持t a y l o r 锥体 及形成小液滴气溶胶的稳定。为了产生稳定的离子流，必须引入额外的能量，通过喷气 雾化【5 8 l 和加热【5 9 , 6 0 】等形式迫使小液滴的形成，并在强电场环境下发生电离。在设计高流 量的系统时，考虑的重点是恰当的增加这个额外的能量，而大大模糊了t a y l o r 锥体的形 成和稳定等电喷雾过程的重要性。但在纳流电喷雾技术中，影响t a y l o r 稳定形成和稳定 因素得到了极大的关注，产生带电的小液滴不需要额外的能量，因为这时的电场已经足 够强，可以让液体带电并产生气溶胶。 纳流液相色谱技术的关键是降低喷雾液流的流量，使之远低于微升每分。稳定液流 的流量越低，电离效率就会成比例的提高。样品分子进入喷雾器的流量尽管比高流量低 颂i ：论义 芯片i 岛效液相也 譬飞行时问质谱联用系统性能评价及药物小分了分析 很多，但质谱在单位时间内检测到的信号强度却可以保持不变，经常可以看到2 3 倍的 改善f 6 l 】。 纳升电喷雾理论早己证实，液体的流量和从t a y l o r 锥体发射出的小液滴的直径具有 非常紧密的联系。在每分钟几百纳升的液流条件下，形成的小液滴非常小，以至于可以 直接发射离子，并且只需要很短的时问和距离就可以去溶剂化【6 2 j 。对低流速的领悟驱使 设计者研究电极，使其在最低流量条件下不损失离子束的灵敏度和稳定性【6 3 舶】。 决定纳流电极可达到的最低流量的主要因素是喷头在出1 3 处的内径。c o v e y 6 1 7 l 研究 了喷雾针内径和可维持的最低流量之间的关系，得出了各种不同内径的喷头信号强度和 流速的关系。 实际试验过程中，我们需要根据喷头的内径选择一个最佳流量，当流量在最佳范围 内改变时，在离子源内把液相离子转变为气相离子的转化率保持不变。当流量低于最佳 流量时，离子信号强度随着流量降低而降低。色谱芯片的电喷雾喷头的内径是2 5 9 m ， 最佳流量应在2 0 0 n l 每分钟以上。 1 3 本课题研究的目标、内容和意义 1 3 1 本课题研究的目标 本课题旨在以药物小分子为研究对象，建立芯片高效液相色谱飞行时问质谱联用系 统的分析方法，对芯片高效液相色谱飞行时间质谱联用系统的灵敏度、重复性、线性等 进行考察，对系统系能进行评价。 对于复杂生物样品，摸索建立芯片液相色谱质谱的定性方法，并对该方法的色谱分 离进行优化，以满足同后的定性定量分析要求。 1 3 2 本课题研究的内容 1 优化茶碱等药物小分子混样的分离条件，对色谱芯片的柱效、柱选择性进行考察， 并芯片高效液相色谱飞行时问质谱联用系统的灵敏度、重复性进行测定，建立起茶碱等 混样的芯片色谱分析方法。 2 芯片色谱系统性能评价的重复性实验，以咖啡因等药物小分子混样为研究对象， 优化分离方法，对芯片液相色谱系统的灵敏度、重复性、芯片问重现性、线性进行测试， 建立起咖啡因等混样的芯片色谱芯片分析方法。 3 对芯片高效液相色谱飞行时间质谱联用系统和传统高效液相色谱飞行时f b j 质谱 联用系统灵敏度、重复性及线性范围进行对比，突显芯片高效液相色谱的优势。 4 芯片高效液相色谱飞行时间质谱联用系统分析辉瑞成药，优化色谱条件、进样条 件、阀切换条件等，并测定分析成药中各目标组分的灵敏度、线性范围，模拟药物成分 分析其中的药物活性成分。 1 1 1 绪论 颂i j 论义 5 对芯片液相色谱分析复杂生物样品进行初步探索，优化色谱分离条件，利用标样 保留时间验证、一级质谱谱图、二级质谱谱图解析进行定性，为以后的定性定量分析提 供依据。 1 3 3 本课题研究的意义 芯片高效液相色谱飞行时间质谱联用系统性能评价及用于药物小分子的研究是中 科院大连化物所、辉瑞制药公司、安捷伦科技有限公司三方合作项目。芯片高效液相色 谱是一种最新兴的色谱技术，它用色谱芯片代替了传统的色谱柱。本实验通过对芯片高 效液相色谱系统稳定性、重复性、线性等性能的测定，对系统性能成功的进行了评价并 到了良好的结果。 芯片色谱技术已经广泛应用于蛋白质组学的研究，并且取得了显著的成果，但在药 物小分子的应用领域尚无人涉及。本实验成功丌发出了分析药物小分子的方法，并对复 杂生物样品中的药物小分子组分的测定进行了初步探索，为芯片色谱技术的普及和广泛 应用提供了基础和依据。 1 2 硕i ：论义芯j f 岛效液相色鹳飞行时问质辫联用系统性能评价及药物小分了分析 2 芯片高效液相色谱质谱联用系统性能评价 2 1 芯片高效液相色谱质谱联用分析茶碱等药物小分子 2 1 1 引言 纳流芯片高效液相色谱技术在蛋白质组学领域获得了一定的成功，但是在药物小分 子分析领域还无人涉及。我们从安捷伦公司定制了带有5 0 0 n l 富集柱的色谱芯片用来分 析药物小分子。芯片色谱技术作为一种新兴的分析手段还没有被人们了解，系统的稳定 性可靠性等还有待考验，能否应用于药物小分子分析也有待于实验验证。 本部分实验对芯片高效液相色谱电喷雾电离飞行时间质谱系统性能进行初步评价， 评价内容包括色谱芯片的柱效、柱选择性、灵敏度、重复性等。我们希望通过本部分实 验对芯片色谱应用于药物小分子分析的效果得出初步结论。 实验所选的混样包含有五种药物小分子物质，涵盖了很宽的极性范i 习( x l o g p - 5 卅， 对于考察芯片色谱用于药物小分子分析效果是非常合理的。该混样包括以下五种物质： 阿斯巴甜( a s p a r t a m e ) 、茶碱( t h e o p h y l l i n e ) 、肾上腺皮质激素( c o r t i s o n e ) 、利血平 ( r e s e r p i n e ) 、布美他尼( b u m e t a n i d e ) 五种物质，详细分子结构见附件。 茶碱( t h e o p h y u i n e ) ，又名二氧二甲基嘌呤，白色结晶或结晶性粉术，无臭、味苦， 熔点2 7 0 , - - 2 7 4 。常温下溶于水( 1 ：1 2 0 ) 、乙醇( 1 ：1 8 ) 、氯仿0 ：8 6 ) 、氢氧化碱液、氨水、 稀盐酸和稀硝酸中，微溶于乙醚。常常被用来做生化研究和咖啡因等药